Artykuł metodologiczny

izolacja i wycięcie aorty mysiej; Wszechstronna technika w badaniu chorób sercowo-naczyniowych

DOI:

10.3791/52172

⸱

24 listopada 2014

 ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Cincinnati College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patologia aorty może prowadzić do ciężkiej zachorowalności i śmiertelności, dlatego uzasadnione są badania nad progresją choroby i potencjalnymi terapiami. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i wycięcia mysiej aorty, aby pomóc naukowcom w badaniu chorób sercowo-naczyniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba sercowo-naczyniowa to szeroki termin opisujący chorobę serca i/lub naczyń krwionośnych. Głównym naczyniem krwionośnym zaopatrującym organizm w natlenioną krew jest aorta. Aorta może ulec uszkodzeniu w chorobach takich jak miażdżyca i tętniak. Naukowcy badający te choroby skorzystaliby na bezpośredniej obserwacji aorty w celu scharakteryzowania postępu choroby, a także oceny skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych. Celem tego protokołu jest opisanie prawidłowej izolacji i wycięcia aorty, aby pomóc badaczom badającym choroby sercowo-naczyniowe. Izolacja i wycięcie aorty pozwala badaczom przyjrzeć się ogólnym zmianom morfometrycznym, a także pozwala im zachować i wybarwić tkankę, aby w razie potrzeby przyjrzeć się zmianom histologicznym. Aorta może być wykorzystana do badań molekularnych w celu oceny ekspresji białek i genów w celu odkrycia celów zainteresowania i mechanizmów działania. Technika ta jest lepsza od metod obrazowania, ponieważ mają one nieodłączne ograniczenia technologiczne i kosztowe. Dodatkowo, pierwotne wyizolowane komórki ze świeżo wyizolowanej i wyciętej aorty mogą pozwolić naukowcom na przeprowadzenie dalszych testów in situ i in vitro. Izolacja i wycięcie aorty ma to do siebie, że konieczne jest poświęcenie zwierzęcia, jednak w tym przypadku korzyści przewyższają szkody, ponieważ jest to najbardziej wszechstronna technika w badaniu chorób aorty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aorta odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego, zaopatrując organizm w natlenioną krew i podobnie jak inne części ciała, jest podatna na choroby. Do powszechnych chorób aorty należą miażdżyca i tętniak, które są wynikiem czynników genetycznych i środowiskowych, w tym diety, palenia tytoniu i siedzącego trybu życia1. Miażdżyca to odkładanie się płytki nazębnej na bazie wapnia i lipidów na ścianie aorty, zwykle występującej u pacjentów z przewlekłą hiperlipidemią2. Tętniaki charakteryzują się degradacją elementów strukturalnych aorty i ścieńczeniem ściany naczynia, a następnie zwiększoną średnicą, co ostatecznie może prowadzić do pęknięcia3.

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami używanymi do badania mechanizmu choroby i skuteczności potencjalnych metod leczenia. Typowe modele zwierzęce stosowane w badaniach sercowo-naczyniowych, w szczególności badania nad zaburzeniami naczyniowymi i metabolicznymi, obejmują genetycznie zmodyfikowane myszy w celu zmiany poziomu lipidów, takie jak nokaut genu apolipoproteiny E i myszy z nokautem genu receptora lipoprotein o niskiej gęstości4. Większość metod oceny mechanizmów choroby i skuteczności terapii obejmuje izolację i wycięcie aorty.

Gdy aorta zostanie zlokalizowana i odizolowana, można określić analizę morfometryczną, taką jak obecność tętniaka, zwykle definiowana jako wzrost średnicy większy niż 50%5. Po zakończeniu niezbędnej analizy in situ aorta może zostać wycięta do dalszej analizy. Wycięta aorta może zostać błyskawicznie zamrożona w celu przeprowadzenia badań molekularnych, takich jak testy ekspresji białek i/lub genów, lub utrwalona przy użyciu 4% paraformaldehydu, a następnie osadzona, pocięta i wybarwiona do analizy histologicznej. Analiza histologiczna aorty może wykazać wspólne cechy choroby aorty, takie jak degradacja strukturalna, tworzenie się blaszki miażdżycowej i naciekanie leukocytów6,7. Dodatkowo wycięta aorta może być wykorzystana do wyizolowania pierwotnych linii komórkowych, w tym komórek śródbłonka i mięśni gładkich, które można następnie wykorzystać do różnych badań in vitro 7.

Obecnie nie ma innych metod, które pozwoliłyby na dogłębną charakterystykę choroby aorty, a także dostarczyłyby badaczom narzędzi do dalszych badań nad chorobami układu krążenia. Metody obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa i ultrasonografia, są najbliższymi metodami morfologicznej oceny aorty, jednak jest to trudne u małych zwierząt, a uzyskanie urządzenia z odpowiednią technologią jest kosztowne8. Unieśmiertelnione linie komórkowe można zakupić w celu zbadania potencjalnych mechanizmów choroby i skuteczności terapii, jednak sztuczny charakter tych komórek ogranicza badanie wpływu na cykl życia komórki i apoptozę9.

Ogólnym celem tego manuskryptu jest pokazanie sterylnego izolowania i wycinania mysiej aorty w badaniu chorób sercowo-naczyniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Cincinnati oraz zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych z National Institutes of Health (Publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku).

1. Przygotowanie myszy

  1. Eutanazja polega na wystawieniu zwierzęcia na działanie supraterapeutycznej dawki środka znieczulającego, izofluranu wdychanego w celu uzyskania efektu. Zweryfikuj pierwotną eutanazję poprzez szczypanie palca u nogi jako szkodliwy bodziec. Wtórna metoda eutanazji, przecięcie przepony, nastąpi w nadchodzącym kroku. Możliwe jest zastosowanie metod alternatywnych, pod warunkiem że eutanazja zostanie uzyskana.
  2. Oczyść zewnętrzną powierzchnię myszy, spryskując futro wzdłuż brzucha, gdzie zostaną wykonane wstępne cięcia, 70% etanolem do punktu wilgoci, aby futro było mokre etanolem, a wszelkie luźne/suche włosy nie dostały się do regionu.
  3. Połóż mysz na desce chirurgicznej w pozycji leżącej na plecach z górnymi i dolnymi wyrostkami wysuniętymi na zewnątrz.
  4. Zabezpiecz przydatki do tablicy za pomocą taśmy chirurgicznej.

2. Izolacja serca i aorty

  1. Po prawidłowym ułożeniu myszy użyj kleszczy, aby zlokalizować i odizolować skórę brzucha tuż poniżej wyrostka mieczykowatego mostka.
  2. Stwórz napięcie, podnosząc skórę prosto do góry i użyj nożyczek, aby usunąć powierzchowną skórę, odsłaniając górną część otrzewnej i dolną część klatki piersiowej.
  3. Wejdź do jamy otrzewnej, unosząc wyrostek mieczykowaty i wykonując boczne nacięcia tuż poniżej wyrostka wzdłuż brzegów podżebrowych.
  4. Rozetnij w dół do jamy klatki piersiowej, przechodząc przez przeponę, uważając, aby nie uszkodzić serca ani żadnych głównych naczyń krwionośnych.
  5. Przedłuż boczne nacięcia wykonane w kroku 2.3 czaszki, aby usunąć przednią część klatki piersiowej. W razie potrzeby uwolnij serce od przedniej ściany klatki piersiowej za pomocą rozwarstwienia.
  6. Oczyść klatkę piersiową z obcej krwi i płynu za pomocą sterylnej gazy do wchłonięcia materiału. Gdy obszar będzie bardziej widoczny, usuń płuca, aby lepiej odsłonić serce i aortę.

3. Perfuzja serca i aorty

UWAGA: Aby pobrać krew poprzez nakłucie serca, zrób to tuż przed tym krokiem.

  1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml sterylnego, lodowatego roztworu buforu 1x fosforanowego (PBS) i przymocuj igłę o rozmiarze 25 do strzykawki.
  2. Delikatnie wbić igłę do lewej komory serca.
  3. Wytnij prawy przedsionek, aby złagodzić wzrost ciśnienia spowodowany perfuzją. Zawartość strzykawki należy wmieszać do myszy w ciągu 2 - 3 minut.
  4. Użyj sterylnej gazy przy otworze w prawym przedsionku, aby wchłonąć płyn perfuzyjny.

