Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Summary

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Abstract

Mikroskopia sił atomowych (AFM) wykorzystuje piramidalną końcówkę przymocowaną do wspornika do badania reakcji siły powierzchni. Ugięcia końcówki można zmierzyć do ~10 pN za pomocą detektora laserowego i sektorowego, który można przekształcić w topografię obrazu. Modulacja amplitudy lub "tryb stukania" AFM polega na tym, że sonda nawiązuje przerywany kontakt z powierzchnią, jednocześnie oscylując z częstotliwością rezonansową w celu uzyskania obrazu. Stosowany w połączeniu z komórką płynną, AFM w trybie stukania umożliwia obrazowanie makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka, w fizjologicznie istotnych warunkach. AFM w trybie gwintowania wymaga ręcznego dostrajania sondy i częstych regulacji wielu parametrów skanowania, co może być wyzwaniem dla niedoświadczonych użytkowników. Aby uzyskać obrazy wysokiej jakości, te korekty są najbardziej czasochłonne.

PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) tworzy obraz poprzez pomiar krzywej siły i odpowiedzi dla każdego punktu kontaktu z próbką. Dzięki oprogramowaniu ScanAsyst PF-QNM można zautomatyzować. To oprogramowanie automatycznie dostosowuje wartość zadaną, częstotliwość napędu, szybkość skanowania, wzmocnienia i inne ważne parametry skanowania dla danej próbki. Proces ten nie tylko chroni zarówno delikatne sondy, jak i próbki, ale także znacznie skraca czas potrzebny do uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. PF-QNM jest kompatybilny z obrazowaniem AFM w płynie; W związku z tym ma szerokie zastosowanie do obrazowania materiałów istotnych biologicznie.

Metoda przedstawiona w tym artykule opisuje zastosowanie PF-QNM do uzyskania obrazów bakteryjnego fotoreceptora światła czerwonego, RpBphP3 (P3), z fotosyntetyzującego R. palustris w stanie przystosowanym do światła. Za pomocą tej metody zaobserwowano pojedyncze dimery białkowe P3 i agregaty dimerów na powierzchni miki w obecności bufora obrazowania. Przy odpowiednim dostosowaniu stężenia powierzchniowego i/lub roztworu, metoda ta może być ogólnie stosowana do innych biologicznie istotnych makrocząsteczek i materiałów miękkich.

Introduction

Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się bardzo ważnym narzędziem do badania strukturalnych i mechanicznych właściwości powierzchni, cienkich warstw i pojedynczych cząsteczek od czasu jej wynalezienia w 1986 roku (Rysunek 1). ^1-3 Metoda ta, wykorzystująca komórkę cieczową, stała się szczególnie przydatna w badaniach makrocząsteczek biologicznych, a nawet żywych komórek w fizjologicznie odpowiednim środowisku. ^4-10 AFM w trybie gwintowania jest tradycyjnie używany do obrazowania miękkich materiałów lub luźno związanych cząsteczek na powierzchni, ponieważ AFM w trybie kontaktowym jest zwykle nieodpowiedni ze względu na uszkodzenia....

Protocol

1. Konfiguracja komputera i mikroskopu

1. Otwórz zawór cylindra N₂ i wyreguluj pokrętła, aby upewnić się, że stół powietrzny jest pływający i wypoziomowany.
2. Włącz komputer, kontroler i światło światłowodowe w tej kolejności.
3. Ustaw skaner w trybie AFM/LFM i wyśrodkuj kamerę nad głowicą AFM.
4. Otwarte oprogramowanie. Wybierz kategorię eksperymentu "Właściwości nanomechaniczne", "Ilościowe mapowanie nanomechaniczne" w grupie eksperymentalnej i "PeakForce QNM w płynie" w eksperymencie. Kliknij Załaduj eksperyment, a następnie Konfiguracja.
5. Ustaw ostrość aparatu za pomocą obiektywu Z, aby zobaczyć powierzchnię sceny....

Results

Reprezentatywne obrazy AFM białka fotoreceptorowego, P3, w stanie przystosowanym do światła, są przedstawione na rysunkach 3 i 4. Świeżo rozcięty substrat z miki (rysunek 3A) jest odpowiednią, płaską powierzchnią do adsorpcji białek. Zebranie obrazu czystej miki jako kontroli negatywnej jest ważne z kilku powodów. Po pierwsze, zapewnia, że płynna komórka jest czysta i żadne pozostałości materiałów z poprzednich eksperymentów nie zanieczyszczą powierzchni. Po drugie, test.......

Discussion

AFM to metoda mikroskopii skaningowej z sondą w pełni zdolna do obrazowania białek i innych makrocząsteczek biologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach. W porównaniu z krystalografią rentgenowską i NMR, jednym z ograniczeń AFM jest niezdolność do osiągnięcia tej samej rozdzielczości, zwłaszcza rozdzielczości bocznej. W przypadku korzystania z AFM do analizy cząsteczki na dowolnej powierzchni, podczas analizy danych należy również wziąć pod uwagę wpływ powierzchni i sondy na obraz cząsteczki. Dekonwolucja wpływu so.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Fisher Scientific	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
Multimode 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	wyposażony w kontroler Nanoscope V i skaner J
Sonda	Bruker-Nano	SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tryb gwintowania Płynna komórka	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI dostarcza	1150503	25 x 25 x .26 mm
Dysk nośny	próbki nanoSurf	BT02236
szalka Petriego	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
mikropipety	Denville Scientific	XL 3000i
RpBphP3			Opracowane zgodnie z cytowanymi źródłami
Oprogramowanie nanoskopowe	Bruker-Nano
Fiber Optic Light	Digital Instruments Inc.	F0-50
Chwytak tarczowy Pelco AFM	Ted Pella Inc	1668
Strzykawka	Eppendorfa McKesson	102-ST1C
Denville	Scientific	C2171
Molekularny system graficzny Pymol v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC