Artykuł metodologiczny

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/52141

⸱

17 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz rdzenia kręgowego jest wyniszczającym stanem klinicznym, charakteryzującym się kompleksem dysfunkcji neurologicznych. Zwierzęce modele uszkodzenia rdzenia kręgowego mogą być wykorzystywane zarówno do badania biologicznych reakcji na uraz, jak i do testowania potencjalnych terapii. Stłuczenie lub uraz kompresyjny dostarczony do chirurgicznie odsłoniętego rdzenia kręgowego są najczęściej stosowanymi modelami patologii. W niniejszym raporcie eksperymentalne stłuczenie jest wykonywane przy użyciu urządzenia Infinite Horizon (IH) Impactor, które umożliwia stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego urazu poprzez zdefiniowanie określonych parametrów urazu. Przeszczep komórek macierzystych jest powszechnie uważany za potencjalnie użyteczną strategię leczenia tego wyniszczającego stanu. W licznych badaniach oceniano efekty przeszczepiania różnych komórek macierzystych. Tutaj demonstrujemy dostosowaną metodę uszkodzenia rdzenia kręgowego, a następnie wstrzyknięcie komórek do żyły ogonowej u myszy CD1. Krótko mówiąc, zapewniamy procedury dotyczące: i) znakowania komórek za pomocą niezbędnego znacznika, ii) opieki przedoperacyjnej nad myszami, iii) wykonania stłuczonego uszkodzenia rdzenia kręgowego oraz iv) dożylnego podawania pośmiertnych prekursorów nerwowych. Ten model kontuzji może być wykorzystany do oceny skuteczności i bezpieczeństwa przeszczepu komórek macierzystych w podejściu medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zwierzęce SCI mogą być używane zarówno do badania biologicznych reakcji tkanki na uraz, jak i do testowania potencjalnych terapii. Co więcej, użyteczny zwierzęcy model ludzkiej patologii musi nie tylko odtwarzać niektóre aspekty tego stanu, ale także oferować przewagę nad bezpośrednią obserwacją kliniczną i eksperymentem. Najczęściej stosowane modele uszkodzenia rdzenia kręgowego obejmują stłuczenie lub uraz kompresyjny dostarczony do chirurgicznie odsłoniętego rdzenia kręgowego 8. Opracowanie kontrolowanego urazu, który spowodował spadek masy ciała, stanowi ważny kamień milowy w historii badań nad SCI. Centrum badań nad rdzeniem kręgowym Uniwersytetu Stanowego Ohio podjęło próbę stworzenia urządzenia, które można wykorzystać do wywołania określonego ucisku rdzenia kręgowego o parametrach uderzenia kontrolowanych przez komputer 9. Został on pierwotnie zaprojektowany do użytku ze szczurami; Później został zmodyfikowany, aby zastosować go do myszy 10. Zaletą tego rodzaju podejścia jest to, że biomechanika urazu może być badana bardziej dogłębnie, a parametry urazu mogą być zdefiniowane w bardziej kompletny sposób w celu uzyskania powtarzalnego modelu eksperymentalnego, co pozwala na bardziej precyzyjną ocenę wpływu badanych terapii na proces funkcjonalnej rekonwalescencji.

Wiele badań oceniało efekty przeszczepu różnych komórek macierzystych w modelach SCI 11. Niedawno wyizolowaliśmy dorosłe nerwowe komórki macierzyste ze strefy podkomorowej (SVZ) kilka godzin po śmierci mysiego dawcy 12-13. Procedura ta zapewnia populację nerwowych komórek macierzystych, zwanych post mortem neuronalnymi prekursorami (PM-NPC), które wydają się być korzystne w podejściu medycyny regeneracyjnej do leczenia SCI. W tym artykule pokażemy: i) protokół znakowania komórek za pomocą znacznika życiowego PKH26, ii) zabieg chirurgiczny do wykonania w przypadku urazowego SCI oraz iii) dożylne (iv) podawanie znakowanych komórek. Ponadto w tej pracy wykazaliśmy, że przeszczepione komórki migrują do miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego i różnicują się głównie w komórki dodatnie z białkiem związanym z mikrotubulami (MAP) 2. Ponadto różnicowaniu towarzyszy promowanie stabilnego odzyskiwania funkcji kończyn tylnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Mediolanie i spełniały włoskie wytyczne dotyczące zwierząt laboratoryjnych zgodnie z Dyrektywą Wspólnot Europejskich z listopada 1986 roku (86/609/EWG).

1. Przygotowanie komórek do przeszczepu

UWAGA : Użyj nerwowych komórek macierzystych między 5. a 9. pasażem w hodowli do tych eksperymentów; przetestuj kultury pod kątem zdolności do proliferacji i różnicowania przed wskazaniem do przeszczepu. Określ stopień różnicowania za pomocą immunocytochemii 12.

  1. Zawiesić komórki do stężenia 1 x 106 komórek/150 μl (przeszczep 1 x 106 komórek na mysz). Przygotuj co najmniej 1,2 x 106 komórek na mysz, ponieważ nadmiar komórek jest wymagany do ładowania strzykawki.
  2. Umyj komórki 3 razy za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi 13 w stożkowej fiolce o pojemności 10 ml. Na każdym etapie płukania wytrącić komórki przez odwirowanie (500 x g przez 5 min, RT).
  3. Policz komórki przed ostatnim obrotem.
  4. Odwirować komórki (500 x g przez 5 minut), a następnie odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych komórek, ale pozostawiając nie więcej niż 25 μl supernatantu.
  5. Przygotować zawiesinę 2-komórkową, dodając 1 ml rozcieńczalnika C do osadu komórkowego i zawiesić z delikatnym pipetowaniem.
  6. Bezpośrednio przed barwieniem przygotować 2x roztwór barwnika (4 x 10–6 M) w rozcieńczalniku C, dodając 4 μl roztworu barwnika etanolowego PKH26 do 1 ml rozcieńczalnika C w probówce i dobrze wymieszać do dyspersji.
  7. Szybko dodać 1 ml zawiesiny 2x komórek do 1 ml 2x roztworu barwnika i natychmiast wymieszać próbkę przez pipetowanie (końcowa gęstość komórek wyniesie 1,2 x 10 7 komórek/ml i 2 x 10-6 M PKH26).
  8. Inkubować zawiesinę komórkowo-barwnikową przez 1-5 minut.
  9. Zatrzymaj barwienie, dodając równą objętość (2 ml) 1% roztworu BSA do HBSS i inkubować przez 1 minutę.
  10. Odwirować komórki (500 x g przez 10 min) i ostrożnie usunąć supernatant.
  11. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml HBSS i odwirować (500 x g przez 5 minut).
  12. Przemyj osad komórkowy jeszcze 2 razy 10 ml kompletnego podłoża, aby zapewnić usunięcie niezwiązanego barwnika.
  13. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki w celu oceny odzysku komórek, żywotności komórek i intensywności fluorescencji. Jeśli komórki są potrzebne do przeszczepienia, umyj je i ponownie zawieś w sterylnym roztworze fizjologicznym o stężeniu 3,3 x 105 komórek/50 μl.

2. Przygotowanie do operacji

  1. Wyczyść i wysterylizuj sprzęt chirurgiczny.
  2. Przygotować obszar operacji, przecierając je środkiem aseptycznym . Skonfiguruj urządzenie IH Impactor.
  3. Przygotuj sprzęt anestezjologiczny: pochłaniacz gazów aktywnych z urządzeniem do ważenia filtrów VetScav, komorę indukcyjną o ciągłym przepływie, generator tlenu, miernik niskiego przepływu O2 dla myszy. Wyczyść komorę indukcyjną i maskę używaną podczas zabiegu.
  4. Znieczulić zwierzęta 2,5% (v/v) izofluranem w tlenie (1 l/min) i odczekać 5 minut po indukcji przepływu, aby lek zaczął działać. Sprawdź, czy wąsy drgają lub czy kończyny tylne powoli się wycofują w odpowiedzi na uszczypnięcie podnóżka. Podczas zabiegu należy zmniejszyć stężenie izofluranu do 2,0% (v/v) izofluranu w tlenie (1 l/min).

