Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Streszczenie

Celem analizy fluorometrycznej jest służyć jako efektywna, opłacalna i wysokoprzepustowa metoda analizy fagocytozy i innych procesów komórkowych. Technika ta może być stosowana na różnych typach komórek, zarówno przylegających, jak i nieprzylegających, w celu zbadania różnych właściwości komórkowych. Podczas badania fagocytozy technika fluorometryczna wykorzystuje typy komórek fagocytarnych, takie jak makrofagi i fluorescencyjnie znakowane cząstki opsonizowane, których fluorescencja może zostać wygaszona w obecności błękitu trypanowego. Po posianiu przylegających makrofagów na 96-dołkowych płytkach, podaje się cząstki fluorescencyjne (zielone lub czerwone), a komórkom pozwala się fagocytozę przez różny czas. Po internalizacji cząstek fluorescencyjnych komórki są myte błękitem trypanowym, który ułatwia wygaszanie sygnału fluorescencyjnego z bakterii, które nie są zinternalizowane lub jedynie przylegają do powierzchni komórki. Po przemyciu trypanem komórki są myte PBS, utrwalane i barwione DAPI (niebieska fluorescencyjna etykieta jądrowa), która służy do znakowania jąder komórek. Poprzez prostą kwantyfikację fluorometryczną poprzez odczyt płytki fluorescencji jądrowej (niebieskiej) lub cząstkowej (czerwonej / zielonej) możemy zbadać stosunek względnych jednostek fluorescencji koloru zielonego: niebieskiego i określić indeks fagocytarny wskazujący na ilość bakterii fluorescencyjnych zinternalizowanych na komórkę. Czas trwania testu z zastosowaniem metody 96-dołkowej i wielokanałowych pipet do mycia, od końca fagocytozy do końca akwizycji danych, wynosi mniej niż 45 minut. Cytometria przepływowa może być stosowana w podobny sposób, ale zaletą fluorometrii jest jej wysoka przepustowość, szybka metoda oceny przy minimalnej manipulacji próbkami i szybka kwantyfikacja intensywności fluorescencji na komórkę. Podobne strategie można zastosować do nieprzylegających komórek, żywych bakterii znakowanych, polimeryzacji aktynowej i zasadniczo każdego procesu wykorzystującego fluorescencję. Dlatego fluorometria jest obiecującą metodą ze względu na jej niski koszt i wysoką przepustowość w badaniu procesów komórkowych.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja sygnału fluorescencyjnego była szeroko stosowana w wielu metodach naukowych, począwszy od PCR, cytometrii przepływowej, mikroskopii konfokalnej i analizy FRET, aż po multipleksowy test ELISA. Obrazowanie fluorescencyjne i kwantyfikacja mają szerokie zastosowanie i mogą być doskonałym narzędziem do analizy ilościowej różnych procesów komórkowych. Zastosowanie markerów fluorescencyjnych i ich sygnału zostało zrewolucjonizowane w ciągu ostatniej dekady, a pojawienie się czytników płytek fluorescencyjnych ułatwiło wysokoprzepustową kwantyfikację fluorescencji emitowanej podczas procesów komórkowych.

Analiza fluorometryczna może służyć jako doskonałe narzędzie do ilościowego określania fagocytozy. Fagocytoza jest badana od czasu odkrycia fagocytów przez Metchnikoffa w 1800^{roku 1}. Z biegiem lat wykorzystano różne metody do zbadania tego ważnego procesu niezbędnego do wrodzonej obrony immunologicznej przed atakującymi patogenami bakteryjnymi, wirusowymi, grzybiczymi i pasożytniczymi^2-5. Poprzednie metody kwantyfikacji wykorzystywały mikroskopię i techniki stereologiczne w celu wizualizacji komórek fagocytozycjonujących, które następnie określano ilościowo poprzez liczenie zinternalizowanych cząstek (ręcznie lub za pomocą oprogramowania)^6-8. Jedną z wad stosowania samej mikroskopii do analizy ilościowej jest to, że ręczne liczenie bakterii jest pracochłonne i bardziej podatne na stronniczość obserwatora. Inną metodą stosowaną w ilościowym oznaczaniu fagocytozy jest technika mikrobiologiczna polegająca na posiewaniu bakterii z lizatów komórkowych (po fagocytozie) na płytkach hodowlanych bakterii, ale metoda ta może nie uwzględniać mechanizmów bakteriobójczych i obecności częściowo zinternalizowanych bakterii. Ta metoda jest jeszcze bardziej pracochłonna w porównaniu z mikroskopią, a analiza zajmuje kilka dni. Cytometria przepływowa wydaje się być najszybszym i najskuteczniejszym sposobem ilościowego określania fagocytozy i jest stosowana przez wiele grup^9-11, ale wysoki koszt powszechnie związany z instrumentem potrzebnym do analizy sprawia, że jest to najdroższa metoda w porównaniu z wcześniej wymienionymi testami.

Metoda fluorometryczna jest dobrą alternatywą dla cytometrii przepływowej do analizy internalizacji cząstek, ponieważ oferuje bezstronną kwantyfikację fluorescencji przy użyciu sprzętu, który nie jest tak kosztowny. Inne dodatkowe korzyści płynące z fluorometrii to wysoka wydajność i wysoka przepustowość do ilościowego określania fluorescencji emitowanej przez znakowane zinternalizowane cząstki.

Korzyści z fluorometrii można ekstrapolować na kwantyfikację procesów innych niż fagocytoza. Na przykład analiza fluorometryczna może być stosowana do badania dowolnego procesu prowadzącego do zmian w ekspresji receptorów wewnątrzkomórkowych lub związanych z błoną, zmian w przepuszczalności/żywotności komórek, skuteczności transfekcji i modulacji polimeryzacji aktyny. Jedną z wad techniki fluorometrycznej jest to, że w zależności od użytych etykiet może wystąpić duża zmienność eksperymentu do eksperymentu, którą zwykle można rozwiązać, demonstrując dane poprzez względną kwantyfikację, taką jak zmiana krotności lub procentowy wzrost w stosunku do kontroli.

Protokół

UWAGA: Ten protokół może być używany do wielu zastosowań, takich jak kwantyfikacja fagocytozy i polimeryzacja aktyny, jak to zostało użyte w naszej poprzednio opublikowanej pracy¹². Protokół nadaje się do różnych modyfikacji, a Tabela 1 zawiera listę typów komórek i cząstek, które z powodzeniem wykorzystano w poprzednich badaniach. Standardowe zastosowanie tego protokołu do ilościowego oznaczania fagocytozy lub polimeryzacji aktyny zilustrowano na rysunku 1.

Diagram 1: Diagram testu fluorometrycznego do ilościowego oznaczania fagocytozy i polimeryzacji aktyny. Po pokryciu komórek, potraktowaniu i pozostawieniu do przylegania, cząsteczki znakowane zieloną fluorescencją (FITC) są dodawane do komórek w celu fagocytozy. Reakcję zatrzymuje się za pomocą trypanu lub przemywania antybiotykiem (w celu wyeliminowania niezinternalizowanych cząstek), a utrwalanie przeprowadza się za pomocą 4% paraformaldehydu. Komórki są następnie barwione czerwonym fluorescencyjnym znacznikiem aktyny (rodamina, falloidyna) i niebieskim znacznikiem fluorescencyjnym (DAPI). Wskaźniki fagocytozy i polimeryzacji aktyny są określane ilościowo jako stosunek względnych jednostek fluorescencji fluorescencji zielono-niebieskiej (FITC / DAPI) lub czerwonej / niebieskiej (rodamina / DAPI).

1. Posiewanie i obróbka komórek

UWAGA: Zanim zaczniesz, rozważ przeprowadzenie zabiegów z co najmniej 4 technicznymi powtórzeniami i uwzględnij następujące kontrolki w układzie płytki: tylko komórki (niebarwione, z samym DAPI lub samą rodaminą) i tylko cząstki.

1. Całe dodawanie odczynników w krokach 1-4 należy przeprowadzić w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych w celu ochrony próbek przed zanieczyszczeniem.
2. Makrofagi płytkowe (mysia linia komórkowa J774) na 96-dołkowej płytce o wymiarach 1-5 x 10⁴ komórki w 50 μl (na dołek) uzupełnionej wstępnie podgrzanej pożywki. Idealnymi płytkami do tej metody są czarne płytki 96-dołkowe z przezroczystym lub czarnym dnem, w zależności od możliwości czytnika.
   1. W przypadku pożywek uzupełniających należy użyć 10% inaktywowanego termicznie FBS, aby uniknąć interferencji kaskady dopełniacza, i 1% penicyliny/streptomycyny (jeśli nie używasz żywych bakterii do fagocytozy). W przypadku stosowania komórek przylegających należy odczekać 1-2 godziny na adhezję, a w przypadku komórek nieprzylegających wirować płytkę z komórkami przez 10 minut w temperaturze 500 x g.
3. Dodać pożądanych agonistów/antagonistów lub kontrolę nośnika w stężeniu 2x (zawieszone w PBS lub korzystniej w pożywce uzupełnionej) w 50 μl dla końcowej objętości 100 μl (1x) i inkubować przez żądany czas. Wielokanałowe zbiorniki na pipety i odczynniki ułatwią najszybsze przetwarzanie.

2. Opsonizacja cząstek fluorescencyjnych

Tabela 1: Badane typy komórek i cząstki fluorescencyjne w analizie fluorometrycznej fagocytozy i polimeryzacji aktyny. Tabela 1 ilustruje kombinacje typów komórek (linii komórkowych i komórek pierwotnych), które nasza grupa wykorzystała za pomocą metody fluorometrycznej. Oprócz przyjrzenia się fagocytozie i polimeryzacji aktyny przez komórki typu dzikiego, wykorzystaliśmy również niektóre z tych cząstek do badania fagocytozy przez transfekowane komórki eksprymujące GFP (zielone białko fluorescencyjne). Fluorescencja komórek transfekowanych plazmidami zawierającymi reportery fluorescencyjne może być również stosowana jako marker komórkowy oprócz DAPI. Legenda tabeli: A - polimeryzacja aktyny; P - fagocytoza; PT - fagocytoza za pomocą transfekowanych komórek znakowanych GFP; OPDex - opsonizowany koralik dekstranowy; HKOP - ciepło zabite opsonizowane.

1. Upewnij się, że cząstki fluorescencyjne i etykiety są chronione przed światłem przez cały czas, podczas przetwarzania, mycia, a także podczas inkubacji, aby zapobiec fotowybielaniu
   1. W przypadku suchych cząstek należy odważyć bakterie opsonizowane zabite przez ciepło fluorescencyjne (HKOP) (E2861: szczep E. coli K-12), korzystając ze specyfikacji producenta. Należy upewnić się, że masa uwzględnia stosunek bakterii do komórek wynoszący 10:1 - 20:1 (lub przynajmniej stosunek 10:1 - powszechnie stosowany do ilościowego oznaczania fagocytozy)^13,14. Liczba cząstek może być podana przez producenta lub określona przez seryjne rozcieńczenia 1 mg/ml roztworu podstawowego.
   2. Zawiesić ponownie w 50 μl PBS i wirować przez 1 minutę na najwyższym ustawieniu. Zapewnij prawidłowe wirowanie (tutaj i w całym protokole), ponieważ cząstki mają tendencję do agregacji, co może wpływać na skuteczność opsonizacji.
   3. W przypadku cząstek w zawiesinie, takich jak znakowane fluorescencyjnie kulki dekstranu (kulki DEX), należy wirować roztwór podstawowy przez 1 minutę, pobrać 50 μl zawiesiny lub, w zależności od stężenia kulek w objętości, określić montaż kulek, aby ułatwić stosunek kulek do komórek 10:1.
2. Dodaj równą objętość odczynnika opsonizującego do cząstek i energicznie wiruj przez kolejną minutę.
3. Inkubować cząstki z odczynnikiem opsonizującym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
4. Po inkubacji odwirować cząstki przez 5 minut przy 500 x g i usunąć supernant zawierający nadmiar odczynnika opsonizującego. Przemyć cząstki, dodając 100 μl PBS, odwirować w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować przez 5 minut przy 500 x g.
   1. Powtórz te kroki dwa razy, aby zapewnić prawidłową opsonizację i usunięcie niezwiązanego przeciwciała.
5. Przygotować roztwór roboczy opsonizowanych cząstek, umieszczając je ponownie w 5 ml pożywki (wystarczającej na jedną płytkę 96-dołkową) i przechowywać z dala od światła do czasu dodania do komórek.

3. Fagocytoza

1. Umieść roztwór roboczy cząstek w sterylnym zbiorniku odczynnika. Stąd dodaj 50 μl opsonizowanych cząstek do komórek przygotowanych w kroku 1 (dla końcowego stężenia 50 ng / ml) i pozwól na wystąpienie fagocytozy w standardowych warunkach hodowli komórek. Poniżej przedstawiono dwie metody fagocytozy, które można ocenić za pomocą tej metody (Rysunek 2).

Diagram 2: Porównanie fagocytozy ciągłej i synchronizacyjnej. Ciągła fagocytoza wskazuje na ciągłą internalizację cząstek w czasie, gdy powoli docierają one do komórek na dnie studni. Kontrastujący etap synchronizacji (wirowanie) zmusza cząstki do opadania na dno, zwiększając kontakt cząstek z komórką i prowadząc do natychmiastowej internalizacji przez komórki. Zsynchronizowana fagocytoza jest szybszym procesem, który szybciej internalizuje cząstki ze względu na zwiększony kontakt komórka-cząstka.

1. 1. W przypadku metody fagocytozy ciągłej (rysunek 2), która pozwala komórkom na ciągłą fagocytozę opsonizowanych bakterii, gdy powoli opadają na dno i wchodzą w kontakt z komórkami, należy wykorzystać dłuższe ramy czasowe, aby umożliwić bakteriom dotarcie na dno studzienki i nawiązanie kontaktu z komórkami. Jeśli przeprowadzasz eksperyment w czasie, dodawaj bakterie w różnych odstępach czasu i zatrzymuj całą płytkę reakcji w tym samym czasie, aby zwiększyć szybkość przetwarzania.
   2. W przypadku metody zsynchronizowanej fagocytozy (Rysunek 2), która zwiększa kontakt cząstka: komórka poprzez wirowanie, należy odwirować całą płytkę zawierającą komórki i cząstki (5 minut przy 500 x g), gdy tylko cząstki zostaną dodane, aby ułatwić synchronizację wszystkich punktów czasowych i przyspieszyć interakcję cząstka: komórka.
      1. Zmierz przebieg czasu rozpoczynający się zaraz po zakończeniu etapu wirowania. Jeśli przeprowadzasz eksperyment z kursem czasowym, zatrzymaj każdy punkt czasowy niezależnie w różnych odstępach czasu, jak opisano poniżej.

UWAGA: Metoda zsynchronizowanej fagocytozy jest nieco bardziej pracochłonna od poprzedniej, ale zapewnia wyższy indeks fagocytarny w krótszym czasie.

4. Zatrzymanie fagocytozy

1. W przypadku komórek przylegających należy usunąć supernatant i dodać 50 μl rozcieńczonego błękitu trypanowego z PBS (rozcieńczenie 1:2), w celu zgaszenia fluorescencji bakterii nieinternalizowanych.
2. W przypadku komórek nieprzylegających należy odwirować płytkę i usunąć supernatant. Dodać 50 μl rozcieńczonego błękitu trypanowego. Upewnij się, że odwirowałeś płytkę (5-10 minut przy 500 x g) między każdym myciem, aby zminimalizować utratę komórek i umożliwić odpowiednie mycie.
3. Po inkubacji trypanów należy przemyć komórki dwa razy PBS w celu usunięcia pozostałości trypana (do momentu, gdy PBS usunięty z dołka stanie się czysty). Wykazano, że trypan wygasza fluorescencję^15,16 niezinternalizowanych, znakowanych fluorescencyjnie, zabitych termicznie, cząstek bakteryjnych, ale nie dla żywych bakterii lub kulek OPDex. W przypadku żywych bakterii należy przemyć antybiotykami, takimi jak penicylina, streptomycyna lub gentamycyna, zamiast mycia trypanem, aby uniknąć mylących efektów fluorescencji od niezinternalizowanych cząstek.
4. Utrwalić komórki 100 μl 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć PBS (w ilości 100 μl na studzienkę na każde przemycie). Na tym etapie należy przechowywać komórki w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia lub przejść bezpośrednio do barwienia i oznaczania ilościowego.
   UWAGA: Wszystkie kolejne kroki z tej przedmowy można wykonać poza kapturem do hodowli komórkowych.
5. Usunąć cały płyn i dodać 50 μl DAPI w stężeniu 5 ng/ml rozpuszczonym w PBS. Odczekaj 5 minut na barwienie, a następnie umyj dwukrotnie PBS. Po etapie płukania dodaj 50 μl PBS do każdej studzienki i zapisz fagocytozę.

5. Barwienie aktyny

UWAGA: Oprócz fagocytozy, metoda fluorometryczna umożliwi ilościowe określenie polimeryzacji aktyny poprzez pomiar intensywności aktyny, która zmniejsza się podczas hamowania lamellipodiów, pseudopodiae i marszczenia błony w wyniku leczenia inhibitorem (Rysunek 1A). Jest to opcjonalny krok, jeśli interesuje Cię kwantyfikacja polimeryzacji aktyny oprócz fagocytozy. Jeśli polimeryzacja aktyny jest ostatecznym celem, użycie cząstek fluorescencyjnych do fagocytozy jest opcjonalne.

1. Po utrwaleniu paraformaldehydu (etap 4.3) przemyć płytkę dwukrotnie PBS w ilości 100 μl na studzienkę przy każdym przemyciu. Dodać 50 μl 0,1% Triton X-100 w PBS w celu przepuszczalności i inkubować przez -5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przepłukać 0,1% Triton X-100 2 razy PBS (jak wyżej) i zablokować 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 20 minut, aby uniknąć niespecyficznego wiązania etykiety.
3. Po zablokowaniu usuń roztwór BSA i natychmiast dodaj falloidynę rodaminy. Do przygotowania roztworu roboczego barwienia rodaminy należy użyć 100 μl roztworu metanowego (dostarczonego przez producenta) w 5 ml PBS (wystarcza na jedną płytkę). Z roztworu roboczego dodać 50 μl na studzienkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Postępując zgodnie z krokami mycia i barwienia DAPI, jak w kroku 4.4, komórki będą gotowe do kwantyfikacji.

6. Kwantyfikacja

1. Aby określić ilościowo fagocytozę za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, należy zarejestrować zieloną fluorescencję przy użyciu filtra wzbudzenia przy λ = 488 nm i filtra emisyjnego przy λ = 518 nm oraz niebieską fluorescencję przy użyciu filtra wzbudzenia przy λ = 355 nm i filtra emisyjnego przy λ = 460 nm.
2. Aby określić ilościowo polimeryzację aktyny za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, należy zarejestrować fluorescencję niebieską za pomocą λ = 355 nm i λ = 460 nm (jak powyżej), a fluorescencję czerwoną za pomocą filtra wzbudzającego przy λ = 584 nm i filtra emisyjnego λ = 620 nm.
   UWAGA: Detekcja orbitalna lub centralna jest dopuszczalna do nagrywania. Niektóre typy komórek gromadzą się bardziej na krawędzi studni niż w środku, w takim przypadku zapis orbitalny może być korzystny. W szczególności średnia z trzech punktów wokół orbity może być również wykorzystana do uzyskania dokładniejszych wyników.
3. Podziel całkowite RFU zielonej lub czerwonej fluorescencji przez odczyt niebieskiej fluorescencji (z DAPI), w zależności od etykiety cząstek lub kwantyfikacji fagocytarnej i aktynowej (wykres 1). Ze względu na wysoką wariancję między płytami, należy stosować wskaźniki względne (takie jak względna kontrola t = 0), aby jak najlepiej zilustrować obserwowane trendy i ułatwić bardziej wiarygodną analizę statystyczną.

Wyniki

Dwa główne sposoby ilościowego określania fagocytozy i późniejszej polimeryzacji aktyny za pomocą tego protokołu to obserwacja ciągłej lub zsynchronizowanej fagocytozy.

Analiza mikroskopowa (Rysunek 1B) ilustruje obrazy fluorescencyjne porównywalne do tego, co rejestruje fluorometr (zobacz również Diagram 1). Na rysunku 1B przedstawiono czerwoną fluorescencję aktyny, zieloną 268 fluorescencję znaczników FITC HKOP E. coli, barwienie ją...

Dyskusja

Głównymi ograniczeniami techniki fluorometrycznej są wariancja eksperymentalna, a także utrata komórek związana z intensywnym myciem i użyciem komórek nieprzylegających.

Wariancję obserwuje się głównie ze względu na zmienność cząstek fluorescencyjnych, ponieważ ważenie i pipetowanie podczas przygotowywania roztworu podstawowego nie jest dokładnym sposobem utrzymania identycznej liczby cząstek z eksperymentu na eksperyment. Aby rozwiązać problem wariancji między eksperymentami, dane można wyraz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 μ m żółto-zielone fluorescencyjne fluokule;	Sondy molekularne	F8852	łączą 50 i mu; l z 50μ l odczynnik opsonizujący przez 30 minut w temperaturze 37oC przed użyciem
Zabicie na gorąco E. coli BioCząstki skoniugowane fluoresceiną	Sondy molekularne	E2861	rozpuszczają (5 mg) w 50 μ l PBS i połączyć z 50 μ l odczynnik opsonizujący przez 30 min w 37 & stopniach; C przed użyciem
Odczynnik opsonizujący	Sondy molekularne	E2870
Sondy molekularne	phalloidyny rodaminy	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan niebieski	Gibco	15250-061
Poniższe produkty są dostępne w wielu markach, ale przedmioty, których użyliśmy w tym badaniu, pochodzą od następujących producentów:
RPMI Pożywka do wzrostu komórek	Gibco		Uzupełniona 10% FBS i 1% pennicyliny/streptomycyny; ciepły w 37 stopniach; C przed użyciem
Czytnik płytek fluorescencyjnych - Fluostar	Omega BMG Labtech
Paraformaldehyd (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	rozcieńczyć do 4% przed użyciem
Płytki 96-dołkowe	Greiner	655097	przezroczyste lub czarne lub przezroczyste - czarne płytki Pipeta
wielokanałowa (8 - 12 kanałów)
Zbiorniki
1x probówki PBS
Microfuge (0,6 ml)
Conicles (10 ml)