Artykuł metodologiczny

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52196

⸱

3 grudnia 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Streszczenie

Badania nad korą nową ssaków umożliwiły bezprecedensowe rozwiązanie struktury kory mózgowej, aktywności i reakcji na neurodegeneracyjne uszkodzenia poprzez wielokrotne, poklatkowe obrazowanie in vivo u żywych gryzoni. Badania te były możliwe dzięki prostym zabiegom chirurgicznym, które umożliwiły dostęp optyczny przez dłuższy czas bez konieczności powtarzania zabiegów chirurgicznych. Natomiast analogiczne badania rdzenia kręgowego były wcześniej ograniczone tylko do kilku sesji obrazowania, z których każda wymagała inwazyjnej operacji. Jak opisano wcześniej, opracowaliśmy komorę kręgosłupa, która umożliwia ciągły dostęp optyczny przez ponad 8 tygodni, zachowuje stabilność mechaniczną kręgosłupa, jest łatwo stabilizowana zewnętrznie podczas obrazowania i wymaga tylko jednej operacji. W tym miejscu dokonuje się przeglądu projektu komory kręgosłupa wraz z powiązanymi z nią narzędziami chirurgicznymi oraz szczegółowo demonstruje się procedurę chirurgiczną. Pokrótce ten film pokaże przygotowanie pola operacyjnego i myszy do operacji, odsłonięcie kręgu kręgowego i odpowiednie oczyszczenie tkanek, dostarczenie implantu i zaciśnięcie kręgów, ukończenie komory, usunięcie systemu podawczego, uszczelnienie skóry i wreszcie opiekę pooperacyjną. Zademonstrowana zostanie również procedura przewlekłego obrazowania in vivo z wykorzystaniem mikroskopii nieliniowej. Na koniec omówiono wyniki, ograniczenia, typową zmienność i przewodnik rozwiązywania problemów.

Wprowadzenie

Mikroskopia poklatkowa in vivo w nienaruszonych organizmach umożliwia bezpośrednią wizualizację złożonych procesów biologicznych, które są niedostępne dla tradycyjnej analizy pojedynczego punktu czasowego, takiej jak immunohistochemia. W szczególności mikroskopia wielofotonowa (MPM)1 umożliwia obrazowanie w tkankach rozpraszających, takich jak kora nowa gryzoni, gdzie uzyskano obrazowanie do2,3 mm i ponad4,1 mm. W połączeniu z preparatami chirurgicznymi5-7, w których pojedynczy zabieg umożliwia optyczny dostęp do mózgu przez tygodnie lub miesiące, te podejścia mikroskopowe zostały wykorzystane do badania dynamicznych procesów zachodzących w mózgu w stanach zdrowych i chorych8-11. Ponadto opracowano protokoły12,13, które zapewniają obrazowanie in vivo u zwierząt obudzonych (tj. nieznieczulonych), co pozwala na obrazowanie funkcjonalne w rozdzielczości komórkowej podczas testów behawioralnych. Protokoły te zostały wykorzystane do porównań skorelowanej aktywności neuronalnej14, sygnalizacji wapniowej astrocytów15 u znieczulonych i obudzonych zwierząt, identyfikacji specyficznych dla zadania klastrów neuronalnych16 oraz zdolności neuronów do rozróżniania lokalizacji obiektu po stymulacji wąsów17.

Biorąc pod uwagę potencjał tego podejścia do wyjaśnienia zdrowych i patologicznych mechanizmów, do rdzenia kręgowego myszy (SC) zastosowano obrazowanie poklatkowe in vivo, co pozwoliło na identyfikację ostrego zwyrodnienia aksonów (AAD) jako mechanizmu chorobowego18. W kolejnych badaniach badano wpływ zmian obwodowych na regenerację aksonów zwojów korzenia grzbietowego (DRG)19, rolę naczyń krwionośnych w regeneracji aksonów20, chemotaksję glejową w odpowiedzi na uraz21, migrację limfocytów T w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) 22, aktywność mikrogleju23,24 i astrocytów25 w odpowiedzi na stwardnienie zanikowe boczne (ALS), rolę STAT-3 w kiełkowaniu aksonów po urazie SC (SCI) 26 oraz mechanizm utraty i odzyskiwania aksonów w EAE27. Pomimo sukcesu tych podejść, wszystkie te badania ograniczały się albo do pojedynczej sesji obrazowania, ograniczając w ten sposób badania do krótkoterminowej dynamiki, albo wymagały wielokrotnych operacji otwarcia zwierzęcia w każdym punkcie czasowym obrazowania, ograniczając liczbę dostępnych punktów czasowych i zwiększając prawdopodobieństwo zakłócenia artefaktów eksperymentalnych. Protokoły tych operacji zostały opublikowane wcześniej28,29.

Niedawno opublikowaliśmy technikę30 do implantacji przewlekłej komory kręgosłupa, która umożliwiła obrazowanie poklatkowe MPM u myszy SC przez wiele tygodni bez potrzeby powtarzania operacji. Krótko mówiąc, to przygotowanie chirurgiczne obejmowało wykonanie laminektomii w dolnej części odcinka piersiowego kręgosłupa i wszczepienie czteroczęściowej komory. Komora składała się z trzech specjalnie obrobionych części ze stali nierdzewnej, które zaciskały kręgi otaczające laminektomię, oraz szklanego szkiełka nakrywkowego umieszczonego na SC i zabezpieczonego elastomerem silikonowym. Technika ta pozwoliła na rutynowe obrazowanie do ponad 5 tygodni po operacji w stanach zdrowych i rannych bez konieczności powtórnych operacji. Liczba punktów czasowych obrazowania była ograniczona jedynie częstotliwością, przy której zwierzę może tolerować indukcję znieczulającą. Czas życia obrazowania był ograniczony przez wzrost gęstej, włóknistej tkanki na powierzchni SC. Ponadto sprawdziliśmy, że implant chirurgiczny nie ma długoterminowego wpływu na funkcje motoryczne.

Od czasu naszej pierwszej publikacji, alternatywne podejścia umożliwiające również długoterminowe obrazowanie w SC zostały opisane gdzie indziej31-33. Ten protokół pokazuje naszą procedurę wszczepienia implantu komory kręgosłupa, którą opracowaliśmy.

Protokół

UWAGA: Opieka i eksperymentalna manipulacja wszystkimi myszami w tym artykule została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Wysterylizuj wszystkie wymagane narzędzia za pomocą autoklawu lub zatwierdzonych procedur sterylizacji. Należą do nich co najmniej skalpel, nożyczki, nożyczki vanna, kleszcze, śrubokręt jubilerski, waciki, zestaw retraktorów, implant (ryc. 1A) i jego system dostarczania (ryc. 1D, E).
  2. Przetrzyj wszystkie powierzchnie, w tym wszelkie pokrętła stereoskopowe, 70% etanolem i/lub odpowiednimi środkami dezynfekującymi.
  3. Stwórz sterylne pole, nakładając na siebie niestandardowy stereotax (rysunek 1D) i otaczając blat stołu sterylnymi zasłonami. Poduszka grzewcza (najlepiej sterowana sprzężeniem zwrotnym) powinna być umieszczona na górze stereotax i pod sterylnymi zasłonami.

2. Przygotowanie myszy do operacji

  1. Znieczulij mysz poniżej 5% izofluranu/tlenu w komorze indukcyjnej, aż częstość oddechów spadnie do około 1 oddechu/s.
  2. Przenieś mysz do miejsca postoju z dala od sterylnego pola, używając stożka nosowego w celu kontynuowania ekspozycji na izofluran. Zmniejsz izofluran do 2%. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  3. Podawać glikopironurolan (lek antycholinergiczny) w dawce 0,05 mg/100 g myszy domięśniowo do kończyn tylnych za pomocą igieł 29 - 30 G i strzykawki 3/10 cc, dostarczając około 50% objętości wstrzyknięcia na kończynę.
    UWAGA: Glikopirolan służy do zapobiegania gromadzeniu się płynu w płucach, gdy mysz jest pod narkozą.
  4. Za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia ogol część grzbietowej części myszy o długości około 3 cm i szerokości 2 cