Artykuł metodologiczny

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52142

⸱

17 października 2014

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Nottingham

W tym artykule

Podsumowanie

Kinezyny charakteryzują się zależnym od nukleotydów oddziaływaniem z mikrotubulami: cyklem obrotu ATP sprzężonym z cyklem interakcji mikrotubul. W tym miejscu opisujemy protokoły analizy kinetyki poszczególnych przejść nukleotydowych w cyklu obrotu ATP kinezyny przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i fluorescencji zatrzymanego przepływu.

Streszczenie

Nadrodzina kinezyny białek motorycznych związanych z mikrotubulami ma charakterystyczną domenę motoryczną, która zarówno hydrolizuje ATP, jak i wiąże mikrotubule. Kinezyny wykazują różnice w całej nadrodzinie zarówno w obrocie ATP, jak i w interakcji mikrotubul. Różnice te dostosowują określone kinezyny do różnych funkcji, takich jak transport ładunków, przesuwanie mikrotubul, depolimeryzacja mikrotubul i stabilizacja mikrotubul. Aby zrozumieć mechanizm działania kinezyny, ważne jest zrozumienie, w jaki sposób cykl chemiczny obrotu ATP jest sprzężony z mechanicznym cyklem oddziaływania mikrotubul. Aby przeanalizować cykl obrotu ATP, jednym ze sposobów jest wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów do wizualizacji poszczególnych etapów cyklu. Określenie kinetyki każdej przemiany nukleotydowej w cyklu obrotu ATP pozwala na zidentyfikowanie kroku lub kroków ograniczających szybkość dla całego cyklu. W przypadku kinezyny ważne jest, aby znać krok ograniczający szybkość w przypadku braku mikrotubul, ponieważ krok ten jest na ogół przyspieszany kilka tysięcy razy, gdy kinezyna wchodzi w interakcję z mikrotubulami. Cykl przy braku mikrotubul jest następnie porównywany z cyklem w obecności mikrotubul, aby w pełni zrozumieć cykl obrotu ATP kinezyny. Kinetyka poszczególnych przejść nukleotydowych jest na ogół zbyt szybka, aby można ją było zaobserwować przez ręczne mieszanie reagentów, szczególnie w obecności mikrotubul. Do monitorowania takich przejść można użyć urządzenia do szybkiego mieszania, takiego jak fluorymetr z zatrzymanym przepływem, który pozwala obserwować kinetykę w skalach czasowych wynoszących zaledwie kilka milisekund. W tym miejscu opisujemy protokoły, w których szybkie mieszanie odczynników przez zatrzymany przepływ jest stosowane w połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi nukleotydami w celu przeanalizowania cyklu obrotu ATP kinezyny.

Wprowadzenie

Kinezyny stanowią superrodzinę białek charakteryzujących się silnie konserwowaną domeną motorową1. Domena motorowa kinezyny oddziałuje z mikrotubulami w sposób zależny od nukleotydów. Przedstawiciele rodziny kinezyn wykazują szereg funkcji – od kinezyn translokacyjnych, które transportują ładunek w sposób ukierunkowany wzdłuż mikrotubul, po nietranslokacyjne kinezyny wiążące końce mikrotubul, które regulują dynamikę mikrotubul2,3.

Kinezyny wykorzystują obrót adenozyno-5’-trifosforanu (ATP) do regulacji swojej interakcji z cytoszkieletem mikrotubularnym4-6. Konformacja domeny motorowej kinezyny, a w konsekwencji jej powinowactwo do mikrotubuli, zależy od stanu nukleotydowego: związany może być ATP, ADP, ADP.Pi lub brak nukleotydu (Rysunek 1). Aby zrozumieć molekularny mechanizm działania kinezyny, niezbędne jest poznanie zależności między obrotem ATP a interakcją z mikrotubulami. Dlatego głównym celem w badaniach nad kinezynami jest charakterystyka właściwości funkcjonalnych różnych stanów nukleotydowych oraz kinetyki przejść między nimi, zarówno w obecności, jak i w przypadku braku mikrotubul.

Schemat cyklu reakcji syntezy ATP; przedstawia ścieżki przepływu ADP, ATP oraz stałych szybkości k1 do k4.
Rysunek 1. Najprostszy cykl obrotu ATP dla kinezyny składa się z czterech możliwych stanów: bez nukleotydu (Φ), związanego z ATP, związanego z ADP.Pi oraz związanego z ADP.Każde z czterech przejść charakteryzuje się stałą szybkości reakcji w kierunku przodowym i wstecznym (odpowiednio kx oraz k-x).

Aby zrozumieć, w jaki sposób chemiczny cykl obrotu ATP jest sprzężony z mechanicznym cyklem interakcji z mikrotubulami, należy określić, który etap w cyklu obrotu ATP jest etapem limitującym w przypadku braku mikrotubul, a następnie ustalić, jak cykl ten zmienia się w obecności mikrotubul. Najprostszy cykl obrotu ATP składa się z czterech poszczególnych etapów chemicznych: (1) wiązania ATP z pustym miejscem (Φ oznacza puste miejsce, t.j. kinezynę pozbawioną nukleotydu); (2) rozszczepienia ATP; (3) dysocjacji fosforanu oraz (4) dysocjacji ADP (Rysunek 1). Etap limitujący wyznacza stałą szybkości dla pełnego cyklu obrotu ATP. Dlatego, aby określić, który etap jest limitujący, należy zmierzyć każde z poszczególnych przejść i porównać je ze stałą szybkości pełnego cyklu. Metody pomiaru ogólnej stałej szybkości cyklu obrotu ATP nie zostały tutaj opisane, ale można je znaleźć w odniesieniu 7. W niniejszej pracy opisujemy metody, za pomocą których można wyznaczyć stałe szybkości poszczególnych etapów chemicznych. Dostępnych jest szereg metod pozwalających na badanie poszczególnych przejść w cyklu obrotu białka hydrolizującego nukleotydy. Przedstawione tutaj metody wykorzystują właściwości nukleotydów znakowanych fluoroforem metyloantraniloilo, zazwyczaj określanym jako mant, który wykazuje zmianę intensywności fluorescencji po związaniu z białkiem8. Grupa mant jest stosowana, ponieważ jej niewielki rozmiar sprawia, że w połączeniu z rybozą (Rysunek 2A) zazwyczaj ma ona niewielki lub żaden wpływ na kinetykę wiązania lub hydrolizy nukleotydów9-12. Przedstawiamy tutaj protokoły opisujące zastosowanie nukleotydów znakowanych mant w połączeniu z fluorescencją w technice stopped-flow, co pozwala na obserwację wiązania i dysocjacji nukleotydów w cyklu obrotu ATP kinezyny.

Protokół

1. Określenie zmiany intensywności fluorescencji po związaniu nukleotydu znakowanego mantem.

  1. Dodać 1 μM nukleotyd znakowany mantem do 1 μM kinezyny (stężenia końcowe) w odpowiednim buforze reakcyjnym. Zazwyczaj stosuje się bufor, który korzystnie wpływa na wzrost i stabilność mikrotubul (patrz dyskusja). Powszechnie stosowany bufor zawiera 80mM kwas piperazyno-bis-2-etanosulfonowy (PIPES) pH 6,9, 1mM MgCl2 i 1mM glikol etylenowy-bis-2-aminoeter-kwas tetraoctowy (EGTA).
    Uwaga: Stężenie kinezyny podane we wszystkich protokołach odnosi się do stężenia miejsc wiązania nukleotydów (tj. domen motorycznych). Różne kinezyny występują jako monomery, dimery lub tetramery, a więc mogą zawierać więcej niż jedno miejsce wiązania nukleotydów na cząsteczkę.
  2. Po okresie inkubacji (1-3 min) i przy użyciu standardowego fluorymetru zmierzyć widmo emisyjne dla znakowanego mantem kompleksu nukleotyd-kinezyna. Użyj długości fali wzbudzenia 365 nm i zmierz emitowane światło w zakresie 400-500 nm w krokach co 1 nm.
  3. Sporządzić roztwór nukleotydu znakowanego 1 mM mant w tym samym buforze reakcyjnym, który został użyty w kroku 1.1.
  4. Zmierzyć widmo emisyjne dla próbki zawierającej tylko nukleotyd mant, jak opisano wcześniej (patrz krok 1.2).
  5. Znormalizuj widma do sygnału na długości fali szczytowej intensywności fluorescencji widma nukleotydu mant w roztworze (tj. bez kinezyny), dzieląc przez tę wartość.
  6. Wykreślić znormalizowane widma (np. Rysunek 2B), aby zaobserwować różnice w intensywności fluorescencji między kinezyną związaną z mantATP i/lub mantADP a nukleotydem mant w roztworze.

