Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki rakowe, co stanowi potencjalnie istotny biomarker raka. Wykorzystując technologię czujników bezznacznikowych i przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T, demonstrowano wykrywanie wydalanych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta, co umożliwiło opracowanie nowej platformy diagnostycznej raka.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Według American Cancer Society, każdego roku u ponad 200 000 kobiet diagnozuje się inwazyjnego raka piersi, a około 40 000 umrze z powodu tej choroby. Ludzki antygen leukocytarny (HLA) klasy I pobiera próbki peptydów pochodzących z proteasomalnej degradacji białek komórkowych i prezentuje te fragmenty na powierzchni komórki w celu zbadania przez krążące cytotoksyczne limfocyty T (CTL). Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) naśladujących receptor limfocytów T (TCRm), które rozpoznają specyficzne dla raka piersi kompleksy peptydowe / HLA-A*02:01, takie jak te pochodzące z czynnika hamującego migrację makrofagów (MIF19-27) i NY-ESO-1157-165, umożliwiają wykrywanie i niszczenie komórek raka piersi przy braku skutecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej CTL. Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki raka piersi i stanowią potencjalnie istotne biomarkery raka. W niniejszej pracy przedstawiono przełomowy system badań przesiewowych biomarkerów do diagnostyki nowotworów, obejmujący przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T w połączeniu z nowatorskim, bezznacznikowym biosensorem wykorzystującym technologię czujników rezonansu w trybie kierowanym (GMR). Wykazano wykrywanie wydzielonych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta. Wpływ tych prac może zrewolucjonizować medycynę spersonalizowaną poprzez rozwój diagnostyki chorób towarzyszących dla celowanych immunoterapii.
Wprowadzenie
Ludzki antygen leukocytarny klasy I (HLA) pobiera próbki peptydów 8-11 aminokwasów o długości pochodzącej z proteasomalnej degradacji wewnątrzkomórkowego repertuaru białek i prezentuje te peptydy na powierzchni każdej komórki jądrowej1,2. Kompleks HLA jest "naturalnym biomarkerem", wskazującym na zdrowie każdej komórki (ryc. 1) krążących cytotoksycznych limfocytów T (CTL). Rozpoznanie peptydów związanych z chorobą skutkuje eliminacją uszkodzonej komórki przez CTL. W ten sposób adaptacyjna odpowiedź immunologiczna jest wysoce skuteczna w eliminowaniu infekcji wirusowej i guza. Jednak układ odpornościowy wywiera nacisk, który często sprzyja selekcji wirusów lub guzów zdolnych do uniknięcia skutecznej odpowiedzi CTL. Przeciwciała monoklonalne (mAb) naśladujące receptor limfocytów T (TCRm), które rozpoznają specyficzne kompleksy peptyd/HLA-A*02:01, takie jak te pochodzące z białek związanych z rakiem piersi, czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF19-27)3 i NY-ESO-1157-165, umożliwiają wykrywanie i niszczenie komórek raka piersi przy braku skutecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej CTL4,5. Ta reprezentatywna praca koncentruje się na cząsteczce HLA-A*0201, która ulega ekspresji nawet przez 30% populacji. Jednak identyfikacja innych istotnych kompleksów HLA/peptydowych, a następnie produkcja TCRm umożliwia opracowanie celowanych immunoterapii i diagnostyki chorób towarzyszących, rozszerzając użyteczność tej pracy na znacznie szerszą populację.
