Obecna praca opisuje nowy protokół do wykonywania nieinwazyjnych ultradźwięków o wysokiej częstotliwości i obrazowania fotoakustycznego na mózgu szczura, aby efektywnie wizualizować głębokie obszary podkorowe i ich wzorce naczyniowe poprzez kierowanie sygnałów na otwór czaszki naturalnie występujący na zwierzęcej czaszce.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjne miąższowe, naczyniowe i metaboliczne ultrasonografie wysokiej częstotliwości i fotoakustyczne obrazowanie głębokiego mózgu szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fotoakustyka i ultradźwięki o wysokiej częstotliwości wyróżniają się jako potężne narzędzia do zastosowań neurobiologicznych, umożliwiające obrazowanie w wysokiej rozdzielczości ośrodkowego układu nerwowego małych zwierząt. Jednak neuroobrazowanie przezskórne i przezczaszkowe jest często dotknięte niską czułością, aberracjami obrazu i utratą rozdzielczości przestrzennej, co wymaga usunięcia skóry głowy, a nawet czaszki przed obrazowaniem. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono nowy protokół, który pozwala uzyskać znaczący wgląd w hemodynamikę mózgu za pomocą obrazowania fotoakustycznego i ultradźwięków o wysokiej częstotliwości z nienaruszoną skórą i czaszką zwierzęcia. Zabieg polega na przejściu fal ultradźwiękowych (US) i lasera bezpośrednio przez szczeliny, które są naturalnie obecne na czaszce zwierzęcia. Poprzez zestawienie przetwornika obrazującego dokładnie w korespondencji z tymi wybranymi obszarami, w których czaszka ma zmniejszoną grubość lub jest całkowicie nieobecna, można uzyskać wysokiej jakości głębokie obrazy i zbadać wewnętrzne obszary mózgu, które zwykle są trudne do anatomicznego lub funkcjonalnego opisania bez inwazyjnego podejścia. Dzięki zastosowaniu tej eksperymentalnej procedury można zebrać istotne dane zarówno w modalnościach sonicznych, jak i optoakustycznych, umożliwiając obrazowanie anatomii miąższu i naczyń krwionośnych daleko pod powierzchnią głowy. Głębokie cechy mózgu, takie jak zwoje miąższowe i szczeliny oddzielające płaty, były wyraźnie widoczne. Ponadto zobrazowano konfigurację dużych i małych naczyń krwionośnych na głębokości kilku milimetrów i zebrano precyzyjne informacje o strumieniach krwi, prędkościach strumieni naczyniowych i stanie chemicznym hemoglobiny. Ten repertuar danych może mieć kluczowe znaczenie w kilku konkursach badawczych, począwszy od badań nad chorobami naczyń krwionośnych mózgu, a skończywszy na technikach eksperymentalnych obejmujących ogólnoustrojowe podawanie egzogennych substancji chemicznych lub innych obiektów wyposażonych w właściwości zwiększające kontrast w obrazowaniu. Podsumowując, dzięki przedstawionemu protokołowi, techniki US i PA stają się atrakcyjnym, nieinwazyjnym i konkurencyjnym sposobem obrazowania mózgu korowego i wewnętrznego, zachowując znaczny potencjał w wielu dziedzinach neurologicznych.
Wprowadzenie
Strategie do szczegółowego opisywania cech hemodynamiki mózgu w ośrodkowym układzie nerwowym małych zwierząt są potrzebne do rozwoju neuronauki1-3. Prezentowana technika pokazuje, jak wykonać nieinwazyjne obrazowanie akustyczne i fotoakustyczne mózgu małego zwierzęcia w celu zbadania biologii, układu i funkcji naczyń krwionośnych.
Techniki obrazowania optycznego pozwalają na lokalizację zdarzeń związanych z aktywnością neuronalną2,4-5 i jednocześnie odbierają sygnały generowane przez hemoglobinę zarówno w stanie utlenionym, jak i nieutlenionym6. Jednak ze względu na absorpcję i rozpraszanie fotoniczne, czyste obrazowanie optyczne cierpi z powodu słabej rozdzielczości przestrzennej i ograniczonej głębokości penetracji tkanki7-8. Z drugiej strony, akustyka daje możliwość wykonania głębszego obrazowania z wyższą rozdzielczością przestrzenną w przestrzeni, ale jest to utrudnione przez plamki i ograniczony kontrast9-11. Łącząc cechy fotoniki z ultradźwiękami, technika fotoakustyczna poprawia zarówno możliwości obrazowe, jak i diagnostyczne pojedynczych metod12-16.
Obrazowanie fotoakustyczne mózgu ma potencjał, aby wyjaśnić wiele kwestii w neurobiologii, jednak jarmułka, która naturalnie chroni mózg, znacznie ogranicza zarówno fotoniczną, jak i ultradźwiękową penetrację tkanek17-19. Co więcej, kości sprzyjają rozpraszaniu zarówno światła, jak i dźwięku, co skutkuje utratą czułości i aberracjami obrazu17-18. W związku z tym obrazowanie ultradźwiękowe i fotoakustyczne mózgu można łatwo wykonać u noworodków przed kostnieniem20, ale głęboka anatomia i fizjologia dorosłego mózgu są wyraźnie dostępne dopiero po kraniotomii21,22. Niestety, operacja potrzebna do usunięcia czaszki jest technicznie trudna, a jej skutki mogą być szkodliwe dla niektórych celów eksperymentalnych, co utrudnia monitorowanie postępu choroby nerwowej u tego samego zwierzęcia w czasie. Dlatego wysoce pożądana jest nieinwazyjna metoda obrazowania głębokiej biologii mózgu w małych modelach zwierzęcych. W literaturze metoda recyklera fotonów17 jest opisywana jako sposób na zmniejszenie utraty telefonu i zwiększenie transmisji przez nienaruszoną czaszkę, poprawę stosunku sygnału fotoakustycznego do szumu (SNR) i kontrastu celu.
Prezentowany protokół ma na celu dostarczenie niezawodnej metody do podkorowego obrazowania akustycznego i fotoakustycznego mózgu u gryzoni wykorzystywanych do celów badawczych (szczególnie na szczurach) bez żadnej inwazyjnej operacji. Procedura opiera się na wykorzystaniu przenośnych urządzeń transdukcyjnych do obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości i fotoakustycznego. W przeciwieństwie do technologii obrazowania tomograficznego23, przenośne i kierunkowe przetworniki24 umożliwiają wybór określonych obszarów czaszki o naturalnie zmniejszonej grubości, zwanych szczelinami lub nożycami. Główne szczeliny (otwory) obecne na czaszce kręgowców są niezbędne do zlokalizowania wiązek nerwowych, naczyń lub innych struktur łączących wewnętrzne obwody mózgu z innymi częściami ciała. Główne szczeliny znajdują się w otworach kostnych o różnej wielkości, które można wykorzystać jako specyficzne przejścia dla fal ultradźwiękowych i lasera. Takie ukierunkowane obrazowanie zmniejsza efekty odbicia fal powodowane przez interfejsy kostne i zwiększa czułość poprzez zwiększenie głębokości penetracji obrazowania. W tej perspektywie przetwornik obrazowania może być ustawiony tak, aby był prostopadły do szczelin znajdujących się po skroniowej i potylicznej stronie czaszki (ryc. 1), aby maksymalnie zbiegać wiązki ultradźwięków i fotonicznych w tych obszarach. Ta orientacja zarówno poprawia jakość sygnału, jak i zmusza go do przechodzenia przez cieńszą warstwę kości w stosunku do innych orientacji czaszki. Tym samym przesyłane i odbijane fale ulegają mniejszemu stopniowi rozproszenia, co umożliwia zbieranie intensywnych sygnałów pochodzących z głębszych warstw tkankowych. W przeciwieństwie do wcześniejszych procedur, to eksperymentalne ustawienie wymaga jedynie golenia głów zwierząt, podczas gdy żadna inna operacja nie jest konieczna.
Z proponowanym protokołem, obrazowanie jest wykonywane w stosunkowo wysokiej rozdzielczości przestrzennej, odsłaniając zarówno specyficzne referencyjne struktury anatomiczne, jak i naczynia krwionośne głębiej niż obecne metody stanu techniki, podczas gdy skóra i czaszka zwierzęcia pozostają nienaruszone. Unikalne obrazy koronalne i osiowe można uzyskać, wykorzystując różne metody akwizycji obrazowania ultradźwiękowego (B, Power Doppler, Color Doppler, Pulsed Wave Mode) równolegle do obrazowania fotoakustycznego. Z tych obrazów można wydobyć rozszerzony repertuar parametrów, umożliwiając zobrazowanie anatomii miąższu i naczyń krwionośnych wraz z całym zbiorem cech wpływających na dynamikę krążenia krwi. Protokół ten może być wykorzystany do obrazowania podstawowych cech miąższu korowego w trybie ultrasonografii B o wysokiej częstotliwości, tętnic podstawnych i szyjnych wewnętrznych (odpowiednio BA i ICA) tworzących koło Willisa, tętnicę środkową mózgu (MCA) i inne szczegóły aparatu krążenia. Ponadto kwantyfikacja przepływu krwi, średnie prędkości strumienia, opis ruchu kierunkowego i dane dotyczące nasycenia tlenem mogą być zbierane z kory mózgowej do głębokich obszarów mózgu.
Ta nowa strategia ma ogromny potencjał dla różnorodnych zastosowań i zaspokaja pilną potrzebę niezawodnych procedur do obrazowania głębokich cech mózgu, które są kluczowe w różnych patologiach. Ponadto, ze względu na minimalną inwazyjność, prezentowany protokół może umożliwić przeprowadzenie niezliczonych możliwych badań obrazowych ośrodkowego układu nerwowego, szczególnie tych wymagających długotrwałego monitorowania lub obejmujących delikatne patologiczne modele zwierzęce.
Protokół
Niezbędne eksperymenty do opracowania protokołu zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi przepisami i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet nauk etycznych (Comitato di Bioetica di Ateneo), działający w ramach instytucji Uniwersytetu w Turynie, Turyn, Włochy.
1. Przygotowanie
- znieczulenie
- Umieść zwierzę w odpowiedniej komorze izofluranu w celu znieczulenia.
- Napełnij komorę mieszanką O2 i izofluranu gazu do użytku weterynaryjnego w stężeniu 2,5% w komorze gazowej o pojemności 2 l i poczekaj około 3 minuty, aż szczur zaśnie. Sprawdź efekt znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi.
- Gdy znieczulenie zacznie działać, usuń szczura i zważ go.
- Rozprowadź cienką warstwę rozpuszczalnego w wodzie żelu okulistycznego na oczach zwierzęcia, aby je chronić i utrzymać fizjologiczne nawilżenie oka.
- Połóż szczura na blacie stacji do obrazowania ultrasonograficznego i fotoakustycznego. W celu podtrzymania efektu znieczulenia należy szybko umieścić nos w odpowiedniej masce zapewniającej stały przepływ znieczulenia (izofluran 2%-2,5% w tlenie 1 l/min).
- Golenie zwierzęcia
- Rozprowadź jednolitą warstwę kremu do usuwania owłosienia na powierzchni głowy, zwracając uwagę na pokrycie obszarów otaczających uszy i szyję. Pozostaw krem na kilka minut i delikatnie wyjmij go szpatułką. Delikatnie usuń wszystkie resztki kremu wilgotną gąbką, aby dokładnie oczyścić skórę.
UWAGA: Sierść zwierzęcia zatrzymuje powietrze, które negatywnie wpływa na akwizycję obrazowania na podstawie ultradźwięków, dlatego musi być koniecznie usunięta w jak największym stopniu.
- Rozprowadź jednolitą warstwę kremu do usuwania owłosienia na powierzchni głowy, zwracając uwagę na pokrycie obszarów otaczających uszy i szyję. Pozostaw krem na kilka minut i delikatnie wyjmij go szpatułką. Delikatnie usuń wszystkie resztki kremu wilgotną gąbką, aby dokładnie oczyścić skórę.
- Ułożenie zwierzęcia
- Ułóż zwierzę w pozycji rozłożonego orła. Monitoruj parametry życiowe za pomocą odpowiednich czujników parametrów życiowych na blacie roboczym (jeśli są obecne). Oprzyj łapy na czujnikach po nałożeniu kilku kropli kremu do elektrod do użytku profesjonalnego.
UWAGA: Podczas znieczulenia upewnij się, że parametry życiowe mają następujące wartości: temperatura ciała szczura ≈ 37,5 °C, uderzenia serca na minutę (BPM) wahają się między 250 a 350, a częstość oddechów mieści się w zakresie 40-80 oddechów na minutę. - Na koniec zapnij kończyny hipoalergicznym plastrem ze sztucznego jedwabiu. W razie potrzeby ponownie rozprowadź cienką warstwę rozpuszczalnego w wodzie żelu okulistycznego, aby chronić oczy zwierzęcia.
- Ułóż zwierzę w pozycji rozłożonego orła. Monitoruj parametry życiowe za pomocą odpowiednich czujników parametrów życiowych na blacie roboczym (jeśli są obecne). Oprzyj łapy na czujnikach po nałożeniu kilku kropli kremu do elektrod do użytku profesjonalnego.
2. Akwizycja obrazu z czasowego punktu widzenia
- Ułożenie zwierzęcia
- Trzymając zwierzę w pozycji leżącej, obrócić jego ciało lekko na bok, pod kątem nachylenia około 45° w stosunku do strzałkowej osi ciała. Użyj małych rolek gazy bawełnianej jako stojaków, aby prawidłowo ułożyć utylizację (Rysunek 2a).
- Podnieś głowę zwierzęcia i obróć ją lekko w jedną stronę (Rysunek 2a). Użyj bawełnianej rolki jako podstawki, utrzymując pysk dobrze włożony do maski anestezjologicznej.
- Nachylić blat pod kątem około 30° w stosunku do płaszczyzny poziomej.
- Obrócić przetwornik obrazowania pod kątem około 30° w stosunku do płaszczyzny pionowej.
- Akwizycja ultradźwiękowych i fotoakustycznych obrazów anatomicznych i naczyniowych
- Włącz skanowanie obrazowe, przejdź do trybu akwizycji obrazu B i prawidłowo ustaw wszystkie parametry akwizycji obrazu, aby spełnić możliwe wymagania eksperymentu (rysunek 3a).
UWAGA: Ustaw częstotliwość środka nadawania tak nisko, jak to możliwe (16 MHz, rysunek 3b), aby uzyskać maksymalną możliwą głębokość penetracji dla przetwornika. - Na głowę zwierzęcia nałożyć spójną warstwę (o grubości około 1 cm) hipoalergicznego, rozpuszczalnego w wodzie żelu do transmisji ultradźwięków (ryc. 2b). Przykryj głowicę przetwornika cienką warstwą tego samego żelu i umieść ją w kontakcie z warstwą na szczurze. Użyj ciepłego żelu, aby zminimalizować miejscową hipotermię.
- Rozpocznij akwizycję obrazu w trybie B i dostosuj położenie przetwornika w czasie rzeczywistym, identyfikując odniesienia anatomiczne i wyśrodkowując obszar zainteresowania do środkowego punktu monitora. Upewnij się, że eliminujesz pęcherzyki powietrza na dowolnym poziomie uwięzione w warstwie żelu, ponieważ negatywnie wpływają one na akwizycję.
- Umieść przetwornik tak, aby wyrównał go z wirtualną osią łączącą ucho z okiem (rysunek 4a), aby uzyskać optymalną ogniskową wiązki. Uzyskaj różne widoki wewnętrznej objętości mózgu, obracając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (ryc. 4b i c).
- Na koniec zamocuj przetwornik na mechanicznym stojaku, aby stabilnie zabezpieczyć pozycję i dostroić orientację w precyzyjny sposób.
- Upewnij się, że obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania znajduje się na głębokości 10 mm w stosunku do źródła przetwornika US-LASER, aby otrzymać optymalny sygnał odpowiedzi fotoakustycznej (rysunek 5). Następnie umieść wskaźnik ogniskowania fal amerykańskich dokładnie w środku analizowanego obszaru.
UWAGA: Podczas badania obszarów zainteresowania należy unikać aktywacji opcji bramki oddechowej, aby przyspieszyć procedurę pozycjonowania. - Wejdź w tryb kolorowego Dopplera, aby uwidocznić wewnętrzne naczynia krwionośne mózgu w bardzo czuły sposób.
- Po ustawieniu pozycji w odpowiedni sposób, aby uwidocznić żądane obszary, aktywuj opcję bramki oddechowej, aby uniknąć niepożądanych efektów związanych z ruchem (Rysunek 6a).
- Wybierz żądany parametr akwizycji ustawiony w trybie kolorowego Dopplera (rysunek 6b) i uzyskaj obrazy w tej modalności, aby rozróżnić prędkości i kierunki przepływu krwi, aż do kilku milimetrów głębokości penetracji.
- Wejdź w tryb Dopplera fali pulsacyjnej i uzyskaj obrazy, aby wykryć pulsację krwi w tętnicach i rozróżnić tętnice i żyły.
- Wejdź w tryb Power Doppler i ustaw parametry akwizycji (rysunek 7), aby przeprowadzić kwantyfikację sygnału na podstawie liczby zdarzeń rozpraszania spowodowanych ruchem strumienia, a tym samym ocenić różnice w natężeniach przepływu.
- Wejdź w tryb fotoakustyczny i odpowiednio doprecyzuj parametry akwizycji (Rysunek 8a), aby zebrać dane o całkowitej zawartości hemoglobiny we krwi lub stopniu natlenienia w danym obszarze. Wytwarzając wzbudzenie laserowe w całym spektrum długości fali (od 680 nm do 970 nm, ryc. 8b), można określić ilościowo absorpcję całkowitej hemoglobiny obecnej w różnych stanach chemicznych wewnątrz tkanki. Przeprowadzając zbieranie sygnałów na pojedynczych określonych długościach fal (rysunek 8c), możliwe jest wyizolowanie różnych wkładów sygnału spowodowanych absorpcją czystych związków tlenowych i deoksy .
- Włącz skanowanie obrazowe, przejdź do trybu akwizycji obrazu B i prawidłowo ustaw wszystkie parametry akwizycji obrazu, aby spełnić możliwe wymagania eksperymentu (rysunek 3a).
3. Obrazowanie z punktu widzenia potylicznego
- Ułożenie zwierzęcia
- Trzymając zwierzę w pozycji leżącej, opuść głowę zwierzęcia i użyj małych rolek bawełnianej gazy jako bocznych stojaków, aby prawidłowo ułożyć utylizację.
- Obrócić przetwornik obrazowania równolegle do płaszczyzny poprzecznej głowy zwierzęcia (rysunek 9).
UWAGA: W ten sposób nabycie będzie wyśrodkowane przez otwór potyliczny u podstawy czaszki. Zmieniając kąt nachylenia orientacji sondy (rysunek 9), możliwe będzie uzyskanie obrazów naczyń wewnętrznych w różnych widokach w zależności od nachylenia ustawienia.
- Akwizycja ultradźwiękowych i fotoakustycznych obrazów anatomicznych i naczyniowych
- Wprowadź akwizycję obrazu w trybie B, ustaw wszystkie parametry akwizycji obrazu zgodnie z wcześniejszymi raportami (rysunek 3) i rozprowadź niezbędne warstwy żelu ultradźwiękowego na sondzie i na karku zwierzęcia.
- Ustaw przetwornik tak, aby pozostawał prawie poziomy, aby był skierowany wzdłuż anatomicznej osi od tyłu do przodu ciała. Skieruj go w stronę przedniej strony pyska i przechyl go lekko do przodu.
- Rozpocznij akwizycję obrazu w trybie B i trybie kolorowego Dopplera (rysunki 3 i 6). Dokładnie wyreguluj położenie przetwornika i usuń pęcherzyki powietrza z żelkotu, jak opisano wcześniej. Jeśli to możliwe, zamocuj przetwornik na stabilnym stojaku, aby precyzyjnie kontrolować orientację i wybrać najlepszy kąt nachylenia, aby uzyskać obrazy pożądanych obszarów anatomicznych.
- Wizualizacja wewnętrznych naczyń krwionośnych mózgu w trybie Power Doppler, poprzez prawidłowe ustawienie parametrów akwizycji (ryc. 7).
- Lokalizuj intensywnie pulsujące tętnice w trybie Dopplera fali pulsacyjnej. Odróżnij je od żył, które odwrotnie charakteryzują się niskim poziomem pulsacji przepływu krwi.
- Zbieraj dane o prędkościach i kierunkach przepływu krwi w trybie kolorowego Dopplera, odpowiednio dostosowując parametry akwizycji (ryc. 6).
- Kompletny zestaw danych do głębokiej hemodynamicznej charakterystyki mózgu, poprzez dodanie informacji chemicznych o krwi uzyskanych w wyniku akwizycji fotoakustycznej (ryc. 8). Należy to zrobić, oceniając w szczególności ilość parametrów hematycznych, takich jak procent nasyceniaO2 i całkowita zawartość hemoglobiny (HbT), które są zwykle mierzone poprzez ustawienie długości fali wzbudzenia laserowego na 750 i 850 nm (rysunek 8c).
4. Zakończenie pozyskiwania i usuwania zwierząt
UWAGA: Właściwie rozważ cały czas poświęcony na proces akwizycji obrazu (od kroku 1 do kroku 3), który podlega głównym ograniczeniom związanym z dawką znieczulenia zastosowaną u zwierzęcia.
- Zapisz wszystkie pozyskane dane, wyłącz impulsy laserowe, wychodząc z trybu akwizycji fotoakustycznej i zdystansuj przetwornik.
- Utrzymując zwierzę pod wpływem znieczulenia, zacznij je oczyszczać, delikatnie usuwając żel ochronny z oczu wilgotnym wacikiem. Użyj szpatułki i kilku ręczników papierowych, aby całkowicie usunąć żel ultradźwiękowy z głowy i pyska, a następnie wyczyść je wilgotną gąbką. Uważaj, aby nie uszkodzić delikatnej ogolonej skóry.
- Wyjmij plaster samoprzylepny służący do mocowania kończyn i odłącz je od czujników monitorujących parametry fizjologiczne. Szybko przenieś zwierzę z blatu akwizycji do innej klatki.
- Trzymaj zwierzę w małej klatce w celu odzyskania zdrowia po znieczuleniu. Należy zapewnić, aby zwierzęta nie dzieliły klatki na tym etapie, aby zapobiec agresji
- Umieść klatkę rekonwalescencji pod światłem podczerwonym, aby utrzymać zwierzę w cieple. Poczekaj, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek. Sprawdź ogólny stan zdrowia zwierzęcia przed przeniesieniem go do pomieszczenia hodowlanego.
Wyniki
Metoda ta umożliwia obrazowanie zarówno specyficznych struktur referencyjnych anatomicznych, jak i naczyń krwionośnych przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości przestrzennej, na głębokości większej niż w przypadku obecnej techniki przy nienaruszonych skórze i czaszce zwierzęcia. W naszych warunkach eksperymentalnych głębokość sygnału PA wynosi 4,5 mm, a rozdzielczość osiowa 75 μm przy FOV 23 x 15,5 cm. Eksperymenty z wykorzystaniem modalności Tomografii Fotoakustycznej19 wykazały wartość rozdzielczości <1 mm. Zakres wartości SNR wynosi od 21,6 dB do 23,8 dB (uzyskany z 5 różnych punktów wybranych losowo w tkance mózgowej i w tle). Poprzez przyłożenie przetwornika do bocznej strony czaszki, obrazy mózgu mogą być pozyskiwane jako przekroje poprzeczne lub nawet czołowe, w zależności od wybranego kąta ustawienia przetwornika, co skutkuje bocznym punktem widzenia obrazowania (Rysunek 4). Naskórek, kości czaszki i materiał miąższowy są dobrze widoczne w ultrasonograficznym trybie B (B-Mode), ponieważ znacznie różnią się pod względem impedancji akustycznej (Rysunek 10). Nawet jeśli ich konfiguracja zależy od wybranego punktu widzenia, możliwe jest rozpoznanie niektórych anatomicznych punktów referencyjnych w miąższu, takich jak szczeliny oddzielające wewnętrzną część mózgu od kory oraz charakterystycznie ukształtowany trakt wzrokowy (Rysunek 10). Dodatkowo, w modalnościach obrazowania ultrasonograficznego i fotoakustycznego widoczna jest duża liczba naczyń. Można łatwo rozpoznać charakterystyczne przecięcia tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) z innymi głównymi dużymi naczyniami biegnącymi wzdłuż zewnętrznej bocznej powierzchni mózgowia zwierzęcia. Duże drogi naczyniowe, takie jak ICA, zapewniają masywny dopływ krwi, aby zaspokoić stałe zapotrzebowanie neuronów na energię i tlen. ICA, wywodząca się z tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), biegnie po bocznej stronie głowy na głębokości kilku milimetrów, mija wszystkie miejsca swoich rozgałęzień i ostatecznie dociera do przedniej części głowy. Ten główny strumień krwi rozprzestrzenia się wśród naczyń średniej wielkości, a następnie jest kierowany do coraz mniejszych tętniczek, aby w końcu odżywić neurony. Z punktu widzenia skroniowego możliwe jest prześledzenie przebiegu wewnętrznej tętnicy mózgowej, która rozgałęzia się na naczynia skierowane w stronę przednią i boczną mózgu. Obrazy czołowe i poprzeczne można uzyskać przy różnym nachyleniu przetwornika względem kierunku wirtualnej osi łączącej oko i małżowinę uszną zwierzęcia (Rysunek 4). Poprzez przechylanie przetwornika zgodnie z projekcjami opisanymi na Rysunku 4, możliwe jest uzyskanie wyraźnych obrazów tętnicy mózgu środkowej (MCA), która odgałęzia się od ICA i dalej dzieli na dwie lub więcej gałęzi, które ostatecznie okalają płaty kory (Rysunki 11 i 12). Najlepsze wizualizacje uzyskano dla MCA przy nachyleniu sondy pokazanym na Rysunku 4c oraz dla ICA, jak pokazano na Rysunku 4b.
Obrazowanie akustyczne oparte na efekcie Dopplera ujawnia małe odgałęzienia, natomiast informacje o kierunku przepływu krwi są dostępne dzięki akwizycji z użyciem kolorowego Dopplera (Rycina 13). Cecha tętnicy MCA zostaje potwierdzona za pomocą techniki ultradźwiękowej z falą impulsową (Ryciny 14 i 15). Sygnał fotoakustyczny hemoglobiny zawartej w krążących erytrocytach może zostać wykryty i przeanalizowany w celu zebrania danych o jej molekularnym stanie utlenienia oraz obliczenia wysycenia krwi tlenem (Ryciny 16 i 17). Zawartość tlenu w krwi może zostać skorelowana z danymi sonicznymi w celu potwierdzenia rozróżnienia krwi tętniczej od krwi żylnej.
Kierując przetwornikiem w stronę otworu wielkiego, obraz jest rzutowany na płaszczyznę osiową głowy (Rysunek 9), a płaszczyznę obrazowania tę można ustawić pod różnymi kątami nachylenia. W tym przypadku obrazowanie mózgu z perspektywy tylnej charakteryzuje się dużą głębokością penetracji ze względu na większy otwór potyliczny. Koło Willisa, charakterystyczna konfiguracja naczyń w głębi mózgu, może zostać zlokalizowane i zbadane przy zastosowaniu wszystkich wyżej wymienionych technik. Tętnica podstawna (BA), biegnąca po stronie brzusznej móżdżku, prowadzi ostatecznie do mózgowia i symetrycznie rozgałęzia się na dwie odnogi. Te dwie odnogi na brzusznej stronie mózgu rozchodzą się, a następnie ponownie łączą, tworząc strukturę pierścieniową (Koło Willisa). Ten głęboki pierścień podstawny stanowi naczyniową podstawę, z której wywodzą się wszystkie średniej wielkości naczynia krwionośne, takie jak tętnice mózgu tylna, środkowa i przednia (odpowiednio PCA, MCA i ACA), które są głównymi naczyniami zapewniającymi masywny dopływ krwi do mózgu. W trybie kolorowego Dopplera możliwa jest identyfikacja średniej wielkości odgałęzień, co pozwala na wyraźną wizualizację zakrzywionych segmentów naczyniowych (takich jak PCA) wchodzących w skład Koła Willisa (Rysunek 18).
Tkanka miąższu mózgu została również zarejestrowana w trybie PA w projekcji potylicznej (Rysunek 19), aby przedstawić charakterystykę naczyniową na wykresie widmowym (Rysunek 20). Dzięki temu widmu możliwe jest rozróżnienie sygnału pochodzącego z naczyń tętniczych i żylnych.
Rycina 1: Lokalizacja otworów czaszki i odpowiednie punkty widzenia dla akwizycji obrazu. Głowa szczura w profilu (a) oraz miejsca, w których można umieścić przetwornik obrazujący, aby znajdował się on nad otworem skroniowym (fioletowa strzałka) i nad otworem potylicznym (żółta strzałka) w profilu (b).
Rysunek 2: Ułożenie zwierzęcia do obrazowania skroniowego. (a) Ułożenie zwierzęcia na blacie roboczym do pozyskiwania obrazów: po zgoleniu sierści z głowy zwierzę umieszcza się w pozycji brzusznej, z ciałem lekko przechylonym na jedną stronę, aby odsłonić skroniową stronę głowy. Blat roboczy może być wyposażony w urządzenie grzewcze w celu utrzymania ciepłoty ciała zwierzęcia podczas obrazowania. Do uzyskania tej pozycji można użyć watowanych wałków, natomiast łapy przymocowuje się plastrami przylepnymi do czujników służących do monitorowania funkcji życiowych. (b) Jednolita warstwa żelu do USG pokrywa obszar głowy, w którym podczas obrazowania zostanie umieszczony przetwornik.
Rycina 3: Parametry akwizycji dla obrazowania w trybie B. (a) Ilustracyjny zrzut ekranu przedstawiający panel z kluczowymi parametrami akwizycji zastosowanymi podczas obrazowania mózgu w trybie B. (b) Co istotne, częstotliwość nadawania została ustawiona na niską wartość (16 MHz), aby poprawić penetrację tkanki przez fale US.
Rycina 4: Poprzeczne pozyskiwanie obrazów z otworu skroniowego. (a) Wirtualna oś odniesienia łącząca małżowinę uszną z okiem oraz ruch nachylenia (czerwona strzałka) w celu zmiany inklinacji przetwornika i płaszczyzny pozyskiwania obrazu; (b) Ruch przeciwny do wskazówek zegara względem referencyjnej osi ucho-oko i zmienna inklinacja pozycji przetwornika; c) Ruch zgodny z wskazówkami zegara względem referencyjnej osi ucho-oko i zmienna inklinacja pozycji przetwornika.
Rycina 5: Optymalna głębokość ogniskowania dla akwizycji obrazów US i PA. Podczas poszukiwania obszaru zainteresowania, głębokość ogniskowania obrazowania (oznaczona żółtym trójkątem) musi zostać ustawiona na około 10 mm głębokości od źródła US/lasera, aby uzyskać optymalną wydajność obrazowania.
Rycina 6: Parametry akwizycji dla obrazowania w trybie kolorowego Dopplera. (a) Przed rozpoczęciem akwizycji obrazu w trybie kolorowego Dopplera można włączyć opcję bramkowania oddechowego, aby uniknąć artefaktów generowanych przez fizjologiczne ruchy oddechowe. (b) Przykładowy zrzut ekranu przedstawiający istotne parametry akwizycji zastosowane do obrazowania mózgu w trybie kolorowego Dopplera.
Rycina 7: Parametry akwizycji dla obrazowania w trybie Power Doppler. Ilustracyjny zrzut ekranu przedstawiający istotne parametry akwizycji zastosowane do obrazowania mózgu w trybie Power Doppler.
Rysunek 8: Parametry akwizycji dla obrazowania w trybie fotoakustycznym. (a) Panel przedstawiający istotne parametry akwizycji zastosowane do obrazowania mózgu w trybie fotoakustycznym. (b) Akwizycja widma fotoakustycznego, oparta na wzbudzeniu laserowym w zakresie od 680 nm do 970 nm, z odstępem długości fali wynoszącym 5 nm (określanym jako wielkość kroku). (c) Parametry akwizycji zastosowane dla trybu fotoakustycznego przy pojedynczej fali 750 nm i 850 nm, odpowiednio do rozróżnienia sygnałów hemoglobiny odtlenowanej i utlenowanej.
Rysunek 9: Pozyskiwanie obrazów w przekroju poprzecznym z otworu potylicznego. (a) Pozycjonowanie przetwornika na szyi zwierzęcia (żółta strzałka) i wynikająca z tego płaszczyzna obrazowania poprzecznego, która wirtualnie przecina głowę w kierunku ogonowo-rostralnym; (b) widok tylny pozycjonowania przetwornika i płaszczyzny pozyskiwania obrazu.
Rycina 10: Akwizycja w trybie B z otworu skroniowego w celu wyodrębnienia punktów odniesienia anatomicznych. Można łatwo rozróżnić naskórek (a), czaszkę (b) oraz miąższ (c), ale można również wykryć inne punkty odniesienia anatomiczne, takie jak szczelina (d) otaczająca brzuszną głęboką część mózgu oraz charakterystyczny kształt drogi wzrokowej (e).
Rysunek 11: Pozyskiwanie obrazu w trybie Power Doppler przez okno skroniowe w celu wyodrębnienia punktów odniesienia naczyniowych. MCA odchodząca od ICA po skroniowej stronie mózgu. Aby uzyskać ten widok, pozyskano obraz w przekroju poprzecznym, kierując przetwornik na okno skroniowe i obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
Rysunek 12: Akwizycja w trybie Power Doppler przez otwór skroniowy w celu wyodrębnienia punktów odniesienia naczyniowych. MCA odchodząca od ICA po skroniowej stronie mózgu. Aby uzyskać ten widok, wykonano obraz w przekroju poprzecznym, kierując przetwornik na otwór skroniowy i obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
Rycina 13: Akwizycja w trybie kolorowego Dopplera przez otwór skroniowy w celu identyfikacji punktów odniesienia naczyń krwionośnych. MCA odgałęziająca się od ICA po skroniowej stronie mózgu. Informacje o kierunku strumienia krwi są przedstawione za pomocą kolorowej skali, rozróżniającej ruchy przepływu skierowane w stronę przetwornika i oddalające się od niego.
Rycina 14: Akwizycja w trybie fali impulsowej przez otwór skroniowy w celu indywidualizacji punktów odniesienia naczyniowych. Potwierdzenie właściwości tętniczych krwi krążącej w naczyniach, które hipotetycznie zidentyfikowano jako tętnice: tryb fali impulsowej dostarcza informacji o zmienności prędkości strumienia, co można powiązać z efektem pulsacji serca (bardziej intensywnym w tętnicach niż w żyłach).
Rysunek 15: Akwizycja w trybie fali impulsowej przez otwór skroniowy w celu wyodrębnienia punktów odniesienia naczyń krwionośnych. Identyfikacja naczyń krwionośnych jako żył w trybie fali impulsowej, w których efekt pulsacji serca na prędkości strumienia jest pomijalny.
Rycina 16: Akwizycja w trybie fotoakustycznym przez otwór skroniowy w celu wyodrębnienia punktów odniesienia naczyniowych. Wewnętrzne naczynia miąższowe w bocznej części mózgu w obszarze skroniowym zwizualizowane w trybie B (lewo) oraz w jednofalowym trybie fotoakustycznym (prawo). Kolory paska skali odzwierciedlają różne wartości intensywności sygnału fotoakustycznego, wywołanego przez wzbudzenie laserowe przeprowadzone przy jednej wybranej długości fali. W celu wyodrębnienia żył i tętnic długości fali wzbudzenia można ustawić na 750 i 850 nm, co odpowiada wartościom pozwalającym uzyskać piki emisji fotoakustycznej odpowiednio dla hemoglobiny odtlenowanej i utlenowanej.
Rysunek 17: Akwizycja w trybie fotoakustycznym przez otwór skroniowy w celu rozróżnienia hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej. Naczynia wewnętrzne bocznej części mózgu w okolicy skroniowej zwizualizowane w trybie B (lewo) oraz w fotoakustycznym trybie Oxy-Hemo (prawo). Kolory paska skali odzwierciedlają różne wartości procentowe wysycenia hemoglobiny we krwi tlenem.
Rycina 18: Pozyskiwanie obrazu w trybie kolorowego Dopplera przez otwór potyliczny w celu wyodrębnienia punktów odniesienia naczyniowych. Zakrzywione segmenty naczyniowe tworzące strukturę podstawową koła tętniczego mózgu, zlokalizowane po brzusznej stronie mózgu.
Rysunek 19: Akwizycja fotoakustyczna i w trybie B przez otwór potyliczny w celu identyfikacji punktów odniesienia naczyniowych. Na obrazie w trybie B można wyróżnić struktury anatomiczne widoczne w projekcji potylicznej oraz odpowiadającą im akwizycję w trybie fotoakustycznym z detekcją spektralną w zakresie od 670 nm do 980 nm (z krokiem 5 nm).
Rycina 20: Akwizycja fotoakustyczna i w trybie B przez otwór potyliczny w celu indywidualizacji punktów odniesienia naczyniowych. Na tym obrazie przedstawiono widmo odpowiadające trzem obszarom ROI wyznaczonym na poziomie miąższu móżdżku; w szczególności wyznaczono je na poziomie trzech struktur naczyniowych, których typ różni się pod względem przebiegu widmowego (ROI fuksjowe i błękitne odpowiadają strukturom naczyniowym żylnym; ROI żółta odpowiada strukturze naczyniowej tętniczej).
Dyskusja
Prezentowany protokół został zoptymalizowany w celu zapewnienia wysokiej skuteczności obrazowania mózgu u małych zwierząt. Obrazy można uzyskiwać w różnych modalnościach, precyzyjnie podążając za wskazówkami dotyczącymi parametrów akwizycji i umiejscowienia przetwornika na otworach czaszki. W szczególności najbardziej krytyczne jest ustawienie po stronie skroniowej, ponieważ US i laser muszą być wyśrodkowane tak precyzyjnie, jak to możliwe, aby prawidłowo penetrować otwór, który jest mniejszy niż potyliczny. Niemniej jednak, dzięki temu eksperymentalnemu otoczeniu, cechy hemodynamiczne związane z fizjologią, a nawet patologicznymi zawodami są dostępne i mogą być oceniane nawet w głębokich obszarach mózgu, które zwykle są trudne do scharakteryzowania.
Ponieważ pomyślne uzyskanie obrazu zależy od dokładności pozycjonowania przetwornika, zależność ta musi być dokładnie uwzględniona, ponieważ może mieć wpływ na jakość obrazowania. Na przykład niektóre interesujące struktury anatomiczne mogą nie być w pełni uwzględnione w płaszczyźnie obrazowania akwizycji, a ich identyfikacja na podstawie obrazów, które oferują tylko częściowe widzenie, może być nieoptymalna. Co więcej, akwizycja obrazowania US i PA wykonana w trybie trójwymiarowym (tryb 3D) nie byłaby kompatybilna z wcześniej opisanym ustawieniem eksperymentalnym, ponieważ wymaga od przetwornika poruszania się po predefiniowanej zautomatyzowanej ścieżce. Wreszcie, ze względu na naturalną zmienność anatomiczną, wymiary otworów czaszki mogą się znacznie różnić u zwierząt, co ma nieprzewidywalne reperkusje dla procesu nabywania. Fakt ten sprawia, że jakość obrazu zależy od cech każdej osoby. W związku z tym przy opracowywaniu protokołu doświadczalnego należy wziąć pod uwagę niemożność zastosowania tej strategii w odniesieniu do niektórych zwierząt.
W szczególności niezwykłe zainteresowanie dotyczy hemodynamiki, ze względu na jej fundamentalną rolę w określaniu biodystrybucji leków lub innych cząsteczek egzogennych po podaniu ogólnoustrojowym28-29. Implikacje aplikacyjne w dziedzinie obrazowania molekularnego są liczne, począwszy od walidacji środków kontrastowych do obrazowania puli krwi, a skończywszy na monitorowanych obrazowo badaniach dostarczania leków, wymagających otwarcia BBB wywołanego ultradźwiękami30. Wszystkie te cele badawcze z pewnością skorzystają na minimalnej inwazyjności protokołu, biorąc pod uwagę, że bez dodatkowej operacji ryzyko śmierci lub niepożądanych skutków ubocznych jest znacznie zmniejszone, a długoterminowe monitorowanie na tych samych modelach zwierzęcych jest wykonalne.
Podsumowując, przedstawiony protokół umożliwi lekarzowi sprawne obrazowanie i prawidłową interpretację topografii anatomicznej i wzoru naczyniowego prawidłowych lub patologicznych tkanek mózgowych w modelach zwierzęcych do użytku badawczego. Podczas gdy obecne metody ograniczają się głównie do tomograficznego obrazowania kory mózgowej25-27, to ustawienie daje możliwość zilustrowania kilku procesów, które wpływają na głęboką fizjologię mózgu, poprzez połączenie zalet oferowanych zarówno przez obrazowanie amerykańskie, jak i PA.
