Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52186

⸱

31 października 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Streszczenie

W inżynierii tkankowej pożądane jest wykazywanie przestrzennej kontroli morfologii tkanek i losu komórek w hodowli w skali mikronów. Do realizacji tego zadania można wykorzystać substraty hodowlane z szczepionymi szczotkami z poli(glikolu etylenowego) (PEG) poprzez tworzenie mikroskalowych, nieporostowych i odpornych na adhezję komórek regionów, a także regionów, w których komórki uczestniczą w biospecyficznych interakcjach z kowalencyjnie uwiązanymi ligandami. Aby zaprojektować złożone tkanki przy użyciu takich substratów, konieczne będzie sekwencyjne modelowanie wielu szczotek PEG funkcjonalnych w celu nadania zróżnicowanej bioaktywności i ustawionych w orientacjach w mikroskali, które naśladują nisze in vivo. Druk mikrokontaktowy (μCP) jest wszechstronną techniką modelowania takich szczepionych szczotek PEG, ale ręcznego μCP nie można wykonać z precyzją w mikroskali. W związku z tym połączyliśmy zaawansowaną robotykę z technikami miękkiej litografii i pojawiającymi się reakcjami chemii powierzchni, aby opracować metodę wspomaganą przez zrobotyzowany druk mikrokontaktowy (R-μCP) do wytwarzania substratów kulturowych ze złożonymi, mikroskalowymi i wysoce uporządkowanymi wzorami szczotek PEG prezentujących ortogonalną chemię "klik". W tym miejscu szczegółowo opisujemy przebieg produkcji takich podłoży.

Wprowadzenie

Zdolność powierzchni szczepionych PEG do wyświetlania kowalencyjnie związanych biochemicznych ligandów przy jednoczesnym zachowaniu naturalnych właściwości zapobiegających zarastaniu, czyni je idealnym wyborem do projektowania niestandardowych środowisk mikroskalowych na podłożach hodowlanych1,2,3. Interakcje biospecyficzne, w których pośredniczą sprzężone z ligandami szczotki PEG, umożliwiają redukcjonistyczną analizę wpływu sygnałów biochemicznych znajdujących się w złożonych mikrośrodowiskach tkanek in vivo na poszczególne fenotypy komórek. Co więcej, bioortogonalne chemie "klik" mogą być stosowane w celu ułatwienia kierunkowego unieruchomienia ligandów, tak aby były one prezentowane w natywnych konformacjach4-6. Tak więc przestrzenne wzorce szczotek PEG w mikroskali są wszechstronnym narzędziem do tworzenia designerskich nisz in vitro do badania sygnalizacji komórkowej indukowanej przez unieruchomione sygnały biochemiczne6,7.

Powszechna metoda generowania przestrzennych wzorów sygnałów biochemicznych polega na drukowaniu mikrokontaktowym (μCP) na podłożach pokrytych złotem z wzorami sprzężonych z PEG alkanetioli. Następnie, mikrowzorzyste, samoorganizujące się monowarstwy (SAM) alkanetioli peg-ylowanych ogranicza fizyczną adsorpcję cząsteczek biochemicznych, np. białek, tylko do niewzorzystych regionów substratu8,9. Jednak SAM generowane tą techniką są wrażliwe na utlenianie w długoterminowych pożywkach do hodowli komórkowych. W związku z tym alkanetiotiolowe SAM μCP są często dalej szczepione szczotkami polimerowymi PEG przy użyciu inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (SI-ATRP) w celu zwiększenia stabilności regionu bez zanieczyszczeń10. W szczególności μCP inicjatora polimeryzacji alkanetiolu, bromoizomaślanu ω-meraptoundecylu, na powierzchniach pokrytych złotem, a następnie monomerów SI-ATRP metakrylanu eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (PEGMEMA) generuje powierzchnie z długotrwałymi, stabilnymi i niebrudzącymi szczotkami PEG z mikrowzorami. Co więcej, mogą one być dalej modyfikowane w celu przedstawienia różnych ugrupowań chemicznych11.