2. Pomiar stałych współczynnika asocjacji i dysocjacji dla mantATP

  1. Do roztworu do 20 μM kinezyny (patrz dyskusja) w dowolnym odpowiednim buforze wolnym od Mg2+ (np. 80mM PIPES pH6,9, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), dodać 1 mM (stężenie końcowe) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mM (stężenie końcowe) ditiotreitolu (DTT). Uwaga: Dodanie Tween20 do buforu jest zalecane, ponieważ zmniejsza/zapobiega utracie białka kinezyny w kolumnie używanej do wymiany buforu (kroki 2.3 i 3.3)
  2. Inkubować roztwór w temperaturze 25 °C przez 15 minut.
  3. Oddzielić wolny nukleotyd i EDTA od kinezyny za pomocą kolumny filtracyjnej z żelu grawitacyjnego G-25 sephadex zgodnie z instrukcjami producenta (patrz lista materiałów).
    1. Zrównoważyć kolumnę z co najmniej 3 objętościami kolumny odpowiedniego buforu wolnego od Mg2+ (patrz krok 2.1). Załadować roztwór zawierający kinezynę do kolumny. Przygotować probówkę zbiorczą, dodając odpowiednią objętość 100 mM roztworu chlorku magnezu do pustej probówki, tak aby końcowe stężenie chlorku magnezu wynosiło 1 mM po zebraniu roztworu kinezyny. Natychmiastowe dodanie chlorku magnezu pomaga ustabilizować kinezynę wolną od nukleotydów.
    2. Eluuj kinezynę za pomocą odpowiedniego buforu wolnego od Mg2+. Kinezyny są niestabilne, gdy nie zawierają nukleotydów, dlatego ważne jest, aby działać szybko. Przechowuj kinezynę wolną od nukleotydów na lodzie i zużyj w ciągu 1-2 godzin.
  4. W trakcie lub przed przygotowaniem kinezyny wolnej od nukleotydów należy przygotować szereg stężeń mantATP w tym samym buforze reakcyjnym, co końcowy roztwór kinezyny wolnej od nukleotydów. Określić zakres stężeń mantATP wymagany zgodnie z dostępnym stężeniem kinezyny przy typowym szeregu w zakresie od 0,1 do 50 μM (patrz krok 2.5 i omówienie).
  5. Przygotuj serię stężeń kinezyny wolnej od nukleotydów. Dla każdego stężenia mantATP (krok 2.4) należy przygotować stężenie kinezyny wolnej od nukleotydów w taki sposób, aby nukleotyd znakowany mantem miał od 5 do 10 razy więcej molowców w stosunku do miejsc wiązania nukleotydów kinezyny.
  6. Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nm i zbieraj emitowane światło o długości fali >400 nm za pomocą filtra długoprzepustowego.
  7. Zaczynając od najniższego stężenia mantATP, wymieszaj mantATP z odpowiednim stężeniem kinezyny wolnej od nukleotydów w stosunku 1:1 v/v za pomocą fluorymetru z zatrzymanym przepływem (Rysunek 3A i 3B Wstawka). Uwaga: Po zmieszaniu reagenty rozcieńcza się o 50%. Zanotuj stężenie nukleotydów zarówno przed, jak i po zmieszaniu (tj. 3,0/1,5 μM), aby uniknąć nieporozumień.
  8. Dopasuj zmianę intensywności fluorescencji mierzoną przy każdym stężeniu mantATP do funkcji wykładniczej plus linię stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant (tj. Fluorescencja = A0.exp(kobs.t)+(m.t+c), gdzie A0 jest amplitudą, kobs jest stałą szybkości, a t jest czasem, zob. rysunek 3B i dyskusja). Na podstawie tych dopasowań należy wyznaczyć stałą szybkości (kobs) dla każdego stężenia mantATP. Każdy kobs jest splotem stałej szybkości asocjacji i dysocjacji (rysunek 1, k1 i k-1).
  9. Zdekonwolucjonizuj stałe szybkości asocjacji i dysocjacji, wykreślając kobs w stosunku do stężenia mantATP (np. Rysunek 3C). Dopasuj te dane do funkcji liniowej (tj. kobs = k1[mantATP] + k-1), aby uzyskać przecięcie gradientu i osi y. Gradient reprezentuje stałą szybkości dla asocjacji mantATP (rysunek 1, k1) z jednostkami M-1 s-1. Punkt przecięcia reprezentuje stałą szybkości dysocjacji (rysunek 1, k-1) z jednostkami s-1 (patrz dyskusja). Uwaga: Podejście to można również zastosować do wyznaczenia stałych asocjacji ADP i szybkości dysocjacji (rysunek 1, k-4 i k4) przy użyciu mantADP jako nukleotydu.

3. Pomiar stałej szybkości dysocjacji dla mantADP

  1. Do roztworu 2 μM kinezyny w odpowiednim buforze reakcyjnym (np. 80 mM RURY pH 6,9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween20) dodać 50 μM mantADP (stężenie końcowe).
  2. Inkubować w temperaturze 25 oC przez 30 minut.
  3. Usunąć nadmiar mantADP i innych wolnych nukleotydów za pomocą buforu, wymieniając kinezynę do wybranego buforu reakcyjnego za pomocą kolumny sephadexu G-25 (patrz lista materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Domena motoryczna kinezyny powinna być teraz załadowana za pomocą mantADP.
  4. Ustaw długość fali wzbudzenia na fluorymetrze z zatrzymanym przepływem na 365 nm i zbieraj emitowane światło o długości fali >400 nm za pomocą filtra długoprzepustowego.
  5. Wymieszaj kompleks mantADP.kinesin (~ 1 μM) z 50-krotnym lub większym nadmiarem molowym nieznakowanego ATP w stosunku 1: 1 v/v za pomocą fluorymetru z zatrzymanym przepływem (figura 4A i 4B Wkładka).
  6. Dopasuj spadek intensywności fluorescencji obserwowany w czasie do pojedynczej funkcji wykładniczej plus linia stałego ujemnego nachylenia, aby uwzględnić fotobielenie grupy mant (tj. Fluorescencja = A0.exp(kobs.t)+(m.t+c), gdzie A0 to amplituda, kobs to stała szybkość, a t to czas, patrz rysunek 4B i dyskusja). Kobs wyznaczone na podstawie tego dopasowania jest stałą szybkości dysocjacji ADP (Rysunek 1, k4) z jednostkami s-1 (patrz dyskusja).

Wyniki

Wzrost intensywności fluorescencji grupy mant jest zazwyczaj obserwowany podczas wiązania nukleotydu znakowanego mantem z kinezyną. Jednakże wielkość takiej zmiany sygnału zależy od konkretnej analizowanej kinezyny. Dlatego też przed przejściem do testów kinetycznych warto przeprowadzić pomiary równowagowe, aby potwierdzić zarówno obecność, jak i wielkość zmiany intensywności fluorescencji. Reprezentatywne widma fluorescencji dla mantATP i mantADP, zarówno w roztworze, jak i w kompleksie z kinezyną-13, MCAK, przedstawiono na Rysunku 2B. Dane te podkreślają wzrost intensywności fluorescencji wykazany zarówno przez mantATP, jak i mantADP po związaniu z MCAK. Zmiana intensywności fluorescencji po związaniu nukleotydu mant z kinezyną jest wykorzystywana do monitorowania asocjacji i dysocjacji zarówno ATP, jak i ADP (Sekcje 2 i 3). W przypadku MCAK obserwuje się różnicę w intensywności fluorescencji pomiędzy mantATP.kinesin a mantADP.kinesin9.

Rysunek 3A przedstawia reakcję zachodzącą po zmieszaniu mantATP z kinezyną pozbawioną nukleotydów. Reprezentatywne dane ilustrujące wzrost intensywności fluorescencji występujący podczas wiązania mantATP do kinezyny-13, MCAK, pokazano na Rysunku 3B. Dane typu przedstawionego na Rysunku 3B są zbierane dla różnych stężeń mantATP. Wykres stałych szybkości (kobs) wyznaczonych w funkcji stężenia mantATP pokazano na Rysunku 3C. Dopasowanie tych danych do funkcji liniowej (t.j. kobs = k1[mantATP] + k-1) pozwala na dekonwolucję stałych szybkości, które składają się na kobs (Krok 2.8). Umożliwia to zatem wyznaczenie zarówno stałej szybkości asocjacji, jak i dysocjacji dla mantATP (Rysunek 1, odpowiednio k1 i k-1).

Rysunek 4A przedstawia reakcję zachodzącą po zmieszaniu mantADP.kinesyny z nadmiarem nieznakowanego ATP. Dane na Rysunku 4B pokazują spadek intensywności fluorescencji zaobserwowany dla mantADP po dysocjacji z kinesyny-13, MCAK. Poprzez dopasowanie tych danych do funkcji wykładniczej (Krok 3.6) bezpośrednio wyznaczono stałą szybkości dysocjacji mantADP.

Struktura chemiczna ATP i wykres widm fluorescencji pokazujący oddziaływanie ATP z MCAK.
Rycina 2. Nukleotydy znakowane fluoroforem metyloantraniloilowym (mant) są wykorzystywane do wyizolowania poszczególnych etapów cyklu obrotu ATP. (A) Struktura mantATP pokazująca położenie fluoroforu mant sprzężonego z pozycją 2’ lub 3’ rybozy. (B) Znormalizowane widma fluorescencji dla mantATP i mantADP w roztworze (mAXP) oraz mantATP i mantADP w kompleksie z kinezyną MCAK (mATP+MCAK i mADP+MCAK). Widma mantATP zostały znormalizowane do fluorescencji maksymalnej dla mantATP w roztworze, a widma mantADP do fluorescencji max dla mantADP w roztworze. Widma nukleotydów mant zmieszanych z MCAK zarejestrowano 1 min po zmieszaniu. Stężenia odczynników oraz ustawienia fluorymetru są opisane w krokach protokołu 1.1 i 1.2.

Schemat testu fluorescencyjnego; natężenie fluorescencji w funkcji czasu, analiza kinetyczna, badanie wiązania mantATP.
Rysunek 3. Pomiar stałej szybkości asocjacji mantATP. (A) Schemat przedstawiający reakcję zachodzącą po zmieszaniu metodą stopped-flow: mantATP (mATP) wiąże się z kinezyną pozbawioną nukleotydów. Natężenie fluorescencji grupy mant wzrasta po związaniu z białkiem. (B) Zmiana sygnału fluorescencji (czarny), obserwowana po zmieszaniu mantATP (25 M) z MCAK (5 M pozbawionym nukleotydów, ). Dane te dopasowano (czerwona przerywana linia) do funkcji pojedynczej wykładniczej oraz linii o stałym ujemnym nachyleniu, co uwzględnia fotowyblakanie fluoroforu mant (patrz dyskusja). Wstawka: Zawartość strzykawek przed zmieszaniem we fluorymetrze stopped-flow. (C) Stałe szybkości (kobs) wyznaczone dla reakcji mantATP z MCAK pozbawionym nukleotydów, przedstawione w funkcji stężenia mantATP. Wykres ten posiada obszar liniowy, w którym nachylenie stanowi stałą szybkości asocjacji (Rysunek 1, k1) wyrażoną w M-1 s-1, a punkt przecięcia z osią y stanowi stała szybkości dysocjacji (Rysunek 1, k-1) wyrażona w s-1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konwersja ATP do mADP; zanik fluorescencji, aktywność enzymu MCAK, wykres czasu względem intensywności.
Rysunek 4. Pomiar stałej szybkości dysocjacji dla mantADP. (A) Schemat przedstawiający reakcję zachodzącą po zmieszaniu metodą stopped-flow: kinezyna uprzednio obciążona mantADP zostaje rozcieńczona w nadmiarze nieznakowanego ATP. Dysocjujący mantADP jest zastępowany przez nieznakowane ATP, co zapobiega reakcji odwrotnej asocjacji mantADP (patrz sekcja dyskusja). Intensywność fluorescencji grupy mant maleje podczas dysocjacji z białka. (B) Spadek fluorescencji obserwowany podczas dysocjacji mantADP z kinezyny MCAK. Sygnał fluorescencji (czarny) został dopasowany (czerwona przerywana linia) do pojedynczej funkcji wykładniczej oraz linii o stałym ujemnym nachyleniu w celu uwzględnienia fotobielenia grupy mant (patrz sekcja dyskusja). Wyznaczona stała szybkości jest stałą szybkości dysocjacji mantADP (Rysunek 1, k4). Wstawka: Zawartość strzykawek przed zmieszaniem w fluorymetrze stopped-flow. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono protokoły obserwacji i analizy kinetyki przejść między stanami nukleotydowymi dla kinezyny. Protokoły te wykorzystują metodę szybkiego mieszania zatrzymanego przepływu w połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi nukleotydami. Metody tego typu były szeroko stosowane do badania wiązania i dysocjacji nukleotydów dla różnych kinezyn9-11,13-16. Opisane metody nie pozwalają na obserwację uwalniania fosforanów (Rysunek 1, Krok 3). Jednak fluorescencja zatrzymanego przepływu może być wykorzystana do obserwacji tego przejścia za pomocą białka wykrywającego fosforany do sprzężenia produkcji fosforanu ze zmianą intensywności fluorescencji17. W przedstawionych metodach wykorzystuje się nukleotydy znakowane małym fluoroforem methylanthraniloyl (mant), które na ogół wykazują wzrost intensywności fluorescencji po związaniu z białkiem. Co więcej, fluorofor mant, sprzężony z pozycją 2' lub 3' na rybozie, często ma niewielki lub żaden wpływ na wiązanie, dysocjację lub hydrolizę nukleotydu9-12. Nukleotydy znakowane mantem są łatwo dostępne ze źródeł komercyjnych (patrz lista materiałów) i są dostarczane jako mieszaniny koniugatu 2' i 3', ponieważ szybko przywracają równowagę po oczyszczeniu do pojedynczego izomeru8. Nukleotydy znakowane mantem są doskonałymi cząsteczkami reporterowymi, za pomocą których można zaobserwować kinetykę wiązania i dysocjacji nukleotydów.

Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów oznacza, że odczyt z opisanych testów jest zmianą intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. To sprawia, że testy te idealnie nadają się do fluorescencji z zatrzymanym przepływem, która umożliwia szybkie mieszanie odczynników i obserwację w czasie rzeczywistym zmian fluorescencji związanych z następczą reakcją. Połączenie zatrzymanego przepływu jako techniki mieszania i fluorescencji jako metody wykrywania tworzy system, który jest stosunkowo wydajny dla próbki. Na przykład, aby uzyskać dane pokazane na rysunku 3C , potrzeba 0,8 - 1,0 mg oczyszczonej kinezyny-13, MCAK, a aby uzyskać dane pokazane na rysunku 4B , potrzeba ~0,3 mg oczyszczonej kinezyny-13, MCAK. Jedną z wad stosowania mantu jako fluoroforu jest to, że jest on podatny na fotowybielanie. Można to zaobserwować w oderwaniu od kinetyki reakcji kinezyny poprzez zmieszanie roztworu nukleotydu znakowanego mantem z buforem reakcyjnym, przy braku kinezyny, w zatrzymanym przepływie. Obserwuje się powolny spadek intensywności fluorescencji, gdy grupa mant ulega bieleniu. W zakresie skal czasowych stosowanych w opisanych protokołach fotowybielanie grupy mant jest dobrze opisane przez funkcję liniową. Dlatego prostym sposobem skorygowania danych do fotowybielania jest dopasowanie do funkcji wykładniczej z linią bazową opisaną przez funkcję liniową (tj. m.t + c), a nie do bardziej powszechnej płaskiej linii bazowej, opisanej pojedynczym parametrem.