3. Przygotowanie myszy do operacji i transplantacji

  1. Dorosłe samce myszy CD1 (25–30 g) należy przechowywać przez co najmniej 3 dni przed eksperymentami w standardowych warunkach (22 ± 2 °C, 65% wilgotności i sztucznym świetle między 08:00 a 20:00).
    UWAGA: Cała procedura od przygotowania chirurgicznego do szycia zajmie około 40 min.
    1. Aby zidentyfikować zwierzę, oznacz ogon za pomocą wodoodpornego kolorowego tuszu.
  2. Użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia, aby przyciąć włosy grzbietowe myszy od szyi, mniej więcej na poziomie T2, do okolicy lędźwiowej.
  3. Wysterylizuj przygotowany obszar roztworem jodku i etanolem (70% w sterylnej wodzie).
  4. Leczyć zwierzę podskórnym (podskórnie) wstrzyknięciem 200 μl gentamycyny (1 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej).
  5. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu i wstrzyknij buprenorfinę (podskórnie, 0,03 mg/kg) w celu złagodzenia bólu.

4. Laminektomia

  1. Umieść mysz na podgrzewaczu do szkiełka, aby uniknąć problemu hipotermii podczas operacji. Ułóż zwierzę grzbietową stroną do góry.
  2. Wykonaj pionowe nacięcie skalpelem nad obszarem zainteresowania, od T7 do T12.
  3. Przytrzymaj skórę i powierzchowną poduszeczkę tłuszczową za pomocą standardowych kleszczy (zwykle znajdujących się w przestrzeni między 5. a 6. wyrostkiem grzbietowym klatki piersiowej).
  4. Policz proces pod naczyniem jako T6, a następnie przejdź do T7.
  5. Umieść małe łożysko pod brzuszną stroną myszy, aby zwiększyć krzywiznę kręgosłupa. Unieruchomij rdzeń kręgowy, blokując go kleszczami Graefe.
  6. Przetnij mięśnie przykręgosłupowe obustronnie od poziomu kręgów T7 i T10 za pomocą skalpela, aż grzbietowa powierzchnia blaszki zetknie się z końcówką skalpela.
  7. Użyj skalpela, aby zaznaczyć skrzyżowanie od T7 do T10. Zatrzymaj się w przestrzeni między kolczastymi występami T8 i T9. Przetnij tkanki między T8-T9 i T9-T10 za pomocą mikronożyczek.
    1. Użyj Rongeur, aby usunąć proces T9. Odsłoń połączenie, ostrożnie zeskrobując warstwę mięśniową mikronożyczkami. Kontynuuj, aż kość zostanie odsłonięta.
  8. Użyj kleszczy, aby usunąć mięśnie z blaszki i otworzyć niewielką przestrzeń między kręgami. Delikatnie włóż mikronożyczki pod kość, odetnij blaszkę po obu stronach i usuń tę część kleszczami.
  9. Usuń blaszkę za pomocą kleszczy, aby odsłonić pępowinę. Pamiętaj, aby nie pozostawić żadnych wolnych lub postrzępionych fragmentów kości; usuń je za pomocą Rongeur.
  10. Użyj kleszczyków z małą końcówką, aby usunąć okostną, a także wszelkie fragmenty kości lub mięśnie, które mogą znajdować się w pobliżu nacięcia.
  11. Usuń górną połowę wyrostka grzbietowego T9 i przejdź do protokołu urządzenia IH Impactor.

5. Protokół urządzenia udarowego IH (kontuzja)

  1. Umieść mysz na środku platformy stabilizacyjnej urządzenia IH Impactor.
  2. Zablokuj zwierzę za pomocą kleszczy dwuzębowych połączonych z platformą stabilizacyjną za pomocą dwóch ramion ustalających stawy (lewe ramię dla kręgu piersiowego, prawe ramię dla kręgu szyjnego).
  3. Użyj ramienia rostralnego, aby chwycić boczną krawędź trzonu kręgu rostralnego (T8).
  4. Manipuluj ramieniem ogonowym w ten sam sposób, aby uchwycić trzon kręgu T10.
  5. Umieść platformę stabilizującą w urządzeniu i opuść końcówkę (średnica 0,75 mm) jak najbliżej przewodu, nie dotykając jej.
  6. Podnieś końcówkę o trzy pełne obroty przed zainicjowaniem uderzenia.
  7. Wykonać sttużenie z udarem ustawionym na siłę 60 kdyn z prędkością 100 mm/s.

6. Szwy i pielęgnacja końcowa

  1. Zszyj nacięcie wchłanialną nicią do szwów 4/0. Przykryj odsłonięty rdzeń kręgowy w miejscu usuniętej blaszki; Zszyj tkankę na końcach cięcia za pomocą małej igły. Umieść dwa szwy bezpośrednio nad i pod miejscem odsłonięcia rdzenia kręgowego.
  2. Zamknij skórę za pomocą dwóch lub trzech klipsów Reflex, nie ściskając mięśni znajdujących się pod spodem.
  3. Nawodnij mysz po operacji 2 ml roztworu soli fizjologicznej wstrzykniętego podskórnie w dolną część pleców.
  4. Umieść mysz z powrotem w ogrzanej klatce, aby uniknąć hipotermii podczas rekonwalescencji chirurgicznej. Umieść klatki na poduszkach grzewczych.
  5. Monitoruj myszy w ostrej fazie po urazie, sprawdzając rozmiar pęcherza, szew i wagę zwierzęcia dwa razy dziennie. Delikatnie ściskaj pęcherz (dwa razy dziennie przez 7 dni), aby uniknąć infekcji dróg moczowych (mocz może być mętny, krwawy lub zawierać jakiekolwiek osady).
  6. Myszy należy leczyć raz dziennie wstrzyknięciem roztworu soli fizjologicznej (2 ml przez dwa dni po wstrzyknięciu dochirurgicznym) i antybiotykiem (gentamycyna 0,2 ml; wstrzyknięcie dożylne) przez pięć dni po urazie.
  7. Myszy należy leczyć z powodu analgezji pooperacyjnej buprenorfiną (0,1 mg/kg; dwa razy dziennie) przez 3 dni po urazie.

7. Iniekcja komórek do żyły ogonowej

UWAGA: W następnym kroku pokazano procedurę wstrzykiwania komórek do żyły ogonowej. Komórki mogą być również podawane z przeszczepem śródrdzeniowym za pomocą ramy stereotaktycznej 15-16 lub do cisterna magna 17. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że za pomocą tej metody można przeszczepić inne typy komórek, takie jak mezenchymalne komórki zrębu (np. mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej, komórki płynu owodniowego). Ponadto inne opcje leczenia, takie jak nanocząsteczki, mogą być wstrzykiwane przez żyłę ogonową po urazie rdzenia kręgowego.

  1. Użyj 70% etanolu i PBS do oczyszczenia igły przed użyciem. Z igłą i strzykawką należy obchodzić się wyłącznie w sterylnych rękawiczkach.
  2. Ponownie zawiesić komórki w probówce i załadować 75 μl komórek do strzykawki o pojemności 0,3 ml (igła 29 G i strzykawka 0,33 ml ).
  3. Upewnij się, że w zawiesinie komórek nie ma pęcherzyków powietrza. Trzymać strzykawkę w pozycji poziomej, aby uniknąć sedymentacji komórek.
  4. Umieść mysz pod lampą grzewczą, aby rozszerzyć żyły ogonowe.
  5. Chwyć mysz i delikatnie pociągnij ją do ogranicznika myszy, aby wyświetlić boczną żyłę ogonową jako wąską niebieską linię.
  6. Oczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Po wizualizacji żyły chwyć żyłę ogonową między środkowym palcem a kciukiem lewej ręki.
  7. Przyłóż igłę do powierzchni pod kątem 15° od horyzontu i upewnij się, że skos jest podniesiony.
  8. Wstrzyknąć 50 μl komórek z szybkością 0,33 μl/sek. Po wstrzyknięciu należy opóźnić wycofanie igły o 10 sekund. Powoli wycofać igłę i zwrócić uwagę na możliwy wypływ zawiesiny komórek.
  9. Czyścić strzykawkę jak w kroku 7.1 między ładowaniami.

8. Testy behawioralne i funkcja kończyn tylnych

  1. Umieść mysz na otwartym polu.
  2. Oceń funkcję lokomotoryczną i regenerację kończyn tylnych po stłuczeniu za pomocą testu w otwartym polu zgodnie ze skalą myszy Basso (BMS) 18 .
    UWAGA: Funkcja neurologiczna musi być oceniana okresowo, od 3 dnia po urazie przez 4 tygodnie 18.