Część kompleksów peptyd/HLA związanych z powierzchnią komórki jest uwalniana do plazmy. Ze względu na wysoce złożony charakter puli peptydów/HLA, obecne metody eksploracji immunopeptydomu pod kątem biomarkerów związanych z HLA są czasochłonne. Proces ten wymaga oczyszczania powinowactwa rozpuszczalnego HLA z osocza, oddzielenia peptydów związanych z HLA za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) oraz sekwencjonowania peptydów za pomocą tandemowej spektrometrii mas (MS/MS)6,7. Chociaż proces ten jest realną opcją dla odkrywania nowych celów terapeutycznych, jest to kłopotliwy proces jako towarzyszące narzędzie diagnostyczne dla celów związanych z HLA, które znajdują się już w rurociągu szczepionek terapeutycznych lub biofarmaceutycznych8-10. TCRm ukierunkowany na te cele zapewnia narzędzia do szybkiego rozwoju diagnostyki w terapii towarzyszącej, mającej na celu stratyfikację pacjentów do odpowiednich badań klinicznych i zapewnienie bardziej świadomych opcji terapeutycznych.
W tej pracy przedstawiono przełomowy system badań przesiewowych biomarkerów do diagnostyki raka, który wykorzystuje TCRm i bezznacznikowy system testów biologicznych, który monitoruje interakcje biologiczne przy minimalnych etapach przetwarzania. System testów biologicznych bez znaczników opiera się na metodzie, która wykorzystuje efekt rezonansu w trybie prowadzonym (GMR), który występuje w siatkach falowodów dielektrycznych11-14. Gdy światło szerokopasmowe styka się z siatką dyfrakcyjną w płytkach wymaganych dla tego systemu, odbijane są dwie określone długości fal. Interakcja wiązania między unieruchomionym receptorem a jego ligandem jest monitorowana w czasie rzeczywistym poprzez śledzenie przesunięcia długości fali rezonansowej za pomocą analizatora widma12. Oddzielne piki rezonansowe występują dla padających stanów polaryzacji TE (wektor elektryczny normalny do płaszczyzny padania) i TM (wektor magnetyczny normalny do płaszczyzny padania), dostarczając wielu punktów danych, które mogą potencjalnie zwiększyć dokładność wykrywania11,14. Używając wstępnie uczulonych płytek z przeciwciałami w tym bezznacznikowym systemie testowym, czas trwania testu z analizą danych wynosi około 45 minut. Ponadto w formacie 96- lub 384-dołkowym można badać wiele próbek pacjentów, co stanowi wyraźną przewagę nad formatem opartym na HPLC-MS/MS.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Pozbawione elementów identyfikujących próbki tkanek ludzkich i osocza zostały pobrane z Hendrick Medical Center zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board.
1. Dodanie biotynylowanego przeciwciała
UWAGA: Monitorowanie tego kroku jest opcjonalne. Zobacz alternatywny protokół, jeśli nie monitorujesz.
- Zaopatrzyć się w dostępne w handlu płytki powlekane pochodną awidyny (patrz Tabela materiałów i wyposażenia).
- Dodać 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,2 do studzienek.
UWAGA: Wstępną inkubację PBS w temperaturze 28 °C w celu zminimalizowania zmian rezonansowych związanych z temperaturą. - Otwórz oprogramowanie skanera do testów biologicznych i postępuj zgodnie z instrukcjami Kreatora konfiguracji, aby zdefiniować procedurę eksperymentalną, która obejmuje wybór ślepych prób, wzorców i próbek w układzie płytki, ustawienie temperatury (28 °C), liczbę skanów na minutę (1) i długość eksperymentu (150 minut w celu uwzględnienia etapów przygotowawczych).
- Włóż przygotowaną płytkę testową do skanera testów biologicznych bez etykiety i rozpocznij pierwsze skanowanie. Po zakończeniu pierwszego skanowania wybierz "odniesienie do siebie, aby rozpocząć". Punktem odniesienia jest początkowy zestaw skanów zebranych na początku eksperymentu. Jeśli jest to pierwszy odczyt wykonywany na tej konkretnej płytce, pozwól skanerowi pracować w celu zrównoważenia temperatury i wyeliminowania dryftu w linii bazowej. Na rysunku 2 znajduje się zrzut ekranu przedstawiający linię bazową, a następnie dodanie próbki.
- Po ustabilizowaniu się linii bazowej lub co najmniej 5 skanowaniach wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę.
- Usunąć PBS, wrzucając do zlewu i dodać 50 μl biotynylowanego przeciwciała RL21A o stężeniu [10 μg/ml w PBS pH 7,2] do wszystkich dołków kontrolnych na płytce, z wyjątkiem studzienek kontrolnych. Dodać 50 μl PBS do studzienek kontrolnych.
- Włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aż do osiągnięcia saturacji, około 1.5 godziny.
- Wstrzymaj odczyt i wysuń płytę.
- Umyć płytkę 3 razy roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w ilości 200 μl/studzienkę + 0,05% Tween 20 (PBST), a następnie 3 razy przepłukać roztworem 200 μl/studzienkę PBS o pH 7,2. Powtórz z PBS. Postukaj nadmiar PBS z talerza na ręczniki papierowe przed przejściem do następnego kroku.
UWAGA: Ten krok można wykonać na automatycznej myjce do płyt lub umyć płytkę 3 razy za pomocą 200 μl PBST, wlewając płyn do zlewu i zastępując PBST pipetą. - Dodać 50 μl PBS o pH 7,2 do wszystkich aktywnych studzienek.
- Włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aby monitorować rezonans po umyciu.
- Zatrzymaj odczyt i wysuń płytę.
Alternatywny protokół dla kroku 1:
- Dodać 50 μl biotynylowanego przeciwciała RL21A w [10 μg/ml PBS] do wszystkich studzienek.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyć płytkę 3 razy 200 μl/basenik PBST, a następnie 3 razy przepłukać 200 μl/basenik PBS, jak w kroku 1.9.
2. Dodawanie analitu
- Usunąć PBS i dodać 50 μl odpowiedniego buforu do oznaczania na studzienkę. Do tego testu użyto dostępnej na rynku normalnej ludzkiej surowicy rozcieńczonej w stosunku 1:20 w PBS.
- Otwórz oprogramowanie skanera testów biologicznych i postępuj zgodnie z instrukcjami Kreatora konfiguracji, aby zdefiniować procedurę eksperymentalną.
- Włóż płytkę do skanera testów biologicznych i rozpocznij odczyt linii bazowej. Jeśli jest to pierwszy odczyt wykonywany na tej konkretnej płytce, pozwól skanerowi pracować, aby zrównoważyć temperaturę i wyeliminować dryft w linii podstawowej.
- Po ustabilizowaniu się linii bazowej lub co najmniej 5 skanowaniach wstrzymaj odczyt i wysuń płytkę.
- Usunąć bufor testowy z dołków.
- Kontrola kolców z monomerem HLA A*02:01 zawierającym peptydy istotne (FLSL) lub nieistotne (SLLV, YLEV lub KVL) w stężeniach w zakresie [0,625-10 μg/ml] w buforze testowym. Dodać 50 μl wzorców do studzienek kontrolnych płytki
- Dodać 50 μl analitu w buforze do oznaczania do dołków na próbki na płytce. Do tego testu użyto wzbogaconej dostępnej na rynku surowicy ludzkiej.
- Włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aż do osiągnięcia saturacji, około 30-60 minut.
- Wstrzymaj odczyt i wysuń płytę.
- Umyć płytkę 3 razy 200 μl/basenik PBST, a następnie 3 razy przepłukać 200 μl/basenik PBS, jak w kroku 1.9.
- Dodać 50 μl buforu testowego do wszystkich aktywnych studzienek.
- Włóż płytkę z powrotem do skanera testów biologicznych i wznów odczyt, aby monitorować rezonans po umyciu.
- Zatrzymaj odczyt i wysuń płytę.
UWAGA: Bufor testowy może być PBS, pożywką do hodowli tkankowych lub surowicą ludzką rozcieńczoną w stosunku 1:20 w PBS, w zależności od celu testu.
3. Analiza danych
- Analizuj za pomocą oprogramowania skanera testów biologicznych lub eksportuj pliki surowych danych do preferowanego oprogramowania do analizy statystycznej. Oprogramowanie skanera do testów biologicznych automatycznie generuje krzywą wiązania na podstawie układu płytki dostarczonego podczas konfiguracji eksperymentalnej.
UWAGA: Jeśli nie używasz oprogramowania skanera do testów biologicznych do analizy, wykonaj kroki 3.2-3.4. - Odejmij linię bazową i kontrolę ujemną od każdego kolejnego punktu danych.
- Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla studni replik w każdym punkcie czasowym.
- Wygeneruj wykres krzywej wiązania lub wybierz dane punktu końcowego dla wykresów słupkowych.
Wyniki
Reprezentatywny zestaw eksperymentów przeprowadzono z wykorzystaniem dobrze scharakteryzowanego TCRm, RL21A, mysiego przeciwciała monoklonalnego IgG2a, które specyficznie rozpoznaje peptyd (MIF19-27 lub FLSL) w kontekście cząsteczki HLA-A*02:013. Do zademonstrowania opisanego postępowania wykorzystano kognatywny monomer peptyd/HLA, a także nieistotny monomer HLA15. Rysunek 3 przedstawia schemat badania.
Przeciwciało RL21A wykazuje swoistość względem monomeru FLSL/HLA przy niewielkiej reaktywności krzyżowej z innymi kompleksami peptyd/HLA3. Swoistość tę potwierdzono z wykorzystaniem bezetykietowego systemu bioanalizy (Rysunek 4). Czułość bezetykietowego systemu bioanalizy w tym doświadczeniu mieści się w niskim zakresie nanomolarnym, co określono poprzez miareczkowanie przeciwciała RL21A na unieruchomionym monomerze FLSL/HLA (Rysunek 5). Chociaż sygnał tła jest znacznie zwiększony w próbkach surowicy, specyficzna detekcja monomeru FLSL/HLA w domieszkowanej ludzkiej surowicy została osiągnięta na Rysunku 6, a w próbkach tych wyraźnie widoczny jest gradient stężeń. Na koniec wykazano, że nadpłyn z linii komórkowej MDA-MB-231, o której wcześniej wykazano, że prezentuje cząsteczkę FLSL/HLA-A*02:01, zawiera rozpuszczalny monomer FLSL, co zdemonstrowano za pomocą tej bezetykietowej platformy analitycznej (Rysunek 7). Następujące dodanie monomeru FLSL/HLA zwiększa sygnał na RL21A (Rysunek 7). Ze względu na czułość systemu mogą wystąpić różnice między poszczególnymi dołkami, w tym ujemne przesunięcia rezonansu, będące wynikiem wahań temperatury, co widać w odniesieniu do odchyleń standardowych na Rysunku 4 i Rysunku 5. Wariacje te można znacznie zredukować poprzez inkubację wszystkich próbek oraz czytnika płytek bioanalitycznych w temperaturze nieco przekraczającej temperaturę pokojową (tj. 28 °C).
W Rysunku 8, w dużym skrócie, polistyrenowe płytki 96-dołkowe powlekano RL21A w stężeniu [10 µg/ml] przez 2 h w temperaturze pokojowej, przemywano PBST, blokowano 0,5% niskotłustym mlekiem, przemywano PBST, a następnie inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej z szeregiem rozcieńczeń monomeru FLSL HLA w normalnym ludzkim surowicy rozcieńczonej 1:10 w PBS w celu wygenerowania krzywej standardowej lub z osoczem pacjenta rozcieńczonym 1:10 w PBS. Płytkę przemywano PBST, inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałem króliczym anty-ludzkiej β2 mikroglobulinie [1:5 000] w celu wykrycia nienaruszonego HLA, a następnie przemywano PBST. Następnie płytki inkubowano przez 30 min z kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG [1:10 000] i przemywano PBST. Detekcję kolorymetryczną przeprowadzono przy użyciu substratu ABTS (Sól diamoniowa kwasu 2,2’-azinobiz [3-etylo-benzotiazolino-6-sulfonowego]) z 15-minutowym czasem inkubacji i odczytano wyniki przy 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek. FLSL/HLA wykryto w trzech próbkach pacjentów.
