Artykuł metodologiczny

Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

DOI:

10.3791/52161

⸱

10 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowatorska półautomatyczna hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do użytku z próbkami środowiskowymi z produkcji drobiu została opracowana i wykazała ulepszenia w stosunku do powszechnej metody ekstrakcji mechanicznej i enzymatycznej pod względem ilościowych i jakościowych szacunków całkowitych społeczności bakteryjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność protokołów ekstrakcji DNA może być wysoce zależna zarówno od rodzaju badanej próbki, jak i od rodzaju przeprowadzanych dalszych analiz. Biorąc pod uwagę, że stosowanie nowych technik analizy społeczności bakteryjnych (np. mikrobiomika, metagenomika) staje się coraz bardziej powszechne w naukach rolniczych i środowiskowych, a wiele próbek środowiskowych w tych dyscyplinach może być unikalnych pod względem fizjochemicznym i mikrobiologicznym (np. próbki kału i ściółki/ściółki ze spektrum produkcji drobiu), należy starannie wybrać odpowiednie i skuteczne metody ekstrakcji DNA. W związku z tym opracowano nowatorską, półautomatyczną metodę hybrydowej ekstrakcji DNA przeznaczoną specjalnie do stosowania z próbkami z produkcji drobiu w środowisku naturalnym. Metoda ta jest połączeniem dwóch głównych rodzajów ekstrakcji DNA: mechanicznej i enzymatycznej. Dwuetapowy, intensywny etap homogenizacji mechanicznej (przy użyciu ubijania kulek specjalnie opracowany dla próbek środowiskowych) został dodany do początku metody "złotego standardu" enzymatycznej ekstrakcji DNA dla próbek kału w celu usprawnienia usuwania bakterii i DNA z matrycy próbki oraz poprawy regeneracji członków społeczności bakterii Gram-dodatnich. Po zainicjowaniu części ekstrakcji enzymatycznej metody hybrydowej, pozostały proces oczyszczania został zautomatyzowany za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej w celu zwiększenia przepustowości próbki i zmniejszenia błędu przetwarzania próbki. W porównaniu ze ścisłymi mechanicznymi i enzymatycznymi metodami ekstrakcji DNA, ta nowatorska metoda hybrydowa zapewniła najlepszą ogólną łączną wydajność, biorąc pod uwagę ilościowe (przy użyciu 16S rRNA qPCR) i jakościowe (przy użyciu mikrobiomii) szacunki całkowitych społeczności bakteryjnych podczas przetwarzania kału drobiu i próbek ściółki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas analizy złożonych próbek klinicznych lub środowiskowych (np. kału, gleby), istnieją dwie główne metodologie stosowane do ekstrakcji DNA. Pierwszym z nich jest mechaniczne rozerwanie macierzy za pomocą intensywnego etapu uderzania w koraliki, podczas gdy drugim jest enzymatyczne rozerwanie macierzy w celu chemicznego uwolnienia komórek bakteryjnych i jednoczesnego zahamowania inhibitorów PCR z matrycy. Biorąc pod uwagę różne sposoby, za pomocą których działają te dwa rodzaje metod ekstrakcji, nie jest zaskakujące, że poprzednie badania wykazały, że odpowiednia metoda ekstrakcji DNA jest w dużym stopniu zależna zarówno od próbki, jak i analizy. Porównawcze badania ekstrakcji DNA wykazały wcześniej, że niektóre metody są bardziej odpowiednie do poprawy jakości i ilości DNA z próbek środowiskowych1-3, podczas gdy inne wykazały poprawę w analizach na poziomie społeczności, takich jak denaturująca gradientowa elektroforeza żelowa (DGGE)4-6, polimorfizm długości końcowych fragmentów restrykcyjnych (T-RFLP)7, zautomatyzowana analiza międzygenowej przekładki rybosomalnej (ARISA)8 i mikromacierze filogenetyczne9. W związku z tym należy stosować lub opracowywać odpowiednie metody ekstrakcji DNA, w zależności od rodzajów próbek środowiskowych i rodzajów analiz przeprowadzanych na tych próbkach, zwłaszcza biorąc pod uwagę ostatnie postępy w analizach społeczności bakteryjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji, w połączeniu z bardziej ilościowymi ocenami społeczności (np. ilościowym PCR (qPCR)), staje się coraz bardziej powszechne w naukach środowiskowych i klinicznych, jednak przeprowadzono bardzo niewiele badań w celu określenia wpływu metod ekstrakcji DNA na te zestawy danych. Większość badań porównawczych ekstrakcji DNA dotyczyła szacunków społeczności mikrobiomicznej z próbek modeli ludzkichlub ludzkich 10,11, a nie próbek zwierząt rolniczych. Nieliczne badania sekwencjonowania nowej generacji skoncentrowane na drobiu dotyczyły specyficznych pytań metagenomicznych12,13 lub mikrobiomicznych14; Nie dyskutowali o wpływie metody ekstrakcji DNA na uzyskane analizy mikrobiomiczne. Biorąc pod uwagę złożony charakter próbek środowiskowych związanych z produkcją drobiu (np. kał, ściółka/ściółka, gleba na pastwiskach), należy starannie dobierać metody ekstrakcji DNA. Wiadomo, że próbki środowiskowe związane z drobiem zawierają dużą liczbę inhibitorów PCR, a do PCR i późniejszej analizy wymagane jest do 500-krotnego rozcieńczenia ekstraktu DNA15-17. Dlatego ważne jest, aby metody ekstrakcji DNA były zoptymalizowane dla tego typu próbek, aby nie tylko fizycznie zakłócić matrycę, ale także aby móc zmniejszyć/wyeliminować dużą liczbę obecnych inhibitorów.

Zestaw QIAamp DNA Stool Mini Kit, metoda ekstrakcji enzymatycznej, została uznana za "złoty standard" podczas ekstrakcji DNA z trudnych próbek jelit / kału1,18,19 i została z powodzeniem zastosowana do próbek środowiskowych drobiu8,14. Enzymatyczne usuwanie inhibitorów PCR poprzez zastosowanie zastrzeżonej matrycy jest jedną z największych zalet stosowania tej metody do tego typu próbek środowiskowych, podobnie jak możliwość znacznego zwiększenia przepustowości (i zmniejszenia błędu przetwarzania próbek) przy użyciu zautomatyzowanych stacji roboczych. Jedną z głównych wad jest brak etapu mechanicznej homogenizacji, który fizycznie oddzielałby komórki bakteryjne od matrycy środowiskowej. Podczas badania próbek jelit i kału pochodzenia niedrobiowego dodanie etapu bicia kulek lub mechanicznego przerywania w protokole ekstrakcji DNA znacznie zwiększyło wydajność ekstrakcji9, wydajność/jakość DNA1,4,5 i znacznie poprawiło dalsze analizy społeczności pod względem bogactwa, różnorodności i zasięgu5,6,11. W badaniach tych porównano nie tylko mechaniczne metody bicia koralików z metodą enzymatyczną "złotego standardu", ale niektóre dodały również etap mechanicznego bicia koralików do protokołu enzymatycznego, aby poprawić wyniki6,9,11.

Zgodnie z wynikami powyższych badań, analizy społeczności bakteryjnej (zarówno jakościowe, jak i ilościowe) mogłyby zostać ulepszone na podstawie próbek środowiskowych związanych z drobiem poprzez dodanie etapu mechanicznej homogenizacji do metody enzymatycznej. Dlatego cel tego badania był dwojaki: (1) opracowanie nowatorskiej techniki ekstrakcji DNA, która wykorzystuje najbardziej pożądane aspekty zarówno metod ekstrakcji mechanicznej (potężny etap homogenizacji), jak i enzymatycznych (usuwanie inhibitorów PCR i automatyzacja) oraz (2) porównanie ilościowych (za pomocą qPCR) i jakościowych (za pomocą mikrobiomii) ocen społeczności bakteryjnej tej nowej metody z reprezentatywnymi metodami mechanicznymi i enzymatycznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mechaniczna homogenizacja próbek środowiskowych produktów drobiarskich

  1. Przed ekstrakcją należy ustawić łaźnię wodną na 95 °C i odczekać, aż łaźnia wodna osiągnie tę temperaturę.
  2. Odważyć 0,33 g gleby lub materiału kałowego do probówki Lysing Matrix E o pojemności 2 ml.
    1. Nie przekraczaj 0,33 g sample w probówce, ponieważ spowoduje to, że następujące roztwory przekroczą pojemność probówki.
    2. Rozmrozić zamrożone próbki do RT przed ważeniem.
    3. Aby przeanalizować łącznie 1 g gleby/kału, należy odważyć 3 powtórzone próbki po 0,33 g dla każdej pojedynczej próbki środowiskowej.
    4. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C w stożkowych probówkach matrycowych przed ekstrakcją.
  3. Dodać 825 μl buforu fosforanu sodu i 275 μl roztworu PLS do probówki z próbką. Mieszać za pomocą wiru przez ~15 sekund, a następnie odwirowywać próbki przy 14 000 x g przez 5 minut.
  4. Zdekantować supernatant i dodać 700 μl buforu ASL. Mieszaj za pomocą wiru przez 5 sekund.
    1. Upewnij się, że w tym momencie w stożkowej rurze jest dostępna przestrzeń nad głową (~10% całkowitej objętości). Jeśli nie ma przestrzeni nad roztworem, probówki będą miały tendencję do przeciekania podczas następnego etapu homogenizacji, co może prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego i/lub utraty próbki.
  5. Umieść próbki w urządzeniu FastPrep 24 i homogenizuj próbki z prędkością 6,0 m/s przez 40 sekund.
  6. Odwirować homogenizowaną próbkę o masie 14 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  7. Aby zmaksymalizować odzysk DNA z próbki, powtórz kroki od 1,4 do 1,6, łącząc supernatanty w tej samej sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml.