9. Perfuzja

  1. Pod koniec okresu doświadczalnego znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (65 mg/kg). Użyj szczypania palców u stóp, aby ocenić poziom znieczulenia i kontynuuj dopiero wtedy, gdy mysz przestanie reagować na szkodliwe bodźce.
  2. Unieruchomić zwierzę w pozycji leżącej na plecach na płaszczyźnie operacyjnej.
  3. Przeciąć powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową. Oddziel przeponę od wątroby.
  4. Użyj nożyczek, aby przeciąć przeponę, aby odsłonić jamę opłucnej.
  5. Przetnij boki klatki piersiowej aż do obojczyków
    6. .
  6. Użyj hemostatów, aby zacisnąć chrząstkę mieczykowatą i umieść hemostat nad głową.
  7. Przytrzymaj dolną trzecią część serca w płaszczyźnie poprzecznej za pomocą kleszczy. Wbić igłę do lewej komory.
  8. Użyj hemostatu, aby zacisnąć serce. Zabezpiecza to igłę i zapobiega wyciekaniu.
  9. Użyj nożyczek, aby wyciąć prawe przedsionek.
  10. Pozwolić, aby PBS przepompował (18 ml/min) przez zwierzę. Ciśnienie to należy utrzymywać przez cały okres infuzji buforu (3-4 min; co odpowiada około 70 ml PBS). Kontynuuj, aż serce będzie czyste.
  11. Przełączyć zawór odcinający, aby umożliwić przepuszczenie utrwalacza (4% paraformaldehydu w wodzie destylowanej, 4% PFA) przez pompę. Pozwól 4% PFA pompować przez zwierzę przez około 8-10 minut (300 ml). Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż osiągniesz maksimum 30 ml/min. Stwardniała wątroba jest najlepszym wskaźnikiem udanej perfuzji.

10. Pobieranie i przetwarzanie tkanek, histologia i immunohistochemia

  1. Wypreparuj rdzeń kręgowy od T5 do L1. Następnie utrwalić tkankę w 6 ml w 4% PFA (O/N w temperaturze 4 °C).
  2. Umieścić tę samą tkankę w roztworze z 30% sacharozą na 72 godziny w temperaturze 4 °C w celu jej krioochrony i zapobieżenia tworzeniu się kryształów podczas zamrażania.
  3. Szybko zamroź przewód za pomocą suchego lodu i przechowuj go w temperaturze -80 °C.
  4. Wyciąć za pomocą kriostatu o grubości 15 μm i zebrać skrawki na szkiełkach szkiełkowych i kontynuować do immunocytochemii.
  5. Przepłukać sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy po 5 minut, RT).
  6. Przepuszczalność każdego szkiełka za pomocą 200 μl 10% NGS i 0,2% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przepłukać sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy po 5 minut, RT).
  8. Zablokuj niespecyficzne miejsca za pomocą 200 μl roztworu blokującego do szkiełka (5% NGS; 0,1% Triton X-100 w PBS) przez 30 minut (RT).
  9. Inkubować każde szkiełko z 200 μl pierwszorzędowych przeciwciał O/N w temperaturze 4 °C (rozcieńczyć przeciwciało w 5% NGS; 0,1% Triton X-100 w PBS).
  10. Przemyć sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy; po 5 minut; RT).
  11. Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  12. Przemyć sekcje 200 μl PBS na każde szkiełko (3 razy; po 5 minut; RT).
  13. Zabarwić jądra 200 μl 4',6-diamidyno-2-fenilindolu (DAPI) (1 μg/ml stężenie końcowe, 10 min w temperaturze pokojowej).
  14. Zamontuj za pomocą odczynnika FluorSave i przeanalizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    UWAGA: W oznaczeniach kontrolnych pierwszorzędowe przeciwciała muszą być pominięte i zastąpione równoważnymi stężeniami niepowiązanych IgG z tej samej podklasy. Zastosowano przeciwciało pierwszorzędowe związane z białkiem 2 związanym z mikrotubulami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Całkowita liczba przeszczepionych komórek wynosi 1 x 106 komórek i została podzielona na trzy kolejne wstrzyknięcia w żyłę ogonową. Podaliśmy 3,3 x 105 komórek w 50 μl roztworu buforu fosforanowego (PBS). Pierwsze wstrzyknięcie wykonano w ciągu 30 minut po urazie, drugie 6 godzin później, a ostatnie 18 godzin po zmianie. Wybór limitu czasowego 18 godzin po SCI na podanie PM-NPC był zdeterminowany optymalną przepuszczalnością bariery krew-mózg w tym czasie 14. Aby ocenić efekt wstrzyknięci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisano metodę uzyskania powtarzalnego modelu urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego przy użyciu Infinite Horizon Impactor o sile 70 kdyne (ciężkiej). Używając paradygmatu większej siły (80 kdyne), możemy spowodować poważniejsze obrażenia, które niestety wiążą się z wyższą śmiertelnością myszy. Aby uniknąć tego problemu, często wybieramy paradygmat umiarkowanej siły (70 kdyne), który wiąże się z powtarzalną zmianą ze stopniowym odzyskiwaniem funkcji i niższą śmiertelnością. Aby doprowadzić do tak stab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ekonomiczne ze strony FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), Fundacji "Neurogel-en-Marche" (Francja), Fondazione "La Colonna".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PKH26GL-1KT Sigma091M0973
Urządzenie impaktorowe o nieskończonym horyzoncie (IH) Precision Systems and Instrumentation, LLCModel 0400 Serial 0171
Gentamycyna 10 mg/mlEurocloneECM0011B1 mg/ml w sterylnym roztworze soli
fizjologicznej Isoflurane-Vet 250 mlMerialB142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Podgrzewacz do slajdów2Biological InstrumentsHB101-sm-402
Skalpel, rozmiar 10Lance Paragon26920
Małe kleszcze Graefe2Instrumenty biologiczne11023-14
Instrumenty medyczne Rongeur0760 07
Mikronożyczki2Instrumenty biologiczne15000-00
Szwy wchłanialne (4/0)Safil QuickC0046203
Hemostat2Instrumenty biologiczne13014-14
Aplikator do spinek do ran Reflex 72Biological Instruments12031-07
Klipsy do ran Reflex 7 mm2Biological Instruments12032-07
NGSEurocloneECS0200D
Triton X 100Merck Millipore1086431000
Białko powlekane antymikrotubulami  (MAP) 2MilliporeAB5622
Alexa Fluor 488InvitrogenA11008
Odczynnik FluorSave Calbiochem345789
Pożywka dla nerwowych komórek macierzystych PożywkaDMEM-F12 (Euroclone) zawierająca 2 mm l-glutaminy (Euroklon), 0,6% glukozy (Sigma-Aldrich), 9,6 g/ml putrescyny (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml progesteronu (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml seleninu sodu (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml insuliny (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml transferyny (Sigma-Aldrich) oraz 2 μ g/ml heparyny (sól sodowa, stopień II; Sigma-Aldrich), bFGF (rekombinant ludzki, 10 ng/ml; Life Technologies) i EGF (rekombinant ludzki, 20 ng/ml; Technologie życiowe) 
DMEM-F12EurocloneASM5002
l-glutaminaEurocloneECB3000D
glukozaSigma-AldrichG8270-100G
putrescynaSigma-AldrichP5780-25G
progesteronSigma-AldrichP6149-1MG
Selenit sodowySigma-AldrichS9133-1MG
transferynaSigma-AldrichT 5391
InsulinaSigma-AldrichI1882
Heparyna sól sodowaSigma-AldrichH0200000
bFGFLife TechnologyPHG0024
h-EGFLife TechnologyPHG6045
Strzykawka 0,33 cc 29 GTerumoMYJECTOR 
buprenorfinaSchering Plough SpATEMGESIC
żel pod oczyBausch & LombLIPOSOWY

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6(2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963(2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuralne kom rki macierzystemodel kontuzjiInfinite Horizon Impactoriniekcja do y y ogonowejznakowanie kom rekznacznik PKH 26po miertne prekursory neuronalnechirurgia myszyfunkcja ko czyn tylnych

Powiązane artykuły