wiązanie mantATP

Podczas pomiaru stałych szybkości asocjacji i dysocjacji mantATP (sekcja 2) ADP, który pozostaje związany z miejscem wiązania nukleotydów kinezyny pod nieobecność mikrotubul, musi zostać usunięty. Pozwala to na zaobserwowanie asocjacji i dysocjacji mantATP (Rysunek 1, krok 1) w izolacji od dysocjacji ADP. Aby to osiągnąć, kinezyna jest inkubowana z co najmniej 50-krotnym nadmiarem EDTA nad miejscami wiązania nukleotydów (krok 2.1). EDTA sekwestruje jony Mg2+ , powodując dysocjację Mg2+ z kieszeni wiążącej nukleotydy, co powoduje uwolnienie nukleotydu11. Dlatego podczas wykonywania kroków 2.1 - 2.3 ważne jest, aby użyć buforu wolnego od Mg2+. Wolne od nukleotydów białko kinezyny jest wymieniane w buforze w celu oddzielenia go zarówno od wolnego nukleotydu, jak i od EDTA. Aby osiągnąć tę separację, wystarczy jednorazowa kolumna filtracyjna z żelem grawitacyjnym, która jest prosta i szybka w użyciu (patrz lista materiałów). Interakcja mantATP z kinezyną wolną od nukleotydów odbywa się w zakresie stężeń mantATP (krok 2.4), aby umożliwić dekonwolucję stałych szybkości asocjacji i dysocjacji (krok 2.8). Teoria stojąca za tego typu eksperymentami jest dobrze opisana w odnośniku 18. Wykonując te eksperymenty, zaczyna się od najniższego stężenia mantATP. Eliminuje to konieczność stosowania etapów mycia między różnymi stężeniami. Prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie czułości fluorymetru z zatrzymanym przepływem wraz ze wzrostem stężenia mantATP. Stężenie mantATP musi być zawsze co najmniej 5-krotnie wyższe od stężenia miejsc wiązania nukleotydów kinezyny, aby utrzymać warunki pseudo pierwszego rzędu. Jednak wraz ze wzrostem stężenia mantATP zmiana sygnału może zostać zalana, ponieważ frakcja nukleotydu, która wiąże się z kinezyną, maleje. W związku z tym stężenie kinezyny jest również zwiększane dla każdego nowego stężenia mantATP tak, że stężenie mantATP nigdy nie jest większe niż 10-krotny molowy nadmiar nad miejscami wiązania nukleotydów (krok 2.6).

mantDysocjacja ADP

Chociaż stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla mantADP można wyznaczyć tą samą metodą, co dla mantATP (sekcja 2). Dysocjację ADP od kinezyny można bezpośrednio zaobserwować poprzez wstępne obciążenie miejsca wiązania nukleotydów mantADP (kroki 3.1-3.3) Kompleks mantADP.kinesin jest następnie mieszany z nadmiarem nieznakowanego ATP (krok 3.5). Nadmiar nieznakowanego ATP zapobiega ponownemu wiązaniu mantADP z kinezyną, a tym samym umożliwia obserwację reakcji dysocjacji (ryc. 1, k4) w izolacji od asocjacji mantADP. W tym teście stężenie nieznakowanego ATP musi wynosić co najmniej 50-krotny molowy nadmiar miejsc wiązania nukleotydów. Teoria stojąca za tym testem jest dobrze opisana w odnośniku 18. Ta metoda bezpośrednia daje dokładniejszą wartość stałej szybkości dysocjacji niż ekstrapolacja na oś y opisaną w kroku 2.8.

Włączenie mikrotubul

Opisane metody można również wykorzystać do określenia kinetyki wiązania i dysocjacji nukleotydów w obecności mikrotubul. Mikrotubule są wprowadzane do strzykawki zawierającej nukleotydy przed zmieszaniem w zatrzymanym przepływie: dolnej strzykawce na rysunku 3B i 4B (wstawki). W tej konfiguracji kinezyna spotka się z nukleotydem w tym samym czasie, w którym spotka się z mikrotubulami. Stosuje się stabilizowane mikrotubule, w których wydłuża się żywotność polimeru tubuliny poprzez zastosowanie stabilizującego związku chemicznego, takiego jak taksol, lub niehydrolizującego analogu GTP, takiego jak trifosforan guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP, patrz wykaz materiałów). Możliwe jest zastosowanie dwóch cykli polimeryzacji tubuliny z GMPCPP do wytworzenia mikrotubul, które mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w ciekłym azocie9,19. Zastosowanie wcześniej przygotowanych mikrotubul znacznie zmniejsza praktyczne trudności w wykonywaniu tych testów. Aby uwzględnić mikrotubule w testach, ważne jest użycie buforu reakcyjnego odpowiedniego dla stabilności mikrotubul. Wybrany bufor jest oparty na PIPES, przy czym najczęściej stosowany bufor zawiera 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl2 i 1 mM EGTA (znany jako BRB80)20,21.

Opisane metody nie są ograniczone do stosowania z kinezynami, ale mogą być dostosowane i zastosowane do dowolnego białka wiążącego nukleotydy. Na przykład, podobne metody zastosowano do cyklu obrotu ATP członków rodziny silników molekularnych miozyny12,22 , a zastosowanie nukleotydów guanozynowych znakowanych mant dodatkowo rozszerza metody tego typu na białka hydrolizujące GTP23,24.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Radę Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC), Towarzystwo Królewskie oraz Uniwersytet w Nottingham.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2'/3'-(N-metyloantraniloilolo)adenozyno-5' trifosforan Jena Biosciences# NU-202mantATP
2'/3'-(N-metyloantraniloilolo)adenozyno-5'-difosforan Jena Biosciences# NU-201mantADP
Mg-ATPRoche# 10519979001Sól disodową ATP wytwarza się do stężenia 100  mM w 100  mM MgCl2. Stężenie należy sprawdzić przez absorpcję w temperaturze 260  nm (e = 15,400  M-1cm-1). Roztwór przechowywany w podwielokrotnościach na poziomie -20  oC.   
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificBP120-5000,5  M roztwór podstawowy w wodzie, pH 8,0. ZAGROŻENIE: proszek szkodliwy w przypadku wdychania.
Ditiotreitol (DTT)MelfordMB10151  M roztwór podstawowy w świeżej wodzie do spożycia tego samego dnia. ZAGROŻENIE: proszek szkodliwy w przypadku wdychania lub kontaktu ze skórą.
Kolumna NAP-5GE Healthcare# 17-0853G-25 kolumna filtracyjna żelowa z żywicy grawitacyjno-przepływowej sephadex
GMPCPPJena Biosciences# NU-405niehydrolizowalny analog fluorymetru
z zatrzymanym przepływem GTP Fotofizyka stosowanaSX20Fluorymetr z dołączoną instalacją hydrauliczną, która umożliwia szybkie mieszanie odczynników w kuwecie obserwacyjnej. Pozwalając tym samym na kinetykę reakcji w skalach czasowych ~0,1 -  100  s, które mają być monitorowane.

Bibliografia

  1. Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. Structures of kinesin motor proteins. Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).
  2. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  3. Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
  4. Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
  5. Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
  6. Kikkawa, M., et al. Switch-based mechanism of kinesin motors. Nature. 411, 439-445 (2001).
  7. Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
  8. Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
  9. Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
  10. Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
  11. Sadhu, A., Taylor, E. W. A kinetic study of the kinesin ATPase. J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).
  12. Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
  13. Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
  14. Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
  15. Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
  16. Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
  17. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
  18. Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
  19. Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  20. Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
  21. Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
  22. Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
  23. Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
  24. Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr t ATP kinezynynukleotydy znakowane fluorescencyjniekinetyka wi zania nukleotyd wkinetyka dysocjacji nukleotyd wfluorymetr z przep ywem zatrzymanympomiar intensywno ci fluorescencjidopasowanie funkcj wyk adniczwyznaczanie sta ej szybko ci

Powiązane artykuły