Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Summary

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Abstract

W inżynierii tkankowej pożądane jest wykazywanie przestrzennej kontroli morfologii tkanek i losu komórek w hodowli w skali mikronów. Do realizacji tego zadania można wykorzystać substraty hodowlane z szczepionymi szczotkami z poli(glikolu etylenowego) (PEG) poprzez tworzenie mikroskalowych, nieporostowych i odpornych na adhezję komórek regionów, a także regionów, w których komórki uczestniczą w biospecyficznych interakcjach z kowalencyjnie uwiązanymi ligandami. Aby zaprojektować złożone tkanki przy użyciu takich substratów, konieczne będzie sekwencyjne modelowanie wielu szczotek PEG funkcjonalnych w celu nadania zróżnicowanej bioaktywności i ustawionych w orientacjach w mikroskali, które naśladują nisze in vivo. Druk mikrokontaktowy (μCP) jest wszechstronną techniką modelowania takich szczepionych szczotek PEG, ale ręcznego μCP nie można wykonać z precyzją w mikroskali. W związku z tym połączyliśmy zaawansowaną robotykę z technikami miękkiej litografii i pojawiającymi się reakcjami chemii powierzchni, aby opracować metodę wspomaganą przez zrobotyzowany druk mikrokontaktowy (R-μCP) do wytwarzania substratów kulturowych ze złożonymi, mikroskalowymi i wysoce uporządkowanymi wzorami szczotek PEG prezentujących ortogonalną chemię "klik". W tym miejscu szczegółowo opisujemy przebieg produkcji takich podłoży.

Introduction

Zdolność powierzchni szczepionych PEG do wyświetlania kowalencyjnie związanych biochemicznych ligandów przy jednoczesnym zachowaniu naturalnych właściwości zapobiegających zarastaniu, czyni je idealnym wyborem do projektowania niestandardowych środowisk mikroskalowych na podłożach hodowlanych^1,2,3. Interakcje biospecyficzne, w których pośredniczą sprzężone z ligandami szczotki PEG, umożliwiają redukcjonistyczną analizę wpływu sygnałów biochemicznych znajdujących się w złożonych mikrośrodowiskach tkanek in vivo na poszczególne fenotypy komórek. Co więcej, bioortogonalne chemie "klik" mogą być stosowane w celu ułatwienia kierunkowego unieruchomienia ligandów, tak aby były one prezentowane w natywnych konformacjach^4-6. Tak więc przestrzenne wzorce szczotek PEG w mikroskali są wszechstronnym narzędziem do tworzenia designerskich nisz in vitro do badania sygnalizacji komórkowej indukowanej przez unieruchomione sygnały biochemiczne^6,7.

Powszechna metoda generowania przestrzennych wzorów sygnałów biochemicznych polega na drukowaniu mikrokontaktowym (μCP) na podłożach pokrytych złotem z wzorami sprzężonych z PEG alkanetioli. Następnie, mikrowzorzyste, samoorganizujące się monowarstwy (SAM) alkanetioli peg-ylowanych ogranicza fizyczną adsorpcję cząsteczek biochemicznych, np. białek, tylko do niewzorzystych regionów substratu^8,9. Jednak SAM generowane tą techniką są wrażliwe na utlenianie w długoterminowych pożywkach do hodowli komórkowych. W związku z tym alkanetiotiolowe SAM μCP są często dalej szczepione szczotkami polimerowymi PEG przy użyciu inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (SI-ATRP) w celu zwiększenia stabilności regionu bez zanieczyszczeń¹⁰. W szczególności μCP inicjatora polimeryzacji alkanetiolu, bromoizomaślanu ω-meraptoundecylu, na powierzchniach pokrytych złotem, a następnie monomerów SI-ATRP metakrylanu eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (PEGMEMA) generuje powierzchnie z długotrwałymi, stabilnymi i niebrudzącymi szczotkami PEG z mikrowzorami. Co więcej, mogą one być dalej modyfikowane w celu przedstawienia różnych ugrupowań chemicznych¹¹.

Korzystając z tej właściwości, Sha et al. opracowali metodę inżynierii substratów kulturowych za pomocą wieloskładnikowych szczotek PEGMEMA prezentujących ortogonalne "klik" chemii. W tej metodzie wykorzystują serię etapów μCP / SI-ATRP przeplatanych sekwencyjnymi podstawieniami nukleofilowymi azydku sodu, etanoloaminy i propargyloaminy w celu stworzenia substratów hodowlanych prezentujących mikroskalowe wzory wielu immobilizowanych ligandów⁶. Chociaż potencjał wykorzystania takich substancji chemicznych w połączeniu z ręcznym μCP do inżynierii nowych substratów hodowlanych jest ogromny, jest on ograniczony przez precyzję i dokładność, z jaką można dostosować wiele kroków μCP do jednego podłoża. Do powtarzalnego wytwarzania złożonych nisz in vitro przy użyciu tych wszechstronnych technik wymagany byłby wysoki poziom precyzji i dokładności.

Aby rozwiązać ten problem, wygenerowano kilka zautomatyzowanych i półautomatycznych systemów μCP. Czakra i wsp. opracowano system μCP, w którym niestandardowe stemple są umieszczane na systemie szynowym i doprowadzane do konforemnego kontaktu z pozłacanymi szkiełkami za pomocą sterowanego komputerowo siłownika pneumatycznego. Jednak metoda ta wymaga precyzyjnego wytwarzania niestandardowych projektów stempli i podaje precyzję 10 μm bez raportu o dokładności osiągniętej podczas wykonywania wielu kroków μCP¹². Niedawno metoda wykorzystująca zintegrowany system sprzęgania kinematycznego wykazała precyzję poniżej 1 μm przy użyciu pojedynczego wzoru, ale nie była w stanie dokładnie wyrównać wielu wzorów z powodu braku precyzyjnej kontroli cech stempla od formy^{do formy 13}. Ponadto obie poprzednie metody wymagają, aby podłoże pozostało nieruchome między etapami modelowania, co znacznie ogranicza różnorodność chemii modyfikacji powierzchni, które można wykorzystać. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowany system R-μCP zdolny do dokładnego i precyzyjnego wyrównania wielu kroków μCP, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność w projektowaniu i produkcji stempli. Co więcej, wzorzyste podłoża mogą być wielokrotnie usuwane z systemu między tłoczeniami, co pozwala na stosowanie różnych substancji chemicznych modyfikacji substratów, w tym sekwencyjnych podstawień nukleofilowych. Substraty zmodyfikowane przy użyciu takich substancji chemicznych były wcześniej używane do hodowli komórkowych zarówno przez nas^6,14, jak i innych⁷. W związku z tym połączyliśmy R-μCP i sekwencyjne reakcje substytucji nukleofilowej, aby opracować metodę skalowalnej produkcji substratów hodowlanych ze złożonymi i mikrowzorcowymi wskazówkami biochemicznymi.