Na Ryc. 8B plazmę pacjenta RL.064 rozcieńczono 1:20 w PBS, a następnie naniesiono na płytkę i monitorowano za pomocą detektora bezetykietowego przez 60 min. Osiągnięto specyficzną detekcję kompleksu FLSL/HLA w surowicy pacjenta. Test t Studenta przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki (p <0,05).
Na Rysunku 8C przekroje tkanek barwiono w stężeniu 1 µg/ml przy użyciu przeciwciała mysiego anty-HLA-A2 (BB7.2) jako kontroli pozytywnej, a także RL21A, IgG2b i IgG2a odpowiednio jako kontroli negatywnych. Barwienie wykrywano za pomocą zestawu detekcyjnego anty-mysiego, DAB (diaminobenzydyny) oraz hematoksyliny QS do barwienia jąder komórkowych zgodnie z instrukcją producenta. Barwienie tkanki nowotworowej za pomocą RL21A potwierdza prezentację kompleksów FLSL/HLA.
Rysunek 1: Prezentacja antygenu nowotworowego przez ludzki antygen leukocytarny klasy I. Transformacja nowotworowa jest zaburzeniem wewnątrzkomórkowym. Cząsteczki HLA próbkują białka wewnątrzkomórkowe i ujawniają zmiany związane z nowotworem na powierzchni komórki. CTL oraz TCRm są w stanie rozpoznać komórki nowotworowe dzięki kompleksom HLA-peptyd charakterystycznym dla tych komórek.
Rysunek 2: Zrzut ekranu z procesu akwizycji danych w oprogramowaniu skanera do bioanaliz. Przykład akwizycji danych pokazujący początkowe skanowanie linii bazowej, a następnie dodanie przeciwciała RL21A do płytki powlekanej 10 µg/ml kompleksu FLSL/HLA. Stężenia przeciwciała są wskazane. Każda linia reprezentuje oddzielną studzienkę monitorowaną w czasie.
Rycina 3: Format testu. Ilustracja przeciwciał unieruchomionych na powierzchni kratki dyfrakcyjnej płytki testowej, wychwytujących odpowiednie kompleksy peptyd/HLA w roztworze.
Rysunek 4: Specyficzność RL21A względem kompleksu FLSL/HLA. Demonstracja specyficzności biotynilowanego TCRm RL21A względem odpowiedniego monomeru HLA (FLSL) w porównaniu z nieodpowiednimi monomerami HLA (YLEV, SLLV i KVL). Biotynilowany TCRm RL21A [10 µg/ml] unieruchomiono na powierzchni płytki testowej powlekanej awidyną, a detekcję przeprowadzono przy użyciu nieznakowanych odpowiednich lub nieodpowiednich monomerów HLA [10 µg/ml] w PBS. RL21A wykazał specyficzność wobec kompleksu FLSL/HLA. Przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej (p <0.001).
Rycina 5: Czułość wiązania RL21A do jego cognatywnego kompleksu peptyd/HLA. Ilustracja granicy detekcji i czułości wiązania RL21A do kompleksu FLSL/HLA. Biotynilowany monomer HLA FLSL [10 µg/ml] unieruchomiono na powierzchni płytki analitycznej, a nieznakowane RL21A dodano do płytki w rozcieńczeniach szeregowych w PBS, zgodnie z oznaczeniem. Detekcja w tym układzie mieściła się w niskim zakresie nanomolowym.
Rysunek 6: Detekcja kompleksów HLA w wzbogaconym surowicy ludzkiej. Demonstracja detekcji HLA w surowicy ludzkiej. Biotynilowany TCRm RL21A [10 µg/ml] został unieruchomiony na powierzchni płytki analitycznej powlekanej awidyną. Połączona normalna surowica ludzka wzbogacona odpowiednim (FLSL) lub nieodpowiednim (SLLV) monomerem HLA została rozcieńczona 1:20 w PBS, a następnie naniesiona na płytkę i monitorowana na detektorze bezetykietowym przez 60 min. Osiągnięto specyficzną detekcję kompleksu FLSL/HLA w surowicy ludzkiej. Ogólnie sygnał tła (nieodpowiedni monomer SLLV) jest wyższy dla rozcieńczonych próbek surowicy w porównaniu do oczyszczonych analitów w PBS (patrz Rysunek 4). Przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki (p <0.0001).
Rycina 7: Wykrycie rozpuszczalnych kompleksów HLA w nadsączach z hodowli komórek raka piersi. Wykazano zdolność do wykrywania HLA w nadsączach z komórek raka piersi. Biotynilowany RL21A TCRm, RL9A TCRm (kontrola negatywna) oraz kontrola izotypowa zostały unieruchomione na powierzchni płytki analitycznej. Dodano nadsącze z hodowli komórek MDA-231 wzbogacone [5 μg/ml] oraz niewzbogacone, a wiązanie monitorowano przez 60 min za pomocą detektora bezetykietowego. Próbki wzbogacone monomerami HLA FLSL i SLLV stanowią kontrole pozytywne dla wiązania RL9A i RL21A. Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki (p <0.0001).
Rysunek 8: Specyficzne wykrywanie kompleksów FLSL/HLA w próbkach od pacjentów. (A) Do wykrywania specyficznych kompleksów FLSL/HLA w osoczu pacjentów wykorzystano tradycyjny test ELISA. (B) Biotynilowany TCRm RL21A lub IgG2a [10 µg/ml] unieruchomiono na płytce testowej z awidyną. (C) Tkankę guza piersi pacjenta RL.064 barwiono zgodnie z wcześniejszym opisem3, aby zweryfikować prezentację kompleksów FLSL/HLA w guzie. Klinij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Opisana w niniejszym dokumencie metoda wprowadza system przesiewowych biomarkerów do diagnostyki nowotworów, który umożliwiłby szybkie wykrycie rozpuszczalnych kompleksów peptyd/HLA w próbkach surowicy, osocza, moczu lub śliny pacjenta w wysokoprzepustowym formacie 96- lub 384-dołkowym. Ten system testowy wykorzystujący receptor limfocytów T naśladujący przeciwciała monoklonalne i bezznacznikowy system wykrywania skraca czas analizy do mniej niż 1 godziny w porównaniu z 3,5 godziny w konwencjonalnym teście ELISA. To wysokowydajne podejście umożliwia szybką stratyfikację pacjentów do badań klinicznych nad terapeutycznymi szczepionkami przeciwnowotworowymi lub biofarmaceutykami. Obecne metody wykrywania tych celów chorobowych wymagają oczyszczania z powinowactwem i HPLC-MS/MS indywidualnych próbek pacjentów, co jest uciążliwym i czasochłonnym procesem. Chociaż metoda ta jest podatna na konwencjonalne techniki ELISA, istnieje obawa, że wtórne odczynniki wykrywające, takie jak przeciwciało anty-β2 mikroglobuliny, mogą zmieniać strukturę powstającej cząsteczki HLA i hamować wiązanie z wykrywaniem ograniczającym TCRm. Wykrywanie bez etykiet łagodzi te obawy. Procedura ta może zostać zmodyfikowana do stosowania w innych systemach bezznacznikowych, takich jak system powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Zmniejszyłoby to jednak znacznie możliwości zwiększenia przepustowości w porównaniu z systemem testów biologicznych zastosowanym w tym badaniu.
Protokół ten może być skutecznie modyfikowany w celu wykrywania biomarkerów innych niż HLA w surowicy i osoczu pacjenta, przy przestrzeganiu kilku krytycznych kroków. Monitorowanie początkowego procesu powlekania przeciwciałami jest zalecane w celu optymalizacji powierzchni, ponieważ przesunięcie o < 200 pm prawdopodobnie spowoduje słaby sygnał dla kolejnego etapu wykrywania. Odczyty linii podstawowej i po praniu są przydatne do analizy punktu końcowego, ponieważ obfitość białek w surowicy może maskować wiązanie analitu o niskim stężeniu. Wreszcie, zmiany temperatury próbek mogą powodować wahania od studni do studni. Zaleca się, aby wszystkie próbki były wstępnie inkubowane, a regulator temperatury jednostki do biotestu bez etykiety był ustawiony na 2-3 °C powyżej temperatury pokojowej. W schłodzonych próbkach należy odczekać wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć temperaturę roboczą.
Przyszłe modyfikacje tego protokołu będą obejmowały multipleksowanie TCRm na powierzchni płytki. System testów biologicznych jest obecnie podatny na wykrywanie studni o gęstości co najmniej 8 pleksów. Wprowadzenie 4-8 TCRm do każdej studzienki zmniejsza objętość próbki testowej i umożliwia gromadzenie coraz bardziej złożonych danych na pacjenta. Funkcja ta może dodatkowo informować pacjentów o opcjach terapeutycznych.
Oświadczenia
Autorzy, Debra Wawro Weidanz i Robert Magnusson, są odpowiednio dyrektorem generalnym i dyrektorem ds. technologii w firmie Resonant Sensors Incorporated, która produkuje czytnik płytek do testów biologicznych i płytki testowe używane w tym artykule.
Podziękowania
Te badania były częściowo wspierane przez Development Corporation of Abilene, która zapewnia przestrzeń laboratoryjną i wsparcie płacowe dla Experimmune, Centrum Rozwoju Immunoterapii w Texas Tech University Health Sciences Center i Resonant Sensors Incorporated.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bezznacznikowy system wykrywania testów biologicznych ResoSens | czujniki rezonansowe | ||
| Avidin Sensitized Bionetic 96-dołkowe płytki | Czujniki rezonansowe Wbudowane | ||
| oprogramowanie ResoVu | Czujniki rezonansowe Wbudowane | ||
| RL21A Biotynylowane TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
| RL9A Biotynylowany TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
| FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Pełna sekwencja peptydowa | Experimode | |
| SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Eksperymentalna pełna sekwencja peptydowa: SLLMWITQV | ||
| YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimode | : YLEPGPVTV | |
| KVL HLA-A*02:01 Monomer | Pełna sekwencja peptydowa | Experimodm | |
| Pooled Normal Human Surowica | ThermoFisher | BP2657100 | |
| MDA-MB-231 Supernatant komórkowy | ATCC | HTB-26 | Komórki hodowane w IMDM, 10% FBS i 1% penn/paciorkowiec. Supernatanty zebrane z 3-dniowych zlewających się kultur. |
| Modyfikacja Silbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Life Technologies | 15070-63 | |
| Wodorotlenek sodu | ThermoFisher | 5318-1 | |
| buforowana fosforanami (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami + 0,05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
| 2,2'-Azinobis [kwas 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy]-sól diamonowa (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
| Królik anty-ludzki i beta; 2 mikroglobuliny | Dako | A0072 | |
| IgG kozy sprzężonej z peroksydazą kozią IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
| Nunc mikropłytki Czytnik mikropłytek | ThermoFisher | 439454 | |
| Synergy 2 | Biotek | ||
| Immpress | Vector | MP-7402 | |
| Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
| Hematoksylina QS | Vector | H3403 | |
| IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
| IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
| anty-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
| Prism 5 | Graphpad |
Bibliografia
- Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules. Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).
- Hawkins, O., et al. An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer. J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).
- Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models. J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).
- Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms. J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).
- Bassani-Sternberg, M., et al. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).
- Hickman, H. D., Yewdell, J. W. Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).
- Neethling, F. A., et al. Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies. Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).
- Mittendorf, E. A., et al. Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from. US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).
- Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. Future of cancer vaccines. Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).
- Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel. Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).
- Kaja, S., et al. Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics. J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).
- Magnusson, R., Wang, S. S. New principle for optical filters. Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).
- Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings. Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
Przedruki i uprawnienia