2. Hamowanie enzymatyczne inhibitorów z homogenatów próbek

UWAGA: Ten protokół korzysta z QIAamp DNA Stool Mini Kit.

  1. Inkubować supernatant w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby zmaksymalizować odzyskiwanie DNA z pozostałych komórek w supernatancie.
    1. Inkubować w temperaturze 70 °C w przypadku próbek zawierających głównie organizmy Gram-ujemne. Jeżeli jednak obecne są organizmy Gram-dodatnie (co ma miejsce w przypadku próbek kału drobiu), należy je inkubować w temperaturze 95 °C.
    2. Użyj plastikowych klipsów blokujących na probówkach do mikrowirówek, aby upewnić się, że probówki nie "pękną" i nie stracą objętości próbki, ponieważ może wzrosnąć ciśnienie w tych szczelnych probówkach do mikrowirówek.
  2. Otwórz każdą probówkę do mikrowirówki, aby uwolnić ciśnienie, ponownie zakręć probówki do mikrowirówek i mieszaj za pomocą wiru przez 15 sekund.
  3. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 1 minutę, usunąć 1,2 ml supernatantu i umieścić go w nowej, sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
  4. Dodaj 1 tabletkę InhibitEx do każdej próbki i mieszaj za pomocą wiru, aż próbka stanie się jednolicie biała/biaława cieczą.
    1. Unikaj dotykania tabletki InhibitEx podczas umieszczania jej w probówce mikrowirówki zawierającej próbkę. W tym celu należy umieścić blister zawierający tabletkę bezpośrednio nad otwartą probówką do mikrowirówki i delikatnie wypchnąć wypustkę z blistra do probówki do mikrowirówki.
  5. Inkubować próbkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (~ 25 °C) i wirować przy 14 000 x g przez 5 minut.
  6. Przenieś cały płyn do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut.
    1. Unikaj wszelkich pozostałych cząstek stałych, które mogły osadzać się na dnie probówki mikrowirówki na końcu kroku 2.5 podczas przenoszenia cieczy.

3. Automatyczne oczyszczanie DNA za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej QIAcube

UWAGA: Liczba plastikowych materiałów eksploatacyjnych, rozmieszczenie adapterów wirnika próbki w wirówce oraz wymagane objętości/roztworów zależą od liczby próbek, które są w trakcie badania.

  1. Dodaj probówki elucyjne i rurki filtracyjne do odpowiednich szczelin w adapterach wirnika. Dla każdej próbki dodać 400 μl do środkowej szczeliny adaptera wirnika. Umieść adaptery wirnika w wirówce stacji roboczej w odpowiednim układzie, w zależności od liczby oczyszczanych próbek.
    1. Upewnij się, że wszystkie pokrywy probówek do mikrowirówek są odpowiednio zabezpieczone w adapterze wirnika, ponieważ niezastosowanie się do tego może spowodować ścinanie podczas jednego z etapów wirowania w protokole oczyszczania.
  2. Dodaj wymaganą liczbę końcówek filtrujących 1 000 μl i 200 μl do stacji roboczej i napełnij dostarczone butelki buforowe wymaganą objętością.
    UWAGA: wymagane do tego protokołu oczyszczania (AL, AW1, AW2 i AE) są zawarte w zestawie QIAamp DNA Stool Mini Kit. Użytkownik musi dostarczyć 100% etanol, który jest potrzebny do AW oraz jako roztwór stosowany w procesie oczyszczania.
  3. Dodać wymaganą objętość dostarczonego roztworu proteinazy K do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieścić ją w szczelinie A na stacji roboczej. Należy również dodać wymaganą liczbę (równą liczbie oczyszczanych próbek) probówek RB z mikrowirówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem do sekcji wytrząsarki stacji roboczej.
    1. Upewnij się, że pokrywki probówek z próbkami są bezpiecznie umieszczone w odpowiednich szczelinach na stacji roboczej, ponieważ niewykonanie tego spowoduje błąd, gdy urządzenie początkowo skanuje stację roboczą, aby upewnić się, że wszystkie potrzebne tworzywa sztuczne i płyny są dostępne do żądanego przebiegu.
  4. Korzystając z ekranu dotykowego na stacji roboczej, wybierz Protokół wykrywania DNA Stolec – Ludzki Stolec – Patogen Detection Protocol i czytaj kolejne ekrany, aby upewnić się, że stacja robocza została załadowana poprawnie. Po przejściu wszystkich ekranów sprawdzających wybierz pozycję Uruchom, aby uruchomić ten protokół.
    1. W przypadku ekstrakcji DNA z więcej niż 12 próbek należy rozpocząć proces homogenizacji (krok 1) dla następnego zestawu próbek, ponieważ seria 12 próbek zajmuje ~72 minuty na stacji roboczej.
  5. Wyjąć próbki z adapterów wirnika, przykryć je i umieścić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne do dalszych analiz.
    1. W tym momencie należy połączyć 3 powtórzone oczyszczania dla pojedynczej próbki (całkowita analizowana ilość = 1 g) za pomocą systemu opartego na wirowaniu/odparowywaniu. Połączyć kontrpróby i ponownie eluować do końcowej objętości 100 μl buforu Tris-ETDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na potrzeby tego badania, świeże odchody kału i próbki śmieci zostały odzyskane z komercyjnego domu dla brojlerów (~25 000 ptaków) w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych. Brojlery (Gallus gallus) były krzyżówkami Cobb-500 i miały 59 dni w momencie pobierania próbek. Świeże próbki kału i ściółki zostały odzyskane z czterech odrębnych obszarów w domu (w pobliżu podkładki chłodzącej, w pobliżu linii poidełka/karmnika, pomiędzy liniami poidełka/podajnika oraz w pobliżu wentylatorów wyciągowych), a próbki z ka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowana metoda ekstrakcji DNA wpłynęła na ilościowe i jakościowe szacunki całkowitej społeczności bakteryjnej zarówno dla próbek kału, jak i ściółki, potwierdzając zależny od analiz próbek charakter metod ekstrakcji DNA obserwowanych wcześniej1,3,6. Zarówno w przypadku próbek kału, jak i ściółki, kolejność wykonywania metod ekstrakcji DNA była różna dla ilościowych (mechanicznych > hybrydowych > enzymatycznych) i jakościowych (enzymatycznych > hybrydowych > mechanicznych) szacunków całkowitej społeczności ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Latoyi Wiggins i Katelyn Griffin za pomoc w pozyskiwaniu próbek, a także Laurze Lee Rutherford za pomoc w pobieraniu próbek i analizach molekularnych. Chcielibyśmy również podziękować Sarah Owens z Argonne National Lab za przygotowanie i sekwencjonowanie próbek mikrobiomicznych. Badania te były wspierane w równym stopniu przez Służbę Badań Rolniczych, projekty USDA CRIS "Redukcja patogenów i parametry przetwarzania w systemach przetwórstwa drobiu" #6612-41420-017-00 oraz "Podejścia molekularne do charakterystyki patogenów przenoszonych przez żywność u drobiu" #6612-32000-059-00.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Dostępne różne rozmiary i ostatnie 3 cyfry kota. Nie. wskazać rozmiar (-050 = 50 probówek, -200 = 200 probówek, -1000 = 1,000 probówek)
Roztwór fosforanu soduMPBio6570-205Można kupić pojedynczo lub również w zestawie FastDNA Spin Kit na kał (Kat. Nr 116570200)
PLS BuforMPBio6570-201
Bufor ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizatorMPBio11600450048 x 2 ml adapter HiPrep (Kat. Nr 116002527) dostępny do podwojenia przepustowości etapu homogenizacji mechanicznej
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Wstępne wyniki pokazują, że QIAcube HT (Kat. Nr 9001793) może być używany w celu zwiększenia przepustowości, ale od tej maszyny wymagane są różne materiały eksploatacyjne i należy wykonać bardziej porównawcze prace.
Końcówki filtrujące, 1 000 ml (1024)Qiagen990352
Końcówki filtrujące, 200 ml (1024)Qiagen
QIAcube (10 x 24)Qiagen990394Do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dołączonych do zestawu adaptera wirnika dostępna jest alternatywa. Jest to Sarstedt Micro tube 1,5 ml Nasadka zabezpieczająca, Kat. Nr 72.690
Probówki RB (2 ml)Qiagen990381Alternatywa: Mikroprobówka Eppendorf Safe-Lok, Kat. Nr 022363352
Adaptery wirnika 990332

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

Powiązane artykuły