4. Izolacja i wycięcie aorty

  1. Po zakończeniu perfuzji użyj sterylnej gazy, aby wchłonąć pozostały płyn mętny w polu widzenia w jamie klatki piersiowej.
  2. Odsłonić treść przewodu pokarmowego, przecinając doogonowo ścianę brzucha, przedłużając nacięcie do obszaru nadłonowego. Przedłuż nacięcie dalej w kierunku kończyn dolnych obustronnie, aby utworzyć płaty skóry, które można przypiąć lub wyciąć.
  3. Usuń płaty wątroby, trzustki, żołądka, śledziony i jelit, aby lepiej uwidocznić aortę. Zachowaj ostrożność podczas preparowania w pobliżu okolicy okołonerkowej, ponieważ aorta jest powierzchowna w gałęziach tętnic nerkowych.
    UWAGA: Wykonaj ten krok w sposób precyzyjny i immatrykulacyjny, ponieważ przewód pokarmowy jest bogaty w bakterie, co zwiększa skłonność do zanieczyszczenia.
  4. Spłucz obszar 1x PBS i usuń cały płyn przez wchłonięcie sterylną gazą.
  5. Za pomocą sterylnych mikronożyczek i mikrokleszczyków oddziel aortę od kręgosłupa grzbietowo i brzusznie przełyku. Najlepiej jest użyć sekcji i użyć do tego mikroskopu preparacyjnego.
    UWAGA: Izolując aortę, zacznij doogonowo od rozwidlenia biodrowego i poruszaj się czaszkowo, oczyszczając i oddzielając aortę od grzbietowej powierzchni jamy lub zacznij czaszkowo od tętnic szyjnych i ramienno-głowowych rozwarstwiających się doogonowo. Każda z tych metod jest odpowiednia i zależy od komfortu badaczy.
  6. Usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową za pomocą cienkich mikronożyczek, uważając, aby nie usunąć części ściany aorty. Jest to niezbędne, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia fibroblastami podczas hodowli komórek mięśni gładkich aorty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zakończeniu procedury, pojawi się nienaruszona aorta wychodząca z serca, schodząca do klatki piersiowej i jamy brzusznej z nadal przyczepionymi tętnicami nerkowymi (Rysunek 1A). Stąd aortę można obrazować in situ w celu ilościowego określenia zmian morfometrycznych, które są diagnostyczne w badaniu tętniaków aorty brzusznej (ryc. 1B i 1C). Następnie aortę można usunąć, naprawić i wybarwić, aby przyjrzeć się zmianom histologicznym. Ogólnym i powszechnym zabarw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba aorty może prowadzić do znacznej patologii ogólnoustrojowej i możliwej śmierci w ciężkich przypadkach. Możliwości leczenia są obecnie ograniczone, dlatego konieczne jest kontynuowanie badań w tej dziedzinie10. Modele mysie są idealne do dalszego badania progresji choroby i potencjalnych opcji terapeutycznych4. W związku z tym pomyślne zakończenie metody opisanej w tym manuskrypcie zapewni badaczom narzędzia do pomiaru progresji choroby i skuteczności leków.

Techn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneMed-Vet International#RXISO-250
70% etanolFisher07-678-001
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma AldrichP5368-10PAK
Taśma chirurgiczna3M1527-1
Sterylna gazaDukal Corporations1312
Igła 25 gaugeBD
strzykawka 10 mlBD309604
305122

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193 (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142 (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5 (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88 (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289(2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45 (1), 192-198 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja aorty mysiejwyci cie aortybadanie chor b uk adu sercowo naczyniowegoods oni cie jamy klatki piersiowejperfuzja sol fizjologiczntechnika usuwania organ wwyci cie tkanki oko onaczyniowejzastosowanie mikroskopu stereoskopowegoprzygotowanie do analizy molekularnejizolacja pierwotnych kom rek

Powiązane artykuły