Nowatorska półautomatyczna hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do użytku z próbkami środowiskowymi z produkcji drobiu została opracowana i wykazała ulepszenia w stosunku do powszechnej metody ekstrakcji mechanicznej i enzymatycznej pod względem ilościowych i jakościowych szacunków całkowitych społeczności bakteryjnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skuteczność protokołów ekstrakcji DNA może być wysoce zależna zarówno od rodzaju badanej próbki, jak i od rodzaju przeprowadzanych dalszych analiz. Biorąc pod uwagę, że stosowanie nowych technik analizy społeczności bakteryjnych (np. mikrobiomika, metagenomika) staje się coraz bardziej powszechne w naukach rolniczych i środowiskowych, a wiele próbek środowiskowych w tych dyscyplinach może być unikalnych pod względem fizjochemicznym i mikrobiologicznym (np. próbki kału i ściółki/ściółki ze spektrum produkcji drobiu), należy starannie wybrać odpowiednie i skuteczne metody ekstrakcji DNA. W związku z tym opracowano nowatorską, półautomatyczną metodę hybrydowej ekstrakcji DNA przeznaczoną specjalnie do stosowania z próbkami z produkcji drobiu w środowisku naturalnym. Metoda ta jest połączeniem dwóch głównych rodzajów ekstrakcji DNA: mechanicznej i enzymatycznej. Dwuetapowy, intensywny etap homogenizacji mechanicznej (przy użyciu ubijania kulek specjalnie opracowany dla próbek środowiskowych) został dodany do początku metody "złotego standardu" enzymatycznej ekstrakcji DNA dla próbek kału w celu usprawnienia usuwania bakterii i DNA z matrycy próbki oraz poprawy regeneracji członków społeczności bakterii Gram-dodatnich. Po zainicjowaniu części ekstrakcji enzymatycznej metody hybrydowej, pozostały proces oczyszczania został zautomatyzowany za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej w celu zwiększenia przepustowości próbki i zmniejszenia błędu przetwarzania próbki. W porównaniu ze ścisłymi mechanicznymi i enzymatycznymi metodami ekstrakcji DNA, ta nowatorska metoda hybrydowa zapewniła najlepszą ogólną łączną wydajność, biorąc pod uwagę ilościowe (przy użyciu 16S rRNA qPCR) i jakościowe (przy użyciu mikrobiomii) szacunki całkowitych społeczności bakteryjnych podczas przetwarzania kału drobiu i próbek ściółki.
Wprowadzenie
Podczas analizy złożonych próbek klinicznych lub środowiskowych (np. kału, gleby), istnieją dwie główne metodologie stosowane do ekstrakcji DNA. Pierwszym z nich jest mechaniczne rozerwanie macierzy za pomocą intensywnego etapu uderzania w koraliki, podczas gdy drugim jest enzymatyczne rozerwanie macierzy w celu chemicznego uwolnienia komórek bakteryjnych i jednoczesnego zahamowania inhibitorów PCR z matrycy. Biorąc pod uwagę różne sposoby, za pomocą których działają te dwa rodzaje metod ekstrakcji, nie jest zaskakujące, że poprzednie badania wykazały, że odpowiednia metoda ekstrakcji DNA jest w dużym stopniu zależna zarówno od próbki, jak i analizy. Porównaw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Mechaniczna homogenizacja próbek środowiskowych produktów drobiarskich
- Przed ekstrakcją należy ustawić łaźnię wodną na 95 °C i odczekać, aż łaźnia wodna osiągnie tę temperaturę.
- Odważyć 0,33 g gleby lub materiału kałowego do probówki Lysing Matrix E o pojemności 2 ml.
- Nie przekraczaj 0,33 g sample w probówce, ponieważ spowoduje to, że następujące roztwory przekroczą pojemność probówki.
- Rozmrozić zamrożone próbki do RT przed ważeniem.
- Aby przeanalizować łącznie 1 g gleby/kału, należy odważyć 3 powtórzone próbki po 0,33 g dla każdej pojedynczej próbki środowiskowej.
- W ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na potrzeby niniejszego badania pobrano świeże próbki odchodów oraz ściółki z komercyjnej kurnika dla brojlerów (~25 000 ptaków) w południowo-wschodniej części USA. Brojlery (Gallus gallus) były krzyżówkami rasy Cobb-500 i w momencie pobierania próbek miały 59 dni. Świeże próbki odchodów i ściółki pobrano z czterech oddzielnych obszarów wewnątrz kurnika (w pobliżu paneli chłodzących, w pobliżu linii poidła/karmideł, pomiędzy liniami poidła/karmideł oraz w pobliżu wentylatorów wyciągowych); próbki z każdego z tyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowana metoda ekstrakcji DNA wpłynęła na ilościowe i jakościowe szacunki całkowitej społeczności bakteryjnej zarówno dla próbek kału, jak i ściółki, potwierdzając zależny od analiz próbek charakter metod ekstrakcji DNA obserwowanych wcześniej1,3,6. Zarówno w przypadku próbek kału, jak i ściółki, kolejność wykonywania metod ekstrakcji DNA była różna dla ilościowych (mechanicznych > hybrydowych > enzymatycznych) i jakościowych (enzymatycznych > hybrydowych > mechanicznych) szacunków całkowitej społeczności .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Latoyi Wiggins i Katelyn Griffin za pomoc w pozyskiwaniu próbek, a także Laurze Lee Rutherford za pomoc w pobieraniu próbek i analizach molekularnych. Chcielibyśmy również podziękować Sarah Owens z Argonne National Lab za przygotowanie i sekwencjonowanie próbek mikrobiomicznych. Badania te były wspierane w równym stopniu przez Służbę Badań Rolniczych, projekty USDA CRIS "Redukcja patogenów i parametry przetwarzania w systemach przetwórstwa drobiu" #6612-41420-017-00 oraz "Podejścia molekularne do charakterystyki patogenów przenoszonych przez żywność u drobiu" #6612-32000-059-00.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Dostępne różne rozmiary i ostatnie 3 cyfry kota. Nie. wskazać rozmiar (-050 = 50 probówek, -200 = 200 probówek, -1000 = 1,000 probówek) |
| Roztwór fosforanu sodu | MPBio | 6570-205 | Można kupić pojedynczo lub również w zestawie FastDNA Spin Kit na kał (Kat. Nr 116570200) |
| PLS Bufor | MPBio | 6570-201 | |
| Bufor ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizator | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml adapter HiPrep (Kat. Nr 116002527) dostępny do podwojenia przepustowości etapu homogenizacji mechanicznej |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Wstępne wyniki pokazują, że QIAcube HT (Kat. Nr 9001793) może być używany w celu zwiększenia przepustowości, ale od tej maszyny wymagane są różne materiały eksploatacyjne i należy wykonać bardziej porównawcze prace. |
| Końcówki filtrujące, 1 000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Końcówki filtrujące, 200 ml (1024) | Qiagen | ||
| QIAcube (10 x 24) | Qiagen | 990394 | Do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dołączonych do zestawu adaptera wirnika dostępna jest alternatywa. Jest to Sarstedt Micro tube 1,5 ml Nasadka zabezpieczająca, Kat. Nr 72.690 |
| Probówki RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternatywa: Mikroprobówka Eppendorf Safe-Lok, Kat. Nr 022363352 |
Bibliografia
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
