Tutaj opisujemy prosty test do ilościowego określenia reakcji na karmienie w hydrze wywołanej przez zredukowaną formę glutationu. Ten test polega na zmierzeniu odległości między wierzchołkowym końcem macki a ustami hydry.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar reakcji żywieniowej indukowanej glutationem u Hydry
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hydra jest jednym z najbardziej prymitywnych organizmów posiadających układ nerwowy i chemosensację do wykrywania zredukowanego glutationu (GSH) do chwytania zdobyczy. Ruch organizmów drapieżnych powoduje mechanosensoryczne wyładowanie komórek parzących zwanych nematocystami z hydry, które są wprowadzane do ofiary. Reakcja żywieniowa u hydry, która obejmuje zwijanie macek w celu sprowadzenia ofiary w kierunku ust, otwieranie ust i w konsekwencji pochłanianie ofiary, jest wywoływana przez GSH obecny w płynie uwalnianym z rannej ofiary. Aby móc zidentyfikować molekularny mechanizm reakcji na karmienie u hydry, który jest do tej pory nieznany, konieczne jest ustanowienie testu do pomiaru reakcji na karmienie. W tym miejscu opisujemy prostą metodę ilościowego oznaczania reakcji na karmienie, w której mierzy się odległość między wierzchołkowym końcem macki a ustami hydry i określa się stosunek takiej odległości przed i po dodaniu GSH. Stwierdzono, że stosunek, zwany względnym rozpiętością macek, jest miarą reakcji na karmienie. Test ten został zweryfikowany przy użyciu modelu głodu, w którym wygłodzone hydry wykazują zwiększoną reakcję na karmienie w porównaniu z hydrą karmioną codziennie.
Wprowadzenie
Hydra to najbardziej prymitywny organizm posiadający układ nerwowy i chemosensację do wykrywania zredukowanego glutationu (GSH) do chwytania zdobyczy1. Żywi się różnymi zwierzętami, takimi jak nicienie, skorupiaki, larwy owadów, kijanki i nowo wyklute ryby1. Ruch tych organizmów drapieżnych powoduje mechanosensoryczne wydzielanie z hydry parzących kapsułek zwanych nematocystami, które są wprowadzane do ofiary2. GSH obecny w płynie uwolnionym z rannej ofiary aktywuje następnie reakcję żywieniową w hydrze, która obejmuje zwijanie macek, aby sprowadzić ofiarę w kierunku ust, otwarcie ust i w konsekwencji pochłonięcie ofiary. Wykazano, że wiele cząsteczek, takich jak dopamina3, glutaminian4, GABA, glicyna5, receptory NMDA6 i allatotropina7, jest zaangażowanych w odpowiedź na karmienie u hydry. Wykazano również, że odpowiedź chemosensoryczna indukowana przez GSH jest modulowana przez stan żywienia zwierzęcia w taki sposób, że wygłodzona hydra wykazywała zwiększoną reakcję na karmienie1. Taki wzrost wrażliwości GSH jest biologicznie istotny, ponieważ w warunkach głodu hydra musi znaleźć swoją zdobycz z większą czułością.
Chociaż reakcja na karmienie wywołana przez GSH może być wyraźnie obserwowana pod mikroskopem, metody zazwyczaj używane do pomiaru obserwacji reakcji na karmienie są nieilościowe. W większości przypadków czas, w którym ujście hydry pozostaje otwarte, został przyjęty jako miara reakcji na karmienie8,9; podczas gdy w innym przypadku kwantyfikacja opierała się na liczbie hydr w populacji wykazującej reakcję na żerowanie10. Jednak obserwacja czasu otwierania ust polipów hydry jest uciążliwa i podlega wahaniom wywołanym niekontrolowanymi parametrami, takimi jak kierunek orientacji ust podczas obserwacji. Podobnie, ponieważ reakcja na karmienie jest parametrem ilościowym, podejścia populacyjne podlegają zmianom/błędom spowodowanym opinią lub błędem obserwacyjnym indywidualnego obserwatora. Aby obejść te problemy, opracowaliśmy metodę względnego oznaczania ilościowego reakcji na karmienie u hydry (Hydra vulgaris Ind-Pune11) w oparciu o odległość wierzchołkowego końca macki od ujścia polipa hydry.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla Hydra i pomiar reakcji żerowania
- Utrzymuj polipy hydry w kulturze, karmiąc je codziennie artemią i przetrzymując w medium (bufor Tris-HCl 1 mM, pH 7.6, NaCl 1 mM, CaCl2 1 mM, KCl 0,1 mM oraz MgSO4 0,1 mM) w szklanej misie w temperaturze 18 °C w cyklach 12 h światła / 12 h ciemności, zgodnie z wcześniejszym opisem12.
- W celu pomiaru reakcji żerowania przenieś jeden dojrzały polip hydry posiadający od 5 do 6 czułków do pojedynczego dołka płytki 24-dołkowej. Usuń pozostałe medium z dołka poprzez przechylenie płytki, a następnie niezwłocznie dodaj 500 µl świeżego medium.
- Przygotuj 9 µM roztwór glutationu w medium dla hydry. Ponieważ roztwór glutationu jest podatny na utlenianie, do każdego eksperymentu zawsze używaj świeżo przygotowanego roztworu glutationu.
- Przenieś płytkę na platformę obrazującą mikroskopu wyposażonego w funkcję rejestracji obrazu. Użyj ciemnego tła, aby zachowanie polipa hydry można było wyraźnie obrazować na kontrastowym tle.
- Pomieszczenie wykorzystywane do obserwacji i obrazowania zachowania hydry musi być wolne od światła o zmiennym natężeniu, przeciągów i hałasu. Takie zakłócenia mogą również spowodować kurczenie się czułków polipa hydry – nawet w przypadku braku glutationu.
- Pozostaw polip do rozluźnienia na 5 min.
- Upewnij się, że polip znajduje się w centralnej części dołka, tak aby jego zachowanie można było wyraźnie obrazować. Jeśli polip znajduje się przy krawędzi dołka, przesuń go do środka, przepłukując medium za pomocą pipety, a następnie ponownie pozostaw do rozluźnienia.
- Wykonaj zdjęcie hydry w stanie rozluźnienia. Będzie to obserwacja w punkcie czasowym zero.
- Szybko dodaj roztwór glutationu 9 µM, aby osiągnąć stężenie końcowe 3 µM w dołku. W zależności od celu eksperymentu i reakcji wykazanej przez hydrę, przetestuj zakres różnych stężeń glutationu i wybierz odpowiednie wymagane stężenie.
- Uruchom stoper natychmiast po dodaniu roztworu glutationu i wykonuj zdjęcia co 15-30 s przez 4-5 min. Nie zmieniaj ustawień powiększenia podczas obrazowania time-lapse.
- Dodawaj roztwór glutationu delikatnie i równomiernym strumieniem, tak aby pozycja zwierzęcia w dołku w polu widzenia mikroskopu była w minimalnym stopniu zaburzona. Jeśli jednak polip przemieści się znacząco po dodaniu roztworu glutationu, bardzo delikatnie przesuń płytkę, aby wprowadzić polip w pole widzenia w celu wykonania zdjęcia.
- W eksperymencie kontrolnym użyj medium pozbawionego glutationu, utrzymując wszystkie pozostałe parametry identycznie.
- Pamiętaj, aby wszystkie powyższe kroki eksperymentalne przeprowadzić w pierwszej połowie dnia – przed godziną 13:00, aby uniknąć możliwego wpływu rytmu okołodobowego na zakres reakcji żerowania.
- Otwórz każde z wykonanych zdjęć za pomocą programu GNU Image Manipulation Program (GIMP).
