Artykuł metodologiczny

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

DOI:

10.3791/52164

⸱

24 października 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia sił atomowych (AFM) wykorzystuje piramidalną końcówkę przymocowaną do wspornika do badania reakcji siły powierzchni. Ugięcia końcówki można zmierzyć do ~10 pN za pomocą detektora laserowego i sektorowego, który można przekształcić w topografię obrazu. Modulacja amplitudy lub "tryb stukania" AFM polega na tym, że sonda nawiązuje przerywany kontakt z powierzchnią, jednocześnie oscylując z częstotliwością rezonansową w celu uzyskania obrazu. Stosowany w połączeniu z komórką płynną, AFM w trybie stukania umożliwia obrazowanie makrocząsteczek biologicznych, takich jak białka, w fizjologicznie istotnych warunkach. AFM w trybie gwintowania wymaga ręcznego dostrajania sondy i częstych regulacji wielu parametrów skanowania, co może być wyzwaniem dla niedoświadczonych użytkowników. Aby uzyskać obrazy wysokiej jakości, te korekty są najbardziej czasochłonne.

PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) tworzy obraz poprzez pomiar krzywej siły i odpowiedzi dla każdego punktu kontaktu z próbką. Dzięki oprogramowaniu ScanAsyst PF-QNM można zautomatyzować. To oprogramowanie automatycznie dostosowuje wartość zadaną, częstotliwość napędu, szybkość skanowania, wzmocnienia i inne ważne parametry skanowania dla danej próbki. Proces ten nie tylko chroni zarówno delikatne sondy, jak i próbki, ale także znacznie skraca czas potrzebny do uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. PF-QNM jest kompatybilny z obrazowaniem AFM w płynie; W związku z tym ma szerokie zastosowanie do obrazowania materiałów istotnych biologicznie.

Metoda przedstawiona w tym artykule opisuje zastosowanie PF-QNM do uzyskania obrazów bakteryjnego fotoreceptora światła czerwonego, RpBphP3 (P3), z fotosyntetyzującego R. palustris w stanie przystosowanym do światła. Za pomocą tej metody zaobserwowano pojedyncze dimery białkowe P3 i agregaty dimerów na powierzchni miki w obecności bufora obrazowania. Przy odpowiednim dostosowaniu stężenia powierzchniowego i/lub roztworu, metoda ta może być ogólnie stosowana do innych biologicznie istotnych makrocząsteczek i materiałów miękkich.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się bardzo ważnym narzędziem do badania strukturalnych i mechanicznych właściwości powierzchni, cienkich warstw i pojedynczych cząsteczek od czasu jej wynalezienia w 1986 roku (Rysunek 1). 1-3 Metoda ta, wykorzystująca komórkę cieczową, stała się szczególnie przydatna w badaniach makrocząsteczek biologicznych, a nawet żywych komórek w fizjologicznie odpowiednim środowisku. 4-10 AFM w trybie gwintowania jest tradycyjnie używany do obrazowania miękkich materiałów lub luźno związanych cząsteczek na powierzchni, ponieważ AFM w trybie kontaktowym jest zwykle nieodpowiedni ze względu na uszkodzenia spowodowane siłami bocznymi wywieranymi na próbkę przez wspornik. 11 AFM w trybie gwintowania znacznie zmniejsza te siły, ponieważ końcówka sporadycznie dotyka powierzchni, a nie jest w stałym kontakcie. W tym trybie wspornik oscyluje na poziomie lub w pobliżu swojej częstotliwości rezonansowej normalnej do powierzchni. Podobnie jak w przypadku AFM w trybie kontaktowym, topografia jest analizowana poprzez wykreślenie ruchu z-piezoelektrycznego w funkcji xy (odległości).

Dynamika kantylu może być dość niestabilna przy rezonansie lub w jego pobliżu; dlatego jest bardzo trudna do zautomatyzowania poza sytuacją "stanu ustalonego". W szczególności dynamika ta zależy zarówno od właściwości próbki, jak i środowiska skanowania. W przypadku miękkiej cząsteczki zaadsorbowanej na twardej powierzchni, dobrze dostrojona pętla sprzężenia zwrotnego dla cząsteczki może prowadzić do oscylacji sprzężenia zwrotnego dla powierzchni. Praca w płynie dodatkowo komplikuje strojenie wspornika. Zmiany temperatury lub poziomu płynu wymagają ciągłej regulacji wartości zadanej, wzmocnień i innych parametrów obrazowania. Te dostosowania są zwykle bardzo czasochłonne i stanowią wyzwanie dla użytkowników.

Ilościowe mapowanie nanomechaniczne siły szczytowej (PF-QNM), podobnie jak AFM w trybie stukania, pozwala uniknąć interakcji bocznych poprzez sporadyczny kontakt z próbką (Rysunek 2). 12-15 Jednak PF-QNM działa w trybie nierezonansowym i na częstotliwościach znacznie niższych niż AFM w trybie podsłuchowym. Eliminuje to wyzwania związane z dostrajaniem AFM w trybie gwintowania, szczególnie te nasilane przez obecność płynu. Dzięki PF-QNM obrazy są zbierane poprzez pobranie krzywej odpowiedzi siły w każdym punkcie kontaktu. Dzięki dodatkowi oprogramowania ScanAsyst15 regulacja parametrów skanowania może zostać zautomatyzowana, a obraz o wysokiej rozdzielczości uzyskany w ciągu kilku minut nawet przez niedoświadczonych użytkowników. Gdy użytkownik lepiej zapozna się z AFM, niektóre lub wszystkie parametry automatyczne mogą zostać wyłączone w dowolnym momencie, co pozwala eksperymentatorowi na ręczne dostrojenie jakości obrazu. Od samego początku PF-QNM był stosowany do mapowania bakteriorodopsyny, białka błonowego, i innych natywnych białek na poziomie submolekularnym. 16-18 W przypadku bakteriorodopsyny istnieje bezpośrednia korelacja między elastycznością białek a strukturami krystalograficznymi promieniowania rentgenowskiego. 12 PF-QNM został wykorzystany do badania żywych komórek w wysokiej rozdzielczości. 19,20 Ponadto dane PF-QNM wyjaśniły ważne powiązania między strukturą i mechaniką w błonie erytrocytów, które mają kluczowe znaczenie dla integralności i funkcji komórki. 21

Zastosowaliśmy metody mikroskopii skaningowej (SPM), w tym AFM,23 do badania struktury fotoreceptorów światła czerwonego zwanych bakteriofitochromami (BphP). 24,25 Składają się z modułu wykrywającego światło kowalencyjnie połączonego z modułem sygnalizacyjno-efektorowym, takim jak kinaza histydynowa (HK). 26 Moduł światłoczuły zazwyczaj zawiera chromofor bilinowy, który ulega przemianie strukturalnej po absorpcji fotonu, przy czym szereg zmian strukturalnych dociera do modułu efektorowego sygnalizacji i prowadzi do globalnej transformacji całego białka. 24,27-29 W oparciu o tę transformację, istnieją dwa odrębne stany pochłaniania światła BphP, stan pochłaniania światła czerwonego i dalekiej czerwieni, oznaczane jako Pr i Pfr. Pr jest stabilnym termicznie, ciemnym stanem przystosowanym dla większości BphPs.28 Molekularne podstawy fotokonwersji Pr / Pfr nie są do końca zrozumiałe ze względu na ograniczoną wiedzę strukturalną tych białek. Z wyjątkiem jednej struktury D. radiodurans,30 wszystkie opublikowane struktury krystalograficzne rentgenowskie tych białek są w stanie przystosowanym do ciemności i nie mają domeny efektorowej. Nienaruszone BphP są zbyt duże, aby można je było skutecznie badać za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i są niezwykle trudne do krystalizacji w nienaruszonej postaci (szczególnie w stanie przystosowanym do światła) dla krystalografii rentgenowskiej. BphP zostały ostatnio zaprojektowane jako markery białkowe fluorescencji w podczerwieni (IFP). 31 Charakterystyka strukturalna tych białek może dodatkowo pomóc w efektywnym projektowaniu IFP. 32-36 Rozdział 32-36

Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie procedury obrazowania BphP za pomocą AFM z płynnymi komórkami za pomocą PF-QNM. Metodę demonstrują badania stanu przystosowania do światła bakteriofitochromu RpBphP3 (P3) z bakterii fotosyntetycznej R. palustris. Przedstawiona tutaj procedura AFM jest wygodnym i prostym podejściem do obrazowania białek, a także innych makrocząsteczek biologicznych. Dzięki tej metodzie szczegóły strukturalne poszczególnych cząsteczek można zebrać w krótkim czasie, podobnie jak w przypadku sesji laboratoryjnej na wyższym poziomie. Mierząc przekroje poprzeczne i wykonując dalsze analizy wymiarowe, dane eksperymentalne można porównać z użytecznymi modelami obliczeniowymi. 37-42 Rozdział 37-42

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja komputera i mikroskopu

  1. Otwórz zawór cylindra N2 i wyreguluj pokrętła, aby upewnić się, że stół powietrzny jest pływający i wypoziomowany.
  2. Włącz komputer, kontroler i światło światłowodowe w tej kolejności.
  3. Ustaw skaner w trybie AFM/LFM i wyśrodkuj kamerę nad głowicą AFM.
  4. Otwarte oprogramowanie. Wybierz kategorię eksperymentu "Właściwości nanomechaniczne", "Ilościowe mapowanie nanomechaniczne" w grupie eksperymentalnej i "PeakForce QNM w płynie" w eksperymencie. Kliknij Załaduj eksperyment, a następnie Konfiguracja.
  5. Ustaw ostrość aparatu za pomocą obiektywu Z, aby zobaczyć powierzchnię sceny. Za pomocą zgrubnych piezoskopów góra/dół przesuń stolik około 1 mm poniżej powierzchni otworu głowicy AFM.

2. Przygotowanie powierzchni miki

  1. Przycisnąć naklejkę samoprzylepną do powierzchni dysku nośnego czystej próbki (średnica 15 mm i grubość 0,8 mm). Wciśnij krążek miki klasy V-4 (25 x 25 x 26 mm) na klej, aż zostanie mocno przymocowany.
  2. Wetrzyj kawałek przezroczystej taśmy w mikę, upewniając się, że jest całkowicie przyklejona i nie ma pęcherzyków powietrza. Oderwij taśmę od miki z jednej strony, aby równomiernie ją rozciąć. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że mika jest płaska.
  3. Chwyć dysk nośny, wyczyść mikę stroną do góry za pomocą pęsety kołowej (chwytaków do dysku) i umieść na skanerze. Mika powinna znajdować się poniżej poziomu otworu głowicy AFM.

3. Składanie komórek płynów i obrazowanie powierzchni miki

  1. Wypłucz ogniwo płynu, O-ring, adapter strzykawki, adapter węża i wąż wyrzutowy w 100% etanolu. Opłucz komórkę płynu w wodzie DI. Pozostaw wszystkie części do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
  2. Wsuń adapter węża do portu w ogniwie czystego płynu. Delikatnie wciśnij O-ring w środkowe wgłębienie komórki płynu za pomocą pęsety z płaską główką.
  3. Lekko dociśnij sprężynę do zacisku ustalającego sondę i odkręć ją od rowka na końcówkę.
  4. Chwyć sondę na długim końcu z dala od końcówki pęsetą z płaską główką. Umieść sondę w rowku z końcówką skierowaną do środka komórki. Wciśnij sprężynę i wyreguluj zacisk ustalający na sondzie, aby ją zabezpieczyć (Rysunek 1B).
  5. Sprawdź clamp na AFM, aby upewnić się, że jest całkowicie schowany (Rysunek 1C).
  6. Umieść celę płynu, O-ring i sondę skierowaną w dół na próbce miki. Pozwól, aby komórka płynu spoczywała na kołkach AFM. Opuść zacisk, aby ustabilizować komórkę płynu na stoliku. Naciskaj przełącznik w dół na mikroskopie, aż oględziny wykażą, że O-ring jest mocno ściśnięty między dyskiem nośnym a ogniwem płynu.
  7. Podczas patrzenia na monitor ustaw ostrość pokrętło regulacji zgrubnej, aby wyświetlić górną część komórki płynu na ekranie.
  8. Przesuwaj mikroskop, aż uzyskasz wyraźny obraz końcówki za pomocą pokręteł regulacji X/Y i obiektywu Z. Końcówka będzie wyglądać jak metaliczny, złoty trójkąt. Przesuń końcówkę bliżej powierzchni próbki za pomocą dolnej dźwigni piezoelektrycznej na mikroskopie. Skoncentruj się na odbiciu końcówki. Śledź rzeczywisty wspornik w stosunku do jego odbicia. Na tym etapie powinny być ściśle wyrównane, ale nie całkowicie na siebie.
  9. Podłączyć łącznik strzykawki do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Podłączyć jeden koniec węża wyrzutowego do adaptera strzykawki, a drugi koniec węża umieścić w pojemniku z roztworem buforowym. Całkowicie wysunąć tłok strzykawki.
  10. Podłącz wąż do adaptera węża na ogniwie płynu. Delikatnie naciśnij tłok, aż płyn całkowicie wypełni środkową komorę. Sprawdź ogniwo, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Sprawdź, czy płyn nie wylewa się z ogniwa płynu na mikroskop. Umieścić strzykawkę na podniesionym, solidnym podłożu.
  11. Użyj obrazu z kamery i pokręteł translacji X/Y, aby zlokalizować laser na ekranie (rozproszona czerwona kropka). Za pomocą pokręteł sterowania ruchem lasera przesuń laser na końcówkę.
  12. Dokładnie wyreguluj elementy sterujące laserem i lustrem, aż suma sygnału wyświetlanego na mikroskopie zostanie zmaksymalizowana (wartość = 4 - 6).
  13. Wyreguluj kąt diody kwadrantowej za pomocą pokręteł po lewej tylnej stronie i w lewym górnym rogu głowicy skanującej, aby obniżyć odchylenia pionowe i poziome wyświetlane na mikroskopie jak najbliżej zera (± 0,1).
  14. W oprogramowaniu wybierz opcje pozyskiwania. Jako minimum wybierz wysokość (śledzenie i trasowanie), błąd siły szczytowej i deformację. Inne opcje są zależne od użytkownika i mogą być dostosowane w oparciu o konkretne informacje pożądane przez eksperymentatora.
  15. Wybierz "linię" dla dopasowania płaszczyzny RT w każdym oknie akwizycji. Wybierz "brak" dla dopasowania do płaszczyzny OT w oknach wysokości. Ustaw przesunięcie X i Y oraz kąt skanowania na zero, jeśli jeszcze tego nie zrobiono.
  16. Ustaw częstotliwość skanowania na 1 Hz, próbkę na linię na 256, automatyczne sterowanie ScanAsyst na indywidualną, a limit ScanAsyst auto Z na wyłączony. Zmień limit Z na 500 nm. Ustaw rozmiar skanowania na 1 μm.
  17. Kliknij przycisk Zaangażuj. W tym momencie końcówka zbliża się do powierzchni. Gdy końcówka się zbliża, obserwuj zmianę napięcia piezoelektrycznego Z w lewym dolnym rogu ekranu. Jeśli końcówka wyjdzie poza zakres, wycofaj końcówkę i zbliż się ponownie. Jeśli to się nie powiedzie, może być konieczna zmiana końcówki, aby uzyskać udane podejście. Po zatrzaśnięciu końcówki linie zaczną pojawiać się w każdym z okien akwizycji, które złożą się na obraz.
  18. Rób zdjęcia miki w rozdzielczości 1 x 1 μm i powoli powiększaj, aby upewnić się, że powierzchnia miki jest czysta i płaska. Kliknij opcję Przechwytywanie ciągłe, aby zapisać obrazy w takiej postaci, w jakiej się pojawiają. Powiększanie i poruszanie się po powierzchni zgodnie z potrzebami.

4. Osadzanie białek i przygotowanie próbki do obrazowania

  1. Otrzymać próbkę oczyszczonego białka38 i przechowywać na lodzie. W przypadku przechowywania w zamrażarce próbkę rozmrażać na lodzie przez 5 minut.
  2. Rozcieńczyć białko do 0,0010 mg/ml za pomocą schłodzonego roztworu buforowego do obrazowania. Zastosowany tutaj bufor obrazowania to 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl i 15 mM MgCl2.
  3. Napełnij 4-komorową (100 x 15 mm) szalkę Petriego schłodzonym roztworem buforowym do obrazowania. Napełnij każdą komorę co najmniej 5 ml roztworu. Delikatnie wymieszać rozcieńczony roztwór białka z końcówką dołączoną do mikropipetatora.
  4. Nanieść 200 μl rozcieńczonego roztworu białka na przygotowaną już powierzchnię miki. Po 30 sekundach podnieś powierzchnię białka/miki za pomocą okrągłej pęsety (chwytaków krążkowych). Trzymaj próbkę równolegle do stołu laboratoryjnego.
  5. Trzymając próbkę, natychmiast zanurzyć próbkę w roztworze buforowym zawartym w pierwszej ćwiartce płytki Petriego (krok 4.2), upewniając się, że próbka jest równoległa do miski płytki Petriego. Po upływie 1 sekundy usunąć próbkę.
  6. Kontynuując trzymanie próbki równolegle do miski szalki Petriego, powtórzyć krok 4.5 dla pozostałych trzech ćwiartek.
  7. Umieść dysk na suchej, bezpyłowej szmatce, aby wchłonąć nadmiar wilgoci i przenieś dysk na stolik mikroskopu. Nie dotykaj rzeczywistej powierzchni szmatką. Nie dopuścić do wyschnięcia próbki.
  8. Powtórz kroki 3.6 - 3.16.