Korzystając z tej właściwości, Sha et al. opracowali metodę inżynierii substratów kulturowych za pomocą wieloskładnikowych szczotek PEGMEMA prezentujących ortogonalne "klik" chemii. W tej metodzie wykorzystują serię etapów μCP / SI-ATRP przeplatanych sekwencyjnymi podstawieniami nukleofilowymi azydku sodu, etanoloaminy i propargyloaminy w celu stworzenia substratów hodowlanych prezentujących mikroskalowe wzory wielu immobilizowanych ligandów6. Chociaż potencjał wykorzystania takich substancji chemicznych w połączeniu z ręcznym μCP do inżynierii nowych substratów hodowlanych jest ogromny, jest on ograniczony przez precyzję i dokładność, z jaką można dostosować wiele kroków μCP do jednego podłoża. Do powtarzalnego wytwarzania złożonych nisz in vitro przy użyciu tych wszechstronnych technik wymagany byłby wysoki poziom precyzji i dokładności.

Aby rozwiązać ten problem, wygenerowano kilka zautomatyzowanych i półautomatycznych systemów μCP. Czakra i wsp. opracowano system μCP, w którym niestandardowe stemple są umieszczane na systemie szynowym i doprowadzane do konforemnego kontaktu z pozłacanymi szkiełkami za pomocą sterowanego komputerowo siłownika pneumatycznego. Jednak metoda ta wymaga precyzyjnego wytwarzania niestandardowych projektów stempli i podaje precyzję 10 μm bez raportu o dokładności osiągniętej podczas wykonywania wielu kroków μCP12. Niedawno metoda wykorzystująca zintegrowany system sprzęgania kinematycznego wykazała precyzję poniżej 1 μm przy użyciu pojedynczego wzoru, ale nie była w stanie dokładnie wyrównać wielu wzorów z powodu braku precyzyjnej kontroli cech stempla od formydo formy 13. Ponadto obie poprzednie metody wymagają, aby podłoże pozostało nieruchome między etapami modelowania, co znacznie ogranicza różnorodność chemii modyfikacji powierzchni, które można wykorzystać. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowany system R-μCP zdolny do dokładnego i precyzyjnego wyrównania wielu kroków μCP, zapewniając jednocześnie maksymalną elastyczność w projektowaniu i produkcji stempli. Co więcej, wzorzyste podłoża mogą być wielokrotnie usuwane z systemu między tłoczeniami, co pozwala na stosowanie różnych substancji chemicznych modyfikacji substratów, w tym sekwencyjnych podstawień nukleofilowych. Substraty zmodyfikowane przy użyciu takich substancji chemicznych były wcześniej używane do hodowli komórkowych zarówno przez nas6,14, jak i innych7. W związku z tym połączyliśmy R-μCP i sekwencyjne reakcje substytucji nukleofilowej, aby opracować metodę skalowalnej produkcji substratów hodowlanych ze złożonymi i mikrowzorcowymi wskazówkami biochemicznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie stempli elastomerowych

  1. Aby przygotować krzemowe matryce do stempli PDMS, zaprojektuj wzory elementów fotomaski za pomocą oprogramowania wspomaganego komputerowo (CAD).
    1. Zaprojektuj pierwszy wzór jako macierz 20 x 20 pierścieni o średnicy wewnętrznej (ID) 300 μm i zewnętrznej (OD) 600 μm z odstępem 1 200 μm od środka do środka.
    2. Zaprojektuj drugi wzór jako macierz 20 x 20 pierścieni o średnicy wewnętrznej (ID) 600 μm i zewnętrznej (OD) 900 μm z odstępem 1 200 μm od środka do środka.
    3. Dodatkowo umieść kwadratowe znaczniki referencyjne o wymiarach 1 x 1 mm2 we wszystkich czterech rogach każdego projektu macierzy, w odstępie 1 200 μm od środka do środka od narożnego elementu pod kątem 45°.
    4. Wykonaj krzemowe matryce do użycia w tym eksperymencie z proporcjami aspektowymi 1:1, co odpowiada głębokości elementu 300 μm, stosując standardowe techniki litografii opisane w innym miejscu15 lub we współpracy z odlewnią mikrofluidyczną.
      UWAGA: Głębokość elementów mniejsza niż 100 μm może prowadzić do nieprawidłowej deformacji stempli przed kontaktem z powierzchniami podłoża.
      UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że krzemowe matryce z opisanymi wzorami fotorezystu zostały już uzyskane, co wymaga zastosowania specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń typu clean room. W celu stworzenia tych wzorowanych matryc zaleca się konsultację z producentem lub jednostką centralną (core facility).
  2. Przeprowadź silanizację matryc krzemowych przez noc (O/N) poprzez inkubację z oparami (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo) trichlorosilanu.
    UWAGA: Opary silanu są silnie toksyczne i powinny być obsługiwane wyłącznie w dygestorium chemicznym.
  3. Stwórz odwrócone repliki matryc krzemowych poprzez utwardzanie mieszaniny prepolimeru PDMS i utwardzacza PDMS w stosunku 10:1 na wierzchu silanizowanych matryc krzemowych w szalce Petri przez noc (O/N) w temperaturze 60 °C.
  4. Odsuń stemple PDMS od matryc krzemowych i przyklej stemple do podkładek z akrylonitrylo-butadien-styrenu (ABS) lub innych sztywnych materiałów za pomocą kleju.
    UWAGA: Wybrany materiał nie musi być przezroczysty ani biokompatybilny. Musi on jednak zapewniać płaską powierzchnię do styku z oprzyrządowaniem robotycznym oraz mieć większą sztywność niż PDMS.

2. Przygotowanie szkiełek zakrywek

  1. Przepłukać szkiełka nakrywkowe do mikroskopu (24 mm x 50 mm #1) w toluenie, metanolu, a następnie poddać sonikacji w acetonie przez 1 min, po czym przepłukać etanolem i osuszyć delikatnym strumieniem azotu.
    UWAGA: Toluenem i acetonem należy operować wyłącznie w dygestorium chemicznym.
  2. Pokryć szkiełka nakrywkowe warstwą tytanu (Ti) o grubości ~3,5 nm, a następnie warstwą złota (Au) o grubości 18,0 nm, używając naparowarki z wiązką elektronową.
    UWAGA: Procedura ta jest kompatybilna z różnymi podłożami pokrytymi złotem, w tym z krzemem i polistyrenem. Chociaż jest możliwe ich przygotowanie w laboratorium, podłoża pokryte złotem są również dostępne u dostawców komercyjnych.
    UWAGA: Warstwy Ti powinny mieć grubość co najmniej 3 nm, natomiast warstwy Au na podłożach powinny mieć grubość co najmniej 5 nm i mogą osiągać grubość aż do 1 mm, w zależności od optymalnych właściwości optycznych końcowego podłoża16,17. Podłoża nie muszą być optycznie przejrzyste do procesu wytwarzania, jednak ułatwia to analizę mikroskopową przygotowanych podłoży.
  3. Przepłukać pokryte złotem szkiełka nakrywkowe etanolem i osuszyć delikatnym strumieniem azotu bezpośrednio przed użyciem.

3. R-μCP zewnętrznego pierścienia

  1. Przed przeprowadzeniem R-μCP z wykorzystaniem systemu z robotycznym ramieniem przegubowym SCARA (selectively compliant articulated robot arm), należy skalibrować efektory narzędziowe robota oraz towarzyszące im systemy kamer stereo za pomocą oprogramowania systemowego.
    UWAGA: Narzędzia te są przedstawione na Rysunku 1.