- Użyj narzędzia „Pomiar” (Measure) dostępnego w Menu > Narzędzia > Pomiar, aby wyznaczyć odległość między końcem apikalnym każdego z czułków a hypostomem. Jeśli na którymkolwiek z obrazów widoczny jest otwór gębowy, wyznacz odległość między środkiem otwartego otworu gębowego a końcem apikalnym czułka. Odległość tę określ jako rozpiętość czułka.
- Oblicz średnią rozpiętość czułków dla każdego polipa przed i po ekspozycji na glutation. Oblicz stosunek średniej rozpiętości czułków w punkcie czasowym zero do rozpiętości w każdym z kolejnych punktów czasowych. Stosunek ten zostanie nazwany względną rozpiętością czułków.
- Powtórz pomiary dla co najmniej 20 polipów.
2. Walidacja metody z wykorzystaniem modelu głodzenia
- W celu przeprowadzenia głodzenia przenieś kilka polipów hydry do oddzielnej szklanej miski i nie karm ich przez 5 dni. Grupę kontrolną składającą się z kilku polipów karm codziennie artemią w misce o podobnej wielkości. Codziennie wymieniaj medium w obu miskach eksperymentalnych, aby zapobiec wzrostowi grzybów w pożywce.
- W dniu eksperymentu karm grupę kontrolną hydr artemią przez 1 hr, a następnie wykorzystaj te hydry do kolejnych doświadczeń po usunięciu z medium całej niezjedzonej i martwej artemii.
- Zmierz reakcję żerową głodzących hydr w porównaniu z hydrami z grupy kontrolnej metodą opisaną wcześniej w kroku 1. Aby uniknąć błędu wynikającego z czasu obserwacji, pomiary każdego z głodzących i kontrolnych polipów hydry wykonuj naprzemiennie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Glutation powoduje u hydry zwijanie się czułków w kierunku otworu gębowego w celu pochwycenia zdobyczy. Takie zwijanie czułków przybliża ich końce apikalne do hypostomu. Skutkuje to zmniejszeniem rozpiętości czułków, czyli odległości liniowej między końcem apikalnym czułka a hypostomem (Rysunek 1). Względna rozpiętość czułków, czyli stosunek średniej rozpiętości czułków przed i po dodaniu glutationu, uśredniony dla wielu polipów, zmniejsza się w czasie. Względna rozpiętość czułków po dodaniu medium pozba...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zachowania żywieniowe u hydry reprezentują jeden z najbardziej pradawnych systemów chemosensorycznych u metazoanów. Chociaż obecność GSH w płynie skorupiaków uwolnionym po schwytaniu zdobyczy wspomaganej nematocystami została wykrytadawno temu1, ani białko GSHR, ani przypuszczalne geny kodujące nie zostały do tej pory scharakteryzowane na podstawie hydry. Podjęto niewiele prób scharakteryzowania białek wiążących GSH w hydrze8, 14, 15. Jednak tożsamość tych domniemanych białek receptorowych pozostaje...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni K. P. Madhu, Nicie Beliappie i pracownikom Centrum Medialnego Indyjskiego Instytutu Edukacji i Badań Naukowych w Pune za pomoc w produkcji filmu. Prace zostały wsparte przez finansowanie w ramach programu Centrum Doskonałości Departamentu Biotechnologii Rządu Indii dla SG oraz stypendium podoktorskie przez Departament Nauki i Technologii Rządu Indii dla RK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator z chłodzeniem | Panasonic | Mikroskop MIR-254-PE | |
| Leica | S8AP0 | ||
| Kamera do mikroskopu | Leica | EC3 | |
| Zredukowany glutation | Sigma | G4251 | Przechowywany w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed otwarciem doprowadź butelkę do temperatury pokojowej, aby uniknąć utleniania |
| Program do edycji obrazu | GIMP | w wersji 2.8 |
Bibliografia
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