Oświadczenia
Opłaty za publikację tego artykułu zostały ufundowane przez Visual Sonics.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stanowisko ultrasonograficzne i fotoakustyczne wysokiej częstotliwości (system VEVO LAZR 2100) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | ||
| Kompaktowy podwójny system anestezjologiczny Vevo (wersja stołowa) | FUJIFILM VisualSonics Inc. | http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf | |
| Żel do transmisji ultradźwięków (Aquasonic 100) | Parker Laboratories Inc. | 01-08 | http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp |
| Szczury Sprague-Dawley | Charles River Laboratories | Trzy zdrowe 6-tygodniowe szczury Sprague-Dawley zostały zakupione w Charles River Laboratories i trzymane w standardowych pomieszczeniach (12-godzinne cykle jasne-ciemne) ze standardową karmą dla gryzoni i dostępną wodą ad libitum. Dostarczone przez: http://www.criver.com/ |
Bibliografia
- Bestmann, S., Feredoes, E. Combined neurostimulation and neuroimaging in cognitive neuroscience: past, present, and future. Ann N Y Acad Sci. 1296, 11-30 (1111).
- Kim, S. A., Jun, S. B. In-vivo Optical Measurement of Neural Activity in the Brain. Exp Neurobio. 22 (3), 158-166 (2013).
- Silva, G. A. Nanotechnology approaches to crossing the blood-brain barrier and drug delivery to. the CNS.BMC Neurosci. 9, Suppl 3. S4(2008).
- Stemmer, N., Mehnert, J., Steinbrink, J., Wunder, A. Noninvasive fluorescence imaging in animal models of stroke. Curr Med Chem. 19 (28), 4786-4793 (2012).
- Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nat Clin Pract Neurol. 4 (12), 664-675 (2008).
- Liao, L. D., et al. Neurovascular coupling: in vivo optical techniques for functional brain imaging. Biomed Eng Online. , 12-38 (2013).
- Youn, H., Hong, K. J. In vivo Noninvasive Small Animal Molecular Imaging. Osong Public Health Res Perspect. 3 (1), 48-59 (2012).
- Miyawaki, A.Fluorescence imaging in the last two decades. Microscopy (Oxf). 62 (1), 63-68 (1093).
- Feldman, M. K., Katyal, S., Radiographics Blackwood, M. S. U. S. artifacts 29 (4), 1179-1189 (1148).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Zacharatos, H., Hassan, A. E., Qureshi, A. I. Intravascular ultrasound: principles and cerebrovascular applications. AJNR Am J Neuroradiol. 31 (4), 586-597 (2010).
- Li, C., Wang, L. V. Photoacoustic tomography and sensing in biomedicine. Phys Med Biol. 54 (19), R59-R97 (2009).
- Kim, C., Favazza, C., Wang, L. V. In vivo photoacoustic tomography of chemicals: high-resolution functional and molecular optical imaging at new depths. Chem Rev. 110 (5), 2756-2782 (2010).
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15 (1), (2010).
- Mallidi, S., Luke, G. P., Emelianov, S. Photoacoustic imaging in cancer detection, diagnosis, and treatment guidance. Trends Biotechnol. 29 (5), 213-221 (2011).
- Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clin Radiol. 65 (7), 500-517 (2010).
- Nie, L., Cai, X., Maslov, K., Garcia-Uribe, A., Anastasio, M. A., Wang, L. V. Photoacoustic tomography through a whole adult human skull with a photon recycler. J Biomed Opt. 17 (11), (2012).
- Huang, C., et al. Aberration correction for transcranial photoacoustic tomography of primates employing adjunct image data. J Biomed Opt. 17 (6), (2012).
- Nie, L., Guo, Z., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of monkey brain using virtual point ultrasonic transducers. J Biomed Opt. 16 (7), (2011).
- Guevara, E., et al. Imaging of an inflammatory injury in the newborn rat brain with photoacoustic tomography. PLoS On. 8 (12), (2013).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Microscopy. Laser Photon Rev. 7 (5), (2013).
- Liu, Y., et al. Assessing the effects of norepinephrine on single cerebral microvessels using optical-resolution photoacoustic microscope. J Biomed Opt. 18 (7), (2013).
- Xia, J., et al. Whole-body ring-shaped confocal photoacoustic computed tomography of small animals in vivo. J Biomed Opt. 17 (5), 050506(2012).
- Sun, J., Lindvere, L., Van Raaij, M. E., Dorr, A., Stefanovic, B., Foster, F. S. In vivo imaging of cerebral hemodynamics using high-frequency micro-ultrasound. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2010).
- Nasiriavanaki, M., Xia, J., Wan, H., Bauer, A. Q., Culver, J. P., Wang, L. V. High-resolution photoacoustic tomography of resting-state functional connectivity in the mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (1), 21-26 (2014).
- Jao, J., et al. Noninvasive photoacoustic computed tomography of mouse brain metabolism in vivo. Neuroimage. 64, 257-266 (2013).
- Deng, Z., Wang, Z., Yang, X., Luo, Q., Gong, H. In vivo imaging of hemodynamics and oxygen metabolism in acute focal cerebral ischemic rats with laser speckle imaging and functional photoacoustic microscopy. J Biomed Op. 17 (8), 081415-081414 (2012).
- Huang, R. B., Mocherla, S., Heslinga, M. J., Charoenphol, P., Eniola-Adefeso, O. Dynamic and cellular interactions of nanoparticles in vascular-targeted drug delivery. Mol Membr Biol. 27 (7), 312-327 (2010).
- Saxer, T., Zumbuehl, A., Müller, B. The use of shear stress for targeted drug delivery. Cardiovasc Res. 99, 328-3233 (2013).
- Zhao, Y. Z., Lu, C. T., Li, X. K., Cai, J. Ultrasound-mediated strategies in opening brain barriers for drug brain delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10, 987-1001 (2013).
Przedruki i uprawnienia