Robotyczny system dozowania cieczy, ustawienie eksperymentalne, precyzyjne pipetowanie dla badań nad automatyzacją laboratoryjną.
Rycina 1. System R-μCP oraz oprzyrządowanie ramienia robotycznego. (A) Widok ogólny systemu R-μCP ze wszystkimi narzędziami i mocowaniami: (a) uchwyt próżniowy, (b) kąpiel z odczynnikiem, (c) kamera skierowana w dół, (d) uchwyt do gniazdowania stempli, (e) narzędzie robotyczne. (B) Oprzyrządowanie ramienia robotycznego przedstawiające (f) narzędzie do trawienia z diamentową końcówką oraz (g) pneumatyczne narzędzie ssące trzymające (h) stempel PDMS z podkładką z ABS.

  1. Ręcznie umieść stempel z PDMS z wypukłymi pierścieniami o średnicy wewnętrznej 600 μm i zewnętrznej 900 μm stroną wypukłą do dołu w uchwycie gniazdowym stempla. Ręcznie umieść świeżo oczyszczoną szkiełko podstawowe pokryte złotem na uchwycie próżniowym, pokazanym na Rysunku 1A, i unieruchom je za pomocą podłączonej pompy próżniowej laboratoryjnej.
  2. Za pomocą sterowania robotem ustaw kamerę skierowaną w dół nad punktem środkowym szkiełka pokrytego złotem, jak na Rysunku 2A.
    UWAGA: Punkt ten można początkowo zdefiniować poprzez inspekcję wizualną i nie wymaga on dużej dokładności, ponieważ stempel z PDMS jest znacznie większy niż szkiełko pokryte złotem.
  3. Poleć ramieniu robota wytrawienie czterech referencyjnych znaków „X” w wierzchołkach kwadratu o wymiarach 3,8 mm na 3,8 mm, wyśrodkowanego na szkiełku pokrytym złotem, przy użyciu narzędzia trawiącego z diamentową końcówką zamocowanego do ramienia robota. (Przedstawiono na Rysunku 2B; PROCES AUTOMATYCZNY)
    UWAGA: Zapewnia to, że wszystkie cztery znaki referencyjne znajdują się w jednym polu widzenia kamery skierowanej w dół.
  4. Za pomocą pneumatycznego narzędzia ssącego robota podnieś i utrzymaj stempel z PDMS 1 mm nad uchwytem gniazdowym stempla, jak na Rysunku 2C. (PROCES AUTOMATYCZNY)
  5. Za pomocą kamery skierowanej w górę i pierścienia oświetlenia LED przedstawionych na Rysunku 2D i E, zwizualizuj kwadratowe znaki referencyjne stempla i zidentyfikuj je za pomocą oprogramowania kamery 10 razy, aby określić średnie przesunięcie X, Y oraz kątowe stempla względem środka osi narzędziowej robota. (PROCES AUTOMATYCZNY)
  6. Podobnie jak na Rysunku 2A, użyj kamery skierowanej w dół, aby zwizualizować i wykryć wytrawione znaki referencyjne szkiełka 10 razy w celu określenia średnich lokalizacji środków X, Y oraz przesunięcia kątowego szkiełka względem środka osi narzędziowej robota. (PROCES AUTOMATYCZNY).
    UWAGA: Oprogramowanie systemu robotycznego wykonuje obliczenia wewnętrzne, aby precyzyjnie wyrównać lokalizacje środków X, Y oraz przesunięcia kątowe stempla i szkiełka w przyszłych etapach R-μCP.
  7. 3.8) Umieść stempel w kąpieli inicjatora ATRP alkanotiolu, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (2 mM w etanolu), jak przedstawiono na Rysunku 2F. (PROCES AUTOMATYCZNY)
  8. Wyjmij stempel z roztworu alkanotiolu i umieść go nad strumieniem azotu pod ciśnieniem 0,48 bar (5 psi), aby odparować etanol, jak na Rysunku 2G. Po 1 min zwiększ ciśnienie strumienia azotu do 1,03 bar (15 psi), aby zapewnić jednolite osuszenie. (PROCES AUTOMATYCZNY)
    UWAGA: Niepełne osuszenie spowoduje całkowitą lub częściową utratę wierności wzoru.
  9. Po osuszeniu przesuń stempel nad obliczoną pozycję środkową szkiełka pokrytego złotem i obniżaj go w krokach co 100 μm, monitorując siłę silnika osi Z, jak przedstawiono na Rysunku 2H.
    UWAGA: Jest to przekazywane jako moment obrotowy działający na silnik osi Z i wyświetlane w oprogramowaniu sterującym robotem. (PROCES AUTOMATYCZNY)
  10. Przerwij obniżanie stempla po osiągnięciu ustalonego ciśnienia 79,2 kPa i utrzymuj kontakt ze szkiełkiem pokrytym złotem przez 15 s. (PROCES AUTOMATYCZNY)
    UWAGA: Przedstawione wartości ciśnienia są zoptymalizowane dla obecnej konstrukcji stempla i wysokości cech. Jeśli konstrukcja stempla zostanie zmieniona, szczególnie w przypadku stempli o wysokim stosunku kształtu, należy odpowiednio dostosować te parametry metodą prób i błędów.
  11. Powoli usuń stempel ze szkiełka pokrytego złotem i umieść go z powrotem w uchwycie gniazdowym stempla. (PROCES AUTOMATYCZNY)

4. SI-ATRP PEGMEMA na mikrowzorowanych szkiełkach podstawowych

  1. Zwolnić podciśnienie utrzymujące mikrowzorcowane szkiełko podstawowe i przenieść je do kolby Schlenka o pojemności 50 ml. Zamknąć i odgazować kolbę Schlenka za pomocą pompy próżniowej.
  2. Do kolby Schlenka dodać 5,5 ml mieszaniny reakcyjnej ATRP zawierającej makromonomer PEGMEMA (208,75 mmol), wodę (34,4 ml), metanol (43,8 ml), bromek miedzi(II) (1 mmol) oraz 2’,2-bipyrydynę (3 mmol).
  3. W celu zainicjowania reakcji dodać 0,5 ml L-ascorbinianu sodu (454,3 mM) w wodzie i pozostawić do przebiegu reakcji przez 16 hr w RT w atmosferze gazu obojętnego.
    UWAGA: Po dodaniu L-ascorbinianu sodu kolor reakcji zmieni się z jasnzielonego na ciemnobrązowy, jak pokazano na Rysunku 3A-B.
    UWAGA: Reakcja może być kontynuowana powyżej 16 hr, jednak nie spowoduje to znaczącego zwiększenia długości szczotek PEG.

Układ reakcji chemicznej, aparat do filtracji próżniowej; zmiana barwy, widoczne wyniki mikromacierzy.
Rycina 3. Inicjacja SI-ATRP. (A) Inicjacja reakcji oraz (B) następująca po niej zmiana barwy po dodaniu L-askorbinianu sodu. (C) Obraz mikroskopowy powierzchni szkiełka podstawowego z mikrowzorcem po przeprowadzeniu procedury SI-ATRP. Pasek skali 1 mm.

  1. Wyjmij pokrywkę szkiełka z mikrowzorcem z kolby Schenka, wypłucz etanolem, wodą i ponownie etanolem, a następnie osusz delikatnym strumieniem azotu.
    UWAGA: Po przeprowadzeniu SI-ATRP modyfikacje powierzchni powinny być widoczne gołym okiem; można je obrazować i analizować pod mikroskopem, jak pokazano na Rysunku 3C.
    UWAGA: Jest to najprostsza metoda testowania precyzji próby, ponieważ eliminuje konieczność barwienia immunocytochemicznego podłoży.

5. Funkcjonalizacja azydowa mikrowzorowanych łańcuchów PEGMEMA

  1. Umieścić mikrowzorcowane szkiełko podstawowe w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
  2. Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) zawierającego 100 mM azotku sodu. Reakcję prowadzić w temperaturze 37 °C przez 24 hr.
    UWAGA: DMF należy stosować wyłącznie w dygestorium chemicznym. Należy zachować ostrożność podczas odważania azotku sodu.
  3. Po zakończeniu procesu wyjąć mikrowzorcowane szkiełko podstawowe z fiolki reakcyjnej, wypłukać najpierw etanolem, a następnie wodą i osuszyć strumieniem azotu.

6. Pasywacja łańcuchów PEGMEMA funkcjonalizowanych bromem

  1. Umieść mikrowzorcowaną lamellkę w szklanych fiolkach reakcyjnych o pojemności 20 ml.
  2. Do fiolki reakcyjnej dodaj 6 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego 100 mM etanolaminy i 300 mM trietyloaminy. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 40 °C przez 24 hr.
    UWAGA: DMSO, etanolaminą oraz trietyloaminą należy posługiwać się wyłącznie pod wyciągiem chemicznym.
  3. Po zakończeniu reakcji wyjmij mikrowzorcowaną lamellkę z fiolki, wypłucz ją etanolem, a następnie wodą i osusz strumieniem azotu.

7. R-μCP wewnętrznego pierścienia oraz SI-ATRP PEGMEMA

  1. Należy przeprowadzić etapy R-μCP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 3.2 oraz 3.6 – 3.12, zastępując stempel PDMS stemplem z wystającymi pierścieniami o średnicy wewnętrznej (ID) 300 μm i średnicy zewnętrznej (OD) 600 μm, w taki sposób, aby pierścienie o mniejszych wymiarach zostały umieszczone wewnątrz wcześniej naniesionych mikrostruktur pierścieniowych.
    UWAGA: Próg ciśnienia dla tego stempla wynosi 132.0 kPa. Jak wspomniano wcześniej, ustawienia ciśnienia są zoptymalizowane pod kątem elementów stempla wykorzystywanych w tym eksperymencie.
  2. Należy przeprowadzić etapy SI-ATRP zgodnie z wcześniejszym opisem w krokach 4.1 – 4.4.

8. Funkcjonalizacja acetylenowa mikrowzorowanych łańcuchów PEGMEMA

  1. Umieścić mikrowzorcowaną szkiełko podstawowe w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
  2. Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml DMSO zawierającego 100 mM propargylaminy. Reakcję prowadzić w RT przez 24 hr.
    UWAGA: DMSO oraz propargylaminę należy obsługiwać wyłącznie w dygestorium chemicznym.
  3. Po zakończeniu wyjąć mikrowzorcowaną szkiełko podstawowe z fiolki reakcyjnej, wypłukać etanolem, a następnie wodą i osuszyć strumieniem azotu.

9. Biotynilacja łańcuchów PEGMEMA zakończonych acetylenem katalizowana miedzią metodą „Click”

  1. Umieścić pokrywek ze wzorem mikroskopowym w szklanej fiolce reakcyjnej o pojemności 20 ml.
  2. Do fiolki reakcyjnej dodać 6 ml roztworu siarczanu miedzi (15 mM) / Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]aminy (TBTA, 30 mM) (1:1 v/v woda/DMF) zawierającego 562 μM koniugatu azyd-PEG4-Biotyny. Do mieszaniny dodać 1,2 ml kwasu L-askorbinowego (0,15 mM) w wodzie, aby zainicjować reakcję.
  3. Przez 10 s przepuścić azot przez roztwór reakcyjny, uszczelnić fiolkę Parafilmem i inkubować przez 24 hr w RT.
  4. Po zakończeniu reakcji wyjąć pokrywek ze wzorem mikroskopowym z fiolki, opłukać wodą i umieścić w polistyrenowej płytce 12-dołkowej.

10. Immunofluorescencyjna detekcja biotynylowanych grup acetylenowych

  1. Blokować mikrowzorowane szkiełko podstawowe w DPBS (3% surowica osła) przez 1 hr w RT. Barwić grupy acetylenowe biotynilowane przy użyciu koniugatu Streptavidyna-546 (2 μg/ml) w DBPS (3% surowica osła w PBS) przez 2 hr w RT.
  2. Płukać mikrowzorowane szkiełko podstawowe 5 razy w DPBS przez 10 min przy łagodnym mieszaniu.
    UWAGA: Rysunek 4B przedstawia obraz szkiełka po zakończeniu tego etapu.

11. Bezmiedziowa biotynylacja „klikowa” łańcuchów PEGMEMA zakończonych grupą azydkową

UWAGA: Jeśli zajdzie taka potrzeba, ten etap modyfikacji podłoża można przeprowadzić in situ podczas hodowli komórek.

  1. Po płukaniu w DBPS pozostaw lamellkę z mikrowzorami w polistyrenowej płytce 12-dołkowej.
  2. Dodaj 2 ml DBPS (lub pożywki hodowlanej) zawierającej 20 μM DBCO-PEG4-Biotin i pozostaw odczynnik do reakcji na 24 hr w RT (lub w 37 °C w inkubatorze).
  3. Po zakończeniu reakcji wypłucz lamellkę z mikrowzorami 5 razy w DPBS (lub po prostu wymień pożywkę).

12. Detekcja grup azydkowych biotynilowanych metodą immunofluorescencji

  1. Barwić grupy azydowe biotynilowane koniugatem Streptavidin-488 (2 μg/ml) w 2 ml DPBS (3% surowica osła) przez 2 hr w RT.
  2. Płukać mikrowzorowane szkiełko podstawowe 5 razy w DPBS przez 10 min przy łagodnym mieszaniu.
  3. Wykonać obrazowanie mikrowzorowanego szkiełka podstawowego przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Rysunek 4A-C przedstawia obrazy szkiełka po zakończeniu tego etapu.
    UWAGA: W przypadku stosowania podłoży do testów hodowli tkankowych, należy pominąć sekcje 10 i 12 niniejszego protokołu. Po uzyskaniu pożądanego stopnia funkcjonalizacji, wysterylizować zmodyfikowane szkiełko podstawowe, płucząc obie strony 100% etanolem i susząc w strumieniu azotu. Przenieść szkiełko do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego i wypłukać szkiełko pięciokrotnie PBS przed przystąpieniem do wysiewania i hodowli komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie technik manualnego wyrównywania μCP w celu projektowania podłoży hodowlanych z macierzami szczotek z przeszczepionym PEG, funkcjonalizowanych ortogonalną chemią „klik”, zostało wykazane w poprzednich pracach6. Oferuje ono jednak minimalną kontrolę nad orientacją wzoru i często prowadzi do nakładania się obszarów funkcjonalizowanych. W niniejszym opracowaniu zastosowano nowy system R-μCP, aby przezwyciężyć to ograniczenie, oraz wykazano jego zdolność do precyzyjnego tworzenia wzoru macierzy pierści...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Idealne podłoża dla inżynierii tkankowej byłyby inspirowane biologicznie, a tym samym odzwierciedlałyby rozkład przestrzenny krytycznych bioaktywnych ligandów znajdujących się w tkankach natywnych. Posiadałyby one również dynamiczne właściwości, które umożliwiają czasowe dostosowanie ligandów i wzorców przestrzennych, w których są prezentowane, aby umożliwić ukierunkowaną morfogenezę tkanek i przestrzennie ograniczoną indukcję losu komórki. Wytwarzanie takich substratów wymaga unieruchomienia wielu sygnałów biochemicznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