Protocol

1. Generowanie stempli elastomerowych

1. Aby wygenerować wzorce krzemowe stempla PDMS, zaprojektuj wzory funkcji fotomaski za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo.
   1. Zaprojektuj pierwszy wzór jako układ pierścieni o wymiarach 20 x 20 o średnicy wewnętrznej (ID) 300 μm i średnicy zewnętrznej 600 μm z odstępami od środka do środka 1 200 μm.
   2. Zaprojektuj drugi wzór jako układ pierścieni 20 x 20 z średnicą wewnętrzną 600 μm i średnicą zewnętrzną 900 μm z odstępami od środka do środka 1 200 μm.
   3. Dodatkowo umieść 1 x 1 mm² kwadratowe znaczniki odniesienia we wszystkich czterech rogach każdego projektu tablicy, oddalone od środka o 1 200 μm od środka do środka od wzoru narożników pod kątem 45°.
   4. Wyprodukuj wzorce krzemowe do użycia w tym eksperymencie ze współczynnikami proporcji 1:1, korelując z głębokością cech 300 μm przy użyciu standardowych technik litografii opisanych w innym miejscu¹⁵ lub we współpracy z odlewnią mikroprzepływową.
      UWAGA: Głębokość elementu mniejsza niż 100 μm może prowadzić do nieprawidłowych deformacji stempli przed kontaktem z powierzchniami podłoża.
      UWAGA: Protokół ten rozpoczyna się od uzyskania już wzorców krzemowych z opisanymi wzorami fotorezystu, co wymaga specjalistycznego sprzętu i czystych pomieszczeń do stworzenia. Najlepiej skonsultować się z producentem lub głównym zakładem, aby stworzyć tych wzorzystych mistrzów.
2. Krzem silanizowany masteruje O/N przez inkubację z parą (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrookty) trichlorosilanu.
   UWAGA: Opary silanu są wysoce toksyczne i należy z nimi obchodzić się wyłącznie w wyciągach chemicznych.
3. Stwórz odwrotne repliki wzorców krzemowych, utwardzając prepolimer PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1 na wierzchu silanizowanych wzorców krzemowych na szalce Petriego O/N w temperaturze 60 °C.
4. Usuń stemple PDMS z wzorców silikonowych i przyklej je do podłoża akrylonitryl-butadien-styren (ABS) lub innych sztywnych materiałów za pomocą kleju.
   UWAGA: Wybrany materiał nie musi być przezroczysty ani biokompatybilny. Musi jednak zapewniać płaską powierzchnię do połączenia z oprzyrządowaniem robota i większą sztywność niż PDMS.

2. Przygotowanie slajdów na okładkę

1. Szkiełka podstawowe mikroskopu (24 mm x 50 mm #1) płukać w toluenie, metanolu i sonikować w acetonie przez 1 minutę, a następnie spłukać etanolem i wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu.
   UWAGA: Z toluenem i acetonem należy obchodzić się tylko w dygestoriach chemicznych.
2. Pokryj szkiełka nakrywkowe tytanem (Ti) o długości fali ~3,5 nm, a następnie złotem (Au) o długości fali 18,0 nm za pomocą parownika ze skupioną wiązką elektronów.
   UWAGA: Ta procedura jest kompatybilna z różnymi podłożami pokrytymi złotem, w tym silikonem i polistyrenem. Chociaż możliwe jest wytwarzanie tych podłoży na miejscu, pozłacane podłoża są również dostępne za pośrednictwem dostawców komercyjnych.
   UWAGA: Warstwy Ti powinny mieć grubość co najmniej 3 nm, podczas gdy warstwy Au na podłożach powinny mieć grubość co najmniej 5 nm i mogą mieć grubość do 1 mm w zależności od idealnych właściwości optycznych końcowego podłoża^16,17. Podłoża nie muszą być optycznie przezroczyste do produkcji; Ułatwia jednak analizę mikroskopową wytworzonych podłoży.
3. Pokryte złotem szkiełka nakrywkowe spłukać etanolem i wysuszyć pod delikatnym azotem bezpośrednio przed użyciem.

3. R-μCP zewnętrznego pierścienia

Przed przystąpieniem
1. do pracy z R-μCP z selektywnie zgodnym przegubowym ramieniem robota (SCARA) należy skalibrować zrobotyzowane efektory narzędziowe i towarzyszące im systemy podwójnej kamery za pomocą oprogramowania systemu.
   UWAGA: Te narzędzia są pokazane na rysunku 1.

Rysunek 1. System R-μCP i oprzyrządowanie ramienia robota. (A) Widok w dużej skali systemu R-μCP ze wszystkimi narzędziami i osprzętem, (a) uchwytem próżniowym, (b) kąpielą odczynnika, (c) kamerą skierowaną w dół, (d) uchwytem do zagnieżdżania stempli, (e) narzędziem robotycznym. (B) Oprzyrządowanie ramienia robota przedstawiające (f) narzędzie do trawienia z diamentową końcówką i (g) pneumatyczne narzędzie ssące z (h) stemplem PDMS z ABS.

2. Ręcznie umieść stempel PDMS z identyfikatorem 600 μm i wystającym pierścieniem o średnicy zewnętrznej 900 μm skierowaną w dół w uchwycie do zagnieżdżania stempla. Ręcznie umieść świeżo oczyszczone, pokryte złotem szkiełko nakrywkowe na uchwycie próżniowym, pokazanym na rysunku 1A, i unieruchom, używając podłączonego odkurzacza laboratoryjnego.
3. Za pomocą elementów sterujących robota ustaw kamerę skierowaną w dół nad środkowym punktem pokrytego złotem szkiełka nakrywkowego, jak pokazano na rysunku 2A.
   UWAGA: Punkt ten można początkowo określić za pomocą oględzin i nie wymaga dużej dokładności, ponieważ stempel PDMS jest znacznie większy niż szkiełko pokryte złotem.
4. Poinstruuj ramię robota, aby wytrawiło cztery znaki odniesienia "X" na wierzchołkach kwadratu o wymiarach 3.8 mm na 3.8 mm wyśrodkowanego na pokrytym złotem szkiełku nakrywkowym za pomocą narzędzia do trawienia z diamentową końcówką przymocowanego do ramienia robota. (Przedstawione na rysunku 2B; ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
   UWAGA: Dzięki temu wszystkie cztery znaczniki odniesienia znajdują się w jednej ramce wizualnej kamery skierowanej w dół.
5. Za pomocą pneumatycznego oprzyrządowania ssącego robota podnieś i przytrzymaj stempel PDMS 1 mm powyżej uchwytu do zagnieżdżania stempli, jak pokazano na rysunku 2C. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
6. Korzystając z kamery skierowanej do góry i pierścienia oświetlenia LED pokazanego na rysunkach 2D i E, zwizualizuj kwadratowe znaczniki odniesienia stempla i zidentyfikuj je 10 razy za pomocą oprogramowania kamery, aby określić średnie przesunięcie X, Y i kątowe stempla od środka osi oprzyrządowania robota. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
7. Podobnie jak na rysunku 2A, użyj kamery skierowanej w dół, aby 10 razy zobrazować i wykryć wytrawione znaki odniesienia na szkiełku osłonowym, aby określić średnie położenie X, Y środka prowadnicy i przesunięcie kątowe od środka osi oprzyrządowania robota. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES).
   UWAGA: Oprogramowanie systemu robotycznego przeprowadza wewnętrzne obliczenia w celu precyzyjnego wyrównania położenia X, Y i przesunięć kątowych stempla i szkiełka nakrywkowego w przyszłych krokach R-μCP.
8. 3.8) Umieścić stempel w kąpieli alkanetiolowego inicjatora ATRP, ω-merkaptoundecylu bromoizomaślanu (2 mM w etanolu), jak pokazano na rysunku 2F. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
9. Usuń stempel z roztworu alkanetiolu i umieść go nad strumieniem azotu pod ciśnieniem 0,48 bara (5 psi) w celu odparowania etanolu, jak pokazano na rysunku 2G. Po 1 minucie wzrost ciśnienia strumienia azotu wynosi 1,03 bara (15 psi), aby zapewnić równomierne wysuszenie. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
   UWAGA: Niepełne wyschnięcie spowoduje całkowitą lub częściową utratę wierności wzoru.
10. Po wyschnięciu przesunąć stempel nad obliczone położenie środkowe szkiełka pokrytego złotem i opuścić go w krokach co 100 μm, monitorując siłę silnika osi Z, jak pokazano na rysunku 2H.
    UWAGA: Jest to komunikowane jako moment obrotowy odczuwany przez silnik osi Z i wyświetlane w oprogramowaniu do prowadzenia robota. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)
11. Przestań opuszczać stempel po osiągnięciu ustalonego ciśnienia 79,2 kPa i utrzymuj kontakt z pozłacanym suwakiem przez 15 sekund. (PROCES ZAUTOMATYZOWANY)
    UWAGA: Wartości ciśnienia w tym miejscu są zoptymalizowane pod kątem aktualnego projektu stempla i wysokości elementu. Jeśli projekt stempla zostanie zmieniony, szczególnie w przypadku stempli o wysokim współczynniku proporcji, należy go odpowiednio dostroić metodą prób i błędów.
12. Powoli wyjmij stempel z pokrytego złotem szkiełka i umieść stempel z powrotem w uchwycie do zagnieżdżania stempla. (ZAUTOMATYZOWANY PROCES)

4. SI-ATRP firmy PEGMEMA na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych

1. Uwolnić podciśnienie przytrzymujące szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem i przenieść je do kolby Schlenka o pojemności 50 ml. Uszczelnić i odgazować kolbę Schlenka za pomocą pompy próżniowej.
2. Dodać 5,5 ml mieszaniny reakcyjnej ATRP zawierającej makromonomer PEGMEMA (208,75 mmol), wodę (34,4 ml), metanol (43,8 ml), bromek miedzi(II) (1 mmol) i 2',2-bipirydynę (3 mmol) do kolby Schlenka.
3. Dodać 0,5 ml askorbinianu L-sodu (454,3 mM) do wody, aby zainicjować reakcję i pozostawić ją do kontynuowania przez 16 godzin w temperaturze pokojowej w atmosferze gazu obojętnego.
   UWAGA: Po dodaniu askorbinianu L-sodu kolor reakcji zmieni się z jasnozielonego na ciemnobrązowy, jak pokazano na rysunku 3A-B.
   UWAGA: Reakcja może trwać dłużej niż 16 godzin, ale nie zwiększy znacząco długości szczotek PEG.

Rysunek 3. Rozpoczęcie SI-ATRP. (A) Rozpoczęcie reakcji i (B) następująca zmiana koloru po dodaniu askorbinianu L-sodu. (C) Obraz mikroskopowy mikrowzorzystej powierzchni szkiełka nakrywkowego zgodnie z procedurą SI-ATRP. Podziałka liniowa 1 mm.

4. Wyjąć szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem z kolby Schenka, spłukać etanolem, wodą i etanolem i wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu.
   UWAGA: Po SI-ATRP modyfikacje powierzchni powinny być widoczne dla oka i mogą być obrazowane i analizowane pod mikroskopem, jak pokazano na rysunku 3C.
   UWAGA: Jest to najprostsza metoda testowania precyzji badania, ponieważ eliminuje potrzebę barwienia immunologicznego substratów.

5. Funkcjonalizacja azydku mikrowzorcowych łańcuchów PEGMEMA

1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
2. Dodać 6 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) zawierającego 100 mM azydku sodu do fiolki reakcyjnej. Utrzymać tę reakcję w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   UWAGA: Z DMF należy obchodzić się tylko w dygestoriach chemicznych. Zachowaj ostrożność podczas ważenia azydku sodu.
3. Po zakończeniu wyjąć szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem z fiolki reakcyjnej i spłukać etanolem, a następnie wodą i wysuszyć pod strumieniem azotu.

6. Pasywacja łańcuchów PEGMEMA funkcjonalizowanych bromem

1. Umieścić mikrowzorzyste szkiełko nakrywkowe w szklanych fiolkach reakcyjnych o pojemności 20 ml.
2. Dodać 6 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego 100 mM etanoloaminy i 300 mM trietyloaminy do fiolki reakcyjnej. Utrzymywać tę reakcję w temperaturze 40 °C przez 24 godziny.
   UWAGA: Z DMSO, etanoloaminą i trietyloaminą należy obchodzić się wyłącznie w dygestoriach chemicznych.
3. Po zakończeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem z fiolki reakcyjnej, spłucz etanolem, a następnie wodą i wysusz pod strumieniem azotu.

7. R-μCP pierścienia wewnętrznego i SI-ATRP PEGMEMA

1. Wykonaj kroki R-μCP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.2 i 3.6 – 3.12, zastępując stempel PDMS wystającym pierścieniem o średnicy wewnętrznej 300 μm i średnicy zewnętrznej 600 μm, tak aby pierścienie o mniejszych cechach zostały umieszczone wewnątrz wcześniej zmikrowzorowanego pierścienia.
   UWAGA: Próg ciśnienia dla tego stempla wynosi 132,0 kPa. Jak wspomniano wcześniej, te ustawienia nacisku są zoptymalizowane pod kątem funkcji stempla używanych w tym eksperymencie.
2. Wykonaj kroki SI-ATRP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 4.1 – 4.4.

8. Funkcjonalizacja acetylenu w mikrowzorzystych łańcuchach PEGMEMA

1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
2. Dodać 6 ml DMSO zawierającego 100 mM propargyloaminy do fiolki reakcyjnej. Utrzymuj tę reakcję w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
   UWAGA: Z DMSO i propargyloaminą należy obchodzić się tylko w wyciągu chemicznym.
3. Po zakończeniu wyjmij szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem z fiolki reakcyjnej i spłucz etanolem, a następnie podlej i wysusz pod strumieniem azotu.

9. Katalizowana miedzią biotynylacja łańcuchów PEGMEMA zakończonych acetylenem

1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
2. Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml siarczanu miedzi (15 mM) / tris[(1-benzylo-1 H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (TBTA, 30 mM) (1:1 v/v woda/DMF) zawierającej 562 μM koniugat azydek-PEG_4-biotyna. Dodać 1,2 ml kwasu L-askorbinowego (0,15 mM) w wodzie do mieszaniny, aby zainicjować reakcję.
3. Azot należy przepuszczać przez roztwór reakcyjny przez 10 sekund, zamknąć fiolkę Parafilmem i reagować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Po zakończeniu wyjąć z fiolki reakcyjnej szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem, spłukać wodą i umieścić w 12-dołkowym naczyniu z polistyrenu.

10. Immunofluorescencyjne wykrywanie biotynylowanych grup acetylenowych

1. Blokuj mikrowzorzyste szkiełko nakrywkowe w DPBS (3% surowica osła) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Barwienie biotynylowanych grup acetylenowych koniugatem Streptawidyny-546 (2 μg/ml) w DBPS (3% surowica osła w PBS) przez 2 godziny w RT.
2. Spłucz szkiełko nakrywkowe z mikrowzorem 5 razy DPBS przez 10 minut, delikatnie mieszając.
   UWAGA: Rysunek 4B przedstawia obraz slajdu po zakończeniu tego kroku.

11. Bezmiedziowa biotynylacja łańcuchów PEGMEMA zakończonych azydkiem

UWAGA: Jeśli jest to pożądane, ten etap modyfikacji substratu może być wykonany in situ podczas hodowli komórkowej.

1. Pozostaw mikrowzorzyste szkiełko nakrywkowe w 12-dołkowym naczyniu z polistyrenu po spłukaniu DBPS.
2. Dodać 2 ml DBPS (lub pożywki do hodowli komórkowych) zawierającej 20 μM DBCO-PEG 4-Biotyny i pozostawić tę reakcję do kontynuowania przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (lub w temperaturze 37 °C w inkubatorze).
3. Po zakończeniu spłucz mikrowzorzyste szkiełko nakrywkowe 5 razy za pomocą DPBS (lub po prostu dokonaj wymiany nośnika).

12. Immunofluorescencyjne wykrywanie biotynylowanych grup azydku

1. Barwienie biotynylowanych grup azydków koniugatem Streptawidyny-488 (2 μg/ml) w 2 ml DPBS (3% surowicy osła) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
2. Spłucz mikrowzorzyste szkiełko nakrywkowe 5 razy w DPBS przez 10 minut, delikatnie mieszając.
3. Obraz mikrowzorzystego szkiełka nakrywkowego przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Rysunek 4A-C przedstawia obrazy slajdu po zakończeniu tego kroku.
   UWAGA: W przypadku stosowania substratów do testów hodowli tkankowych należy pominąć sekcje 10 i 12 niniejszego protokołu. Po osiągnięciu pożądanego stopnia funkcjonalizacji wysterylizuj zaprojektowane szkiełko nakrywkowe, spłukując obie strony 100% etanolem i susząc pod strumieniem azotu. Przenieść szkiełko do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i przepłukać szkiełko PBS pięć razy przed przystąpieniem do wysiewu komórek i hodowli.

Results

Użycie technik ręcznego wyrównywania μCP do inżynierii substratów kulturowych z szeregami szczotek szczepionych PEG, funkcjonalizowanych ortogonalnymi środkami chemicznymi typu "klik", zostało zademonstrowane w poprzedniej pracy⁶. Zapewnia to jednak minimalną kontrolę nad orientacją wzoru i często powoduje nakładanie się funkcjonalizowanych obszarów. W tym przypadku zastosowano nowatorski system R-μCP w celu przezwyciężenia tego ograniczenia, a jego zdolność do dokładnego modelowania układu pierścieni szczotko...

Discussion

Idealne podłoża dla inżynierii tkankowej byłyby inspirowane biologicznie, a tym samym odzwierciedlałyby rozkład przestrzenny krytycznych bioaktywnych ligandów znajdujących się w tkankach natywnych. Posiadałyby one również dynamiczne właściwości, które umożliwiają czasowe dostosowanie ligandów i wzorców przestrzennych, w których są prezentowane, aby umożliwić ukierunkowaną morfogenezę tkanek i przestrzennie ograniczoną indukcję losu komórki. Wytwarzanie takich substratów wymaga unieruchomienia wielu sygnałów biochemicznyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	W razie potrzeby dostępne są modele z wyższej półki o zwiększonej precyzji.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilan	Gelest	SIT8174.0	UWAGA, Należy obchodzić się wyłącznie w wyciągu chemicznym. Podczas silanizacji wafli nikt nie powinien wchodzić do okapu, dopóki cały silan nie zostanie odparowany.
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Dokładnie odgazuj roztwory poprzez wystawienie na działanie próżni przed użyciem. Dopuszczalne są alternatywne zestawy, takie jak Kit 182.
Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mm #1	Fisher Scientific	48393106	Można je kupić od wielu dostawców o różnych wymiarach, w zależności od potrzeb.
CHA-600 Telemark Parownik wiązki elektronów	Telemark	SEC-600-RAP	Wymaga specjalistycznego szkolenia.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST&
omega;-mertcaptoundecyl bromoisomaslan	Prochimia	FT 015-m11-0,2	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Inne inicjatory ATRP mogą być używane jako ten R-μ Platforma CP ma zastosowanie do wszystkich modalności mikromodelowania.
Kolba rurkowa Schlenk 50 ml	Synthware	60003-078	Wymaga gumowych korków z membraną.
Metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego)	Sigma Aldrich	447943	Shipping, zawierający gotowe inhibitory wolne od MEHQ i BHT.
Metanol (certyfikowany ACS)	Fisher Scientific	A412-4	UWAGA, należy obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
Bromek miedzi(II)	Sigma Aldrich	437867	UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
2,2'-Bipirydyna	Sigma Aldrich	D216305	UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
L-askorbinian sodu	Sigma Aldrich	A4034
20 ml fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego	Fisher Scientific	03-340-4E
Azydek sodu	Sigma Aldrich	S2002	UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
N,N-dimetyformamid	Sigma Aldrich	227056	UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w wyciągach chemicznych.
Etanoloamina	Sigma Aldrich	398136	UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	UWAGA, obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
Dimetylosulfotlenek	Sigma Aldrich	276855	UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
Azide-PEG3-Biotyna	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilizowany w DMF
Siarczan miedzi(II)	Sigma Aldrich	C1297	UWAGA, ogranicz ekspozycję maską chirurgiczną.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
Kwas L-askorbinowy	Sigma Aldrich	A7506
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna	Invitrogen	14190144
Surowica osła	Sigma Aldrich	D9663	Przedmioty zanieczyszczone surowicą osła są uważane za materiał niebezpieczny biologicznie i należy je odpowiednio zutylizować. Różne inne związki (np. BSA) są dostępne i służą temu celowi.
12-dołkowa płyta polistyrenowa	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Płyty można kupić u wielu dostawców o różnych wymiarach.
DBCO-PEG4-Biotyna	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilizowany w DMF
Streptawidyna, Alexa Fluor 488 Sprużone	życia	S-11223	Rozpuszczane w PBS
Streptawidyna, Alexa Fluor 546 sprużone	Life Technologies	S-11225	Rozpuszczone w PBS
Mikroskop konfokalny Nikon Nikon Eclipse		Ti, A1R	Mikroskop epifluorescencyjny jest wystarczający do zobrazowania funkcjonalizowanych podłoży mikrowzorcowych.