Nowa technika analizy ilościowej wypadania włosów u myszy z wykorzystaniem analizy w skali szarości

Podsumowanie

Łysienie jest powszechną formą wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym jako efekt uboczny chemioterapii. Opracowaliśmy metodę ilościowego określania wypadania włosów u myszy, wykorzystując standardowy obrazownik żelowy do przeprowadzenia analizy w skali szarości, aby ułatwić badanie obiecujących nowych terapii łysienia.

Streszczenie

Łysienie to powszechna forma wypadania włosów, która może wystąpić w wielu różnych stanach, w tym łysienie typu męskiego, zespół policystycznych jajników i łysienie plackowate. Łysienie może również wystąpić jako efekt uboczny chemioterapii u pacjentów z rakiem. W tym badaniu naszym celem było opracowanie spójnej i wiarygodnej metody ilościowego określania wypadania włosów u myszy, która pozwoli badaczom dokładnie ocenić i porównać nowe podejścia terapeutyczne dla tych różnych form łysienia. Metoda wykorzystuje standardowy obrazownik żelowy do uzyskiwania i przetwarzania obrazów myszy, mierząc absorpcję światła, która występuje w przybliżeniu proporcjonalnie do ilości czarnych (lub siwych) włosów na myszy. Dane, które zostały określone ilościowo w ten sposób, mogą być następnie analizowane przy użyciu standardowych technik statystycznych (tj. ANOVA, test T). Metodologia ta została przetestowana na mysich modelach łysienia wywołanego chemioterapią, łysienia plackowatego i łysienia spowodowanego woskowaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono szczegółowy protokół wykonywania tych pomiarów, w tym dane walidacyjne ze szczepów C57BL/6 i C3H/HeJ myszy. Ta nowa technika oferuje szereg korzyści, w tym względną prostotę aplikacji, poleganie na sprzęcie, który jest łatwo dostępny w większości laboratoriów badawczych, oraz zastosowanie obiektywnej, ilościowej oceny, która jest bardziej solidna niż oceny subiektywne. Poprawa w kwantyfikacji wzrostu włosów u myszy usprawni badanie modeli łysienia i ułatwi ocenę obiecujących nowych terapii w badaniach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Łysienie (wypadanie włosów) może być psychicznie i emocjonalnie niepokojącym wydarzeniem o wielu przyczynach. Łysienie typu męskiego jest najczęstszą przyczyną łysienia, dotykającą około dwóch trzecich mężczyzn w wieku 35 lat¹. Podobny wzorzec wypadania włosów można zaobserwować u kobiet z zespołem policystycznych jajników. W obu tych zaburzeniach wypadanie włosów jest zależne od androgenów. Łysienie może również występować jako choroba autoimmunologiczna, łysienie plackowate, które dotyka 1,7% populacji². Łysienie może wystąpić jako efekt uboczny niektórych metod leczenia, takich jak chemioterapia³. Wysoki odsetek (65-85%) pacjentów po chemioterapii doświadcza pewnego stopnia łysienia^4,5. Psychologiczne konsekwencje wypadania włosów zostały dobrze zbadane w warunkach chemioterapii. Łysienie wywołane chemioterapią może powodować stany lękowe, depresję, negatywny obraz ciała, obniżoną samoocenę i obniżone poczucie dobrego samopoczucia^6,7. Wysoki odsetek (47-58%) kobiet chorych na raka uważa wypadanie włosów za najbardziej traumatyczny aspekt chemioterapii, a do 8% odmawia leczenia z obawy przed wypadaniem włosów^4,6. Istnieją również dowody na łysienie androgenowe, które wspierają terapię w celu zmniejszenia psychologicznych, a nawet medycznych konsekwencji wypadania włosów^8,9. Podobnie, doniesiono, że łysienie plackowate ma poważne konsekwencje psychologiczne², a niejednolity charakter wypadania włosów może prowadzić do bardziej nieprzyjemnego efektu kosmetycznego niż większość innych przyczyn wypadania włosów.

Podczas gdy leki o łagodnym działaniu antyandrogennym (np. spironolakton) były stosowane z ograniczonym powodzeniem jako terapia łysienia, pierwszym skutecznym lekiem na łysienie był minoksydyl¹⁰. Ten lek przeciwnadciśnieniowy ma zaobserwowany efekt uboczny powodujący wzrost włosów i jest obecnie stosowany jako terapia miejscowa w wielu formach łysienia. Jednak odpowiedzi są często niepełne, a niektórzy badani wykazują jedynie spowolnienie wypadania włosów, a nie faktyczny odrost¹⁰. Finasteryd jest konkurencyjnym antagonistą 5α-reduktazy typu II, która blokuje konwersję testosteronu do dihydrotestosteronu, co skutkuje poprawą w łysieniu androgenowym kosztem częściowej ogólnoustrojowej blokady androgenów. Odsetek odpowiedzi na leczenie długoterminowe (10 lat) wynosi około 50%¹¹. Ogólnie rzecz biorąc, pomimo wielu badań w tej dziedzinie, nadal nie ma odpowiedniej terapii wypadania włosów.

Przez dziesięciolecia naukowcy i klinicyści badali metody pomiaru wzrostu włosów na skórze głowy w badaniach klinicznych. Wraz z opracowaniem leków leczących łysienie pojawiło się większe zapotrzebowanie na niezawodne, ekonomiczne i minimalnie inwazyjne metody pomiaru wzrostu włosów, a w szczególności odpowiedzi na terapię. Technologia analizy obrazu w celu precyzyjnego ilościowego określenia gęstości włosów u pacjentów z zaburzeniami wypadania włosów przyniosła spójne i ważne wyniki w przeszłości przy użyciu różnych technik, w tym analizy zdigitalizowanych obrazów¹², analizy obrazów poszczególnych włosów i zmian skórnych¹³ oraz skanowania mikroskopowego w celu ilościowego określenia masy włosów w określonym obszarze skóry głowy¹⁴ .

Niestety, podczas gdy powyższe metodologie zapewniły lepszą ocenę skuteczności interwencji wspomagających wzrost włosów w badaniach klinicznych, metody te nie zostały zastosowane w badaniach na gryzoniach w badaniach przedklinicznych. Naszym celem jest opracowanie spójnej i wiarygodnej metody ilościowego oznaczania wypadania włosów u myszy, która pozwoli badaczom na dokładniejszą ocenę i porównanie nowych podejść terapeutycznych dla różnych form łysienia. Opracowaliśmy metodologię wykorzystującą sprzęt łatwo dostępny w większości laboratoriów, który pozwoli na szybkie i wiarygodne ilościowe określenie gęstości włosów u myszy o brązowych lub czarnych włosach. Metodologia ta została przetestowana na mysich modelach łysienia wywołanego chemioterapią, łysienia plackowatego i łysienia spowodowanego woskowaniem. Przedstawiono szczegółowy protokół wykonywania tych pomiarów, w tym dane walidacyjne ze szczepów C57BL/6 i C3H/HeJ myszy. Ponieważ technika ta opiera się na wykrywaniu absorpcji światła z pigmentów w łodydze włosa, nie można jej używać do wykrywania wzrostu włosów u myszy białych lub albinosów.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach muszą być zatwierdzone przez IACUC danej instytucji (dla następujących danych, protokoły zostały zatwierdzone przez IACUC Montefiore, protokół #11-6-240 i #13-7-100). Zwierzętom zapewnia się lekkie znieczulenie, jak wskazano, wyłącznie w celu utrzymania ich w bezruchu podczas fotografowania, w przypadku tego protokołu nie są wymagane żadne bolesne procedury.

1. Pozyskiwanie zdjęć

1. Ustaw ostrość i pole widzenia dla imagera żelowego za pomocą papieru z wydrukowanym tekstem. Sprawdź jednorodność źródła światła w fotografowanym obszarze. Aby zapewnić jednolitość, do fotografii refleksyjnej należy używać imagera żelowego z wbudowanym źródłem światła. Nie należy używać źródła światła z transoświetleniem, ponieważ spowodowałoby to powstanie sylwetki zwierzęcia, która nie nadaje się do dalszej analizy w skali szarości.
   UWAGA: Spowoduje to nieznaczne rozmycie myszy, co zapewni optyczne uśrednianie w całym obszarze zainteresowania (ROI) i pomoże zmniejszyć błędy ilościowe dla bardzo małych (tj. <10 pikseli) obszarów zainteresowania. Ta niewielka korekta ostrości nie będzie miała wpływu na większe obszary zainteresowania, ani różnice w wielkości zwierzęcia nie będą miały na nie wpływu.
2. Znieczulanie zwierząt za pomocą ketaminy (100 mg/ml)/ksylazyny (20 mg/ml) (2:1), ponieważ zapewnia to szybki efekt znieczulenia i szybki powrót do zdrowia oraz jest optymalne do fotografowania wielu zwierząt.
   UWAGA: Znieczulenie jest potwierdzone, gdy zwierzę jest na tyle nieruchome, że można je sfotografować. Ponieważ zwierzęta zazwyczaj wracają do zdrowia po lekkim znieczuleniu w ciągu 10-15 minut, weterynarz nie zalecił stosowania maści do oczu.
3. Umieść znieczulone zwierzęta na obrazie żelowym w linii pionowej (jak najbliżej równoległej).
   1. W przypadku zdjęć grzbietowych należy umieścić zwierzęta w pozycji leżącej z wyciągniętymi kończynami.
   2. W przypadku zdjęć brzusznych należy układać zwierzęta w pozycji leżącej, uważając, aby zwierzęta nie były obrócone na boki.
4. Umieść standard skali szarości w fotografowanym regionie.
5. Zamknij drzwiczki dostępowe. Ważne: Światło otoczenia może powodować różnice w ekspozycji.
6. Ustaw wartość przysłony na ekspozycję, która umieszcza obszar zainteresowania w liniowym zakresie akwizycji (odczyt przysłony).
   UWAGA: Większość systemów wyświetla miejsca, w których obraz jest nasycony.
7. Zrób zdjęcie.
8. Zmień przysłonę na inne ustawienie ekspozycji, które umieszcza obszar zainteresowania w zakresie liniowym, zwiększając lub zmniejszając przysłonę o 1, tak aby zarówno norma, jak i obszar zainteresowania pozostały w liniowym zakresie akwizycji (wartość przysłony odniesienia).
9. Zrób zdjęcie.
10. Po zakończeniu fotografowania umieść zwierzęta na rozgrzewającym stole i monitoruj, aż będą w stanie utrzymać leżącą mostek. Wróć zwierzęta do ich klatek. Zwróć grupę zwierząt do wiwarium, gdy wszystkie zwierzęta w pełni wyzdrowieją.

2. Kwantyfikacja absorpcji światła

1. Zaznacz obszary zainteresowania na obrazach zwierząt za pomocą dostarczonego oprogramowania do obrazowania żelowego.
   1. W przypadku widoku grzbietowego całego zwierzęcia należy użyć prostokątnego lub owalnego obrazu rozciągającego się od kończyn górnych do kończyn dolnych, rozciągającego się na boki tak bardzo, jak to możliwe, tak aby żadna część pudełka nie wystawała poza grzbiet zwierzęcia, jak pokazano na rysunku 1A.
      UWAGA: Można również zaznaczyć obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego.
   2. Aby uzyskać widok brzuszny całego zwierzęcia, użyj 2 prostokątów: jednego zakrywającego obszar miednicy i jednego zakrywającego obszar klatki piersiowej, jak pokazano na rysunku 1B.
   3. W przypadku mniejszego obszaru zainteresowania, tj. miejsca podania leku, należy oznaczyć jako odpowiednie.
2. Zaznacz obszar (obszary) zainteresowania na standardzie absorpcji w skali szarości.
3. Zapisz absorpcję z każdego z zaznaczonych obszarów zainteresowania.

3. Analiza

Poziomy absorpcji uzyskane dla interesujących regionów mogą wymagać normalizacji do standardu tła dla porównania między zdjęciami. Zależność ekspozycji od absorpcji to logarytm (tj. zależność jest liniowa między logarytmem (ekspozycja) a logarytmem (absorpcja)). Korzystając z tej zależności, absorpcję obszaru zainteresowania można znormalizować do standardowej wartości tła, co pozwoli na bezpośrednie porównanie absorpcji między różnymi zdjęciami, w tym tymi wykonanymi w różnych punktach czasowych (tj. pomiary seryjne w ramach protokołu badania). Procedura wykonywania tych korekt jest szczegółowo opisana w opcjonalnych krokach 3.1 i 3.2.

1. (Opcjonalnie) Wykreśl krzywą logarytmu (ekspozycji) w funkcji logarytmu (absorpcji) przy użyciu wartości uzyskanych ze wzorca absorpcji w skali szarości.
2. (Opcjonalnie) Dostosuj do różnic w standardzie każdego zdjęcia w następujący sposób:
   1. Wybierz Przysłonę do odczytu (zgodnie z opisem w kroku 1.6) i wartość przysłony dla odniesienia (zgodnie z krokiem 1.8).
   2. Oblicz średnią absorpcję wzorca na wszystkich zdjęciach przy odczycie przysłony. Średnia ta jest wartością wzorca odniesienia (RSV).
   3. Obliczyć różnicę w absorpcji między ustawieniami przysłony odczytu i odniesienia na każdym zdjęciu dla normy (delta-S) i dla każdego zdefiniowanego ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ..... delta-ROI-X)
   4. Oblicz skorygowaną absorpcję dla każdego zwrotu z inwestycji w następujący sposób: Skorygowana absorpcja (ROI-X) = Absorpcja (ROI-X) przy odczycie F-stop + (RSV - absorpcja wzorca przy odczycie F-stop) * (delta-ROI-X /delta-S)
3. Kompilacja danych eksperymentalnych i przeprowadzanie analizy danych przy użyciu standardowych technik statystycznych dla zmiennych ciągłych (np. ANOVA, test T).

Wyniki

Ta technika została zweryfikowana przy użyciu myszy z implantem C3H/HeJ, mysiego modelu łysienia plackowatego¹⁶. U tych zwierząt rozwija się globalne wypadanie włosów, które postępuje stopniowo w czasie. Jednak wypadanie włosów występuje w postaci plam i może się różnić w zależności od myszy, co wprowadza znaczną zmienność i utrudnia oceny jakościowe. Model ten dał możliwość przetestowania korelacji między pomiarami gęstości optycznej w różnych miejscach myszy w celu oceny trafności.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono szczegółowy opis nowej techniki ilościowego określania wypadania włosów u gryzoni. Technika ta wykorzystuje do akwizycji i analizy obrazu obrazowanie żelowe, sprzęt, który jest łatwo dostępny w większości laboratoriów. Wykazano, że pomiary są odporne na niewielkie zmiany w technice (ryc. 4-5) i są dobrze skorelowane ze stopniem wizualnego wypadania włosów w modelach leczenia (ryc. 6). Techniki te zostały z powodzeniem zastosowane w oce...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System obrazowania KODAK Gel Logic 100	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Żelowy imager do uzyskiwania i analizowania zdjęć, musi mieć wbudowane źródło światła do fotografii refleksyjnej.
Skala szarości Kodak/Tiffen Q-13