Fundusze na tę pracę, GTK, TK i JDM zostały zapewnione przez Wisconsin Institute for Discovery i Wisconsin Alumni Research Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SCARA EpsonLS3-401STW razie potrzeby dostępne są modele z wyższej półki o zwiększonej precyzji.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilanGelestSIT8174.0UWAGA, Należy obchodzić się wyłącznie w wyciągu chemicznym. Podczas silanizacji wafli nikt nie powinien wchodzić do okapu, dopóki cały silan nie zostanie odparowany.
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychEllsworth Adhesive CoNC9020938Dokładnie odgazuj roztwory poprzez wystawienie na działanie próżni przed użyciem. Dopuszczalne są alternatywne zestawy, takie jak Kit 182.
Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 50 mm #1Fisher Scientific48393106Można je kupić od wielu dostawców o różnych wymiarach, w zależności od potrzeb.
CHA-600 Telemark Parownik wiązki elektronówTelemarkSEC-600-RAPWymaga specjalistycznego szkolenia.
EPSON LS3 SCARAEPSONLS3-401ST&
omega;-mertcaptoundecyl bromoisomaslanProchimiaFT 015-m11-0,2Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Inne inicjatory ATRP mogą być używane jako ten R-μ Platforma CP ma zastosowanie do wszystkich modalności mikromodelowania. 
Kolba rurkowa Schlenk 50 mlSynthware60003-078Wymaga gumowych korków z membraną.
Metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego)Sigma Aldrich447943Shipping, zawierający gotowe inhibitory wolne od MEHQ i BHT.
Metanol (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA412-4UWAGA, należy obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
Bromek miedzi(II)Sigma Aldrich437867UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
2,2'-BipirydynaSigma AldrichD216305UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
L-askorbinian soduSigma AldrichA4034
20 ml fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific03-340-4E
Azydek soduSigma AldrichS2002UWAGA, ogranicz ekspozycję za pomocą maski chirurgicznej.
N,N-dimetyformamidSigma Aldrich227056UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w wyciągach chemicznych.
EtanoloaminaSigma Aldrich398136UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.
TriethylamineSigma AldrichT0886UWAGA, obsługiwać wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
DimetylosulfotlenekSigma Aldrich276855UWAGA, należy obchodzić się wyłącznie z wyciągiem chemicznym.
PropargylamineSigma AldrichP50900UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
200 Proof EthanolUniversity of Wisconsin Material Distribution Services2292UWAGA, należy obchodzić wyłącznie w okapie oparów chemicznych.
Azide-PEG3-BiotynaClickChemistryToolsAZ104-100Solubilizowany w DMF
Siarczan miedzi(II)Sigma AldrichC1297UWAGA, ogranicz ekspozycję maską chirurgiczną.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)Sigma Aldrich678937
Kwas L-askorbinowySigma AldrichA7506
Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaInvitrogen14190144
Surowica osłaSigma AldrichD9663Przedmioty zanieczyszczone surowicą osła są uważane za materiał niebezpieczny biologicznie i należy je odpowiednio zutylizować. Różne inne związki (np. BSA) są dostępne i służą temu celowi.
12-dołkowa płyta polistyrenowaThermo Scientifit - NUNC07-200-81Płyty można kupić u wielu dostawców o różnych wymiarach.
DBCO-PEG4-BiotynaClickchemistytoolsA105P4-10Solubilizowany w DMF
Streptawidyna, Alexa Fluor 488 SprużoneżyciaS-11223Rozpuszczane w PBS
Streptawidyna, Alexa Fluor 546 sprużoneLife TechnologiesS-11225Rozpuszczone w PBS
Mikroskop konfokalny Nikon Nikon EclipseTi, A1RMikroskop epifluorescencyjny jest wystarczający do zobrazowania funkcjonalizowanych podłoży mikrowzorcowych.
technologie

Bibliografia

  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Funkcjonalizacja szczoteczkami PEGpodłoża powlekane złotemortogonalna chemia klikpodłoża do hodowli tkanekwzorowanie w skali mikrometrycznejkoniugacja sond fluorescencyjnychwiązanie streptawidynyniestandardowa analiza obrazu
Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.