5. Obrazowanie białek na mice

  1. Kliknij pole wyboru parametrów po lewej stronie ekranu. Rozmiar sprężyny i promień końcówki należy ustawić w zależności od używanej końcówki.
  2. Kliknij przycisk Zaangażuj. Podobnie jak w procesie obrazowania miki (krok 3.17), obserwuj okno z-piezoelektryczne, gdy zbliża się końcówka.
  3. Pozwól skanerowi na obrazowanie tego samego obszaru przez co najmniej dwa kolejne przejścia. Kliknij opcję Przechwytywanie ciągłe, aby zapisać każdy zebrany obraz.
  4. Przenieś skaner do nowego regionu i/lub zmień rozmiar obrazu zgodnie z potrzebami.
  5. Gdy automatyczne oprogramowanie zakończy dostosowywanie parametrów skanowania do określonego rozmiaru obrazu, wyłącz oprogramowanie.
  6. Ręcznie dostosuj szybkość skanowania, limit z, liczbę linii i napięcie, aby precyzyjnie dostroić ostrość obrazu. Jeśli obraz stanie się zbyt nieostry, włącz ponownie oprogramowanie, aby przywrócić pierwotną pozycję początkową. Aby zwiększyć rozdzielczość obrazu podczas powiększania białka, zmniejsz szybkość skanowania i proporcjonalnie zwiększ liczbę linii.
  7. Po eksperymencie oczyść płynną komórkę 100% etanolem i spłucz DI H2O. Pozostaw płynną komórkę do całkowitego wyschnięcia.
  8. Otwórz oprogramowanie do obsługi danych, aby przetworzyć obrazy danych pierwotnych. Najpierw spłaszcz obraz, klikając ikonę spłaszczania. Wybierz opcję Zero th order (Kolejnośćzerowa) i kliknij przycisk execute (wykonaj). W zależności od obrazu może być konieczne dopasowanie płaszczyzny, aby uzyskać odpowiednio płaski obraz. W takim przypadku wybierz ikonę dopasowania płaszczyzny i narysuj płaszczyznę płaskiego obszaru obrazu za pomocą kursora. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj). Powtórz w razie potrzeby
  9. Wybierz zakładkę przekrój poprzeczny, aby zmierzyć wymiary białka. Narysuj linię z kursorem, przesuń ją nad cząsteczkę lub obszar, który chcesz przeanalizować. Powtórz tę czynność dla wielu obszarów, a oprogramowanie wygeneruje nakładkę. Wyeksportuj obraz lub dane użyte do wygenerowania obrazu w formacie zgodnym z innymi programami i programami do rysowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne obrazy AFM białka fotoreceptorowego, P3, w stanie przystosowanym do światła, są przedstawione na rysunkach 3 i 4. Świeżo rozcięty substrat z miki (rysunek 3A) jest odpowiednią, płaską powierzchnią do adsorpcji białek. Zebranie obrazu czystej miki jako kontroli negatywnej jest ważne z kilku powodów. Po pierwsze, zapewnia, że płynna komórka jest czysta i żadne pozostałości materiałów z poprzednich eksperymentów nie zanieczyszczą powierzchni. Po drugie, test...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM to metoda mikroskopii skaningowej z sondą w pełni zdolna do obrazowania białek i innych makrocząsteczek biologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach. W porównaniu z krystalografią rentgenowską i NMR, jednym z ograniczeń AFM jest niezdolność do osiągnięcia tej samej rozdzielczości, zwłaszcza rozdzielczości bocznej. W przypadku korzystania z AFM do analizy cząsteczki na dowolnej powierzchni, podczas analizy danych należy również wziąć pod uwagę wpływ powierzchni i sondy na obraz cząsteczki. Dekonwolucja wpływu so...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma konkurujących ze sobą interesów finansowych ani konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Program NSF-MRI (CHE: 1229103) jest uznawany za finansowanie zakupu nowej elektroniki sterującej, oprogramowania, ogniw płynnych i innego sprzętu potrzebnego do montażu podwójnego AFM/STM. Dziękujemy za wspólne udogodnienia w programie NSF-MRSEC Uniwersytetu w Chicago (DMR-0820054) za pomoc w zakresie oprzyrządowania AFM, szkolenia i obrazowania oraz za czas pracy przyrządów udostępniony przez Sieć Placówek Badań Materiałowych (DMR-0820054). Szczególnie dziękujemy dr Qiti Guo, dr Justinowi Jurellerowi i prof. Ka Yee Lee za powitanie naszych studentów przed sfinansowaniem projektu NSF-MRI, który sprowadził niezbędne oprzyrządowanie do naszego kampusu. Potwierdzamy finansowanie z grantu STEM Title III (ID: P031C110157) przyznanego Northeastern Illinois University, który zapewnił letnie stypendia badawcze dla studentów i wykładowców, a także wsparcie w zakresie materiałów eksploatacyjnych. Na koniec dziękujemy firmie Bruker-Nano, Inc. za nieustające wsparcie i zgodę na odtworzenie wykresu przedstawiającego mechanizm działania PeakForce QNM oraz za użycie słowa ScanAsyst do opisania zautomatyzowanego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris-HClFisher ScientificO4997-100
NaClAcros Organics7647-14-5
MgCl2Acros Organics7791-18-6
Multimode 8 AFMBruker-Nano492-008-011wyposażony w kontroler Nanoscope V i skaner J
SondaBruker-NanoSNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tryb gwintowania Płynna komórkaBruker-NanoMTFML
Mica V-4 GradeSPI dostarcza115050325 x 25 x .26 mm
Dysk nośnypróbki nanoSurfBT02236
szalka PetriegoPlasta-Medic, Inc.100 mm x 15 mm 
mikropipetyDenville ScientificXL 3000i
RpBphP3Opracowane zgodnie z cytowanymi źródłami
Oprogramowanie nanoskopoweBruker-Nano
Fiber Optic LightDigital Instruments Inc.F0-50
Chwytak tarczowy Pelco AFMTed Pella Inc1668
StrzykawkaEppendorfa McKesson102-ST1C
DenvilleScientificC2171
Molekularny system graficzny Pymol v.1.5.0.1Schrodinger, LLC
12 mm 1 ml Probówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
  2. Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
  3. Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
  4. Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
  5. Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
  6. Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
  7. Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
  8. Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
  9. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
  10. Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
  11. Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
  12. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
  13. Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
  14. Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
  15. Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
  16. Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  17. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
  18. Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
  19. Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
  20. Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
  21. Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
  22. Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
  23. Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
  24. Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
  25. Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
  26. Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
  27. Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
  28. Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
  29. Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
  30. Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
  31. Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
  32. Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
  33. Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
  34. Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
  35. Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
  36. Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
  37. The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
  38. Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
  39. Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
  40. Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928(2011).
  41. Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
  42. Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Atomic Force MicroscopyPeakForce QNMPhotoreceptor ProteinsRed Light PhotoreceptorsFluid Cell ImagingPeak Force Quantitative Nanomechanical Property MappingMica Surface PreparationProtein Sample ApplicationAutomated Scanning ParametersBiological Macromolecule Imaging

Powiązane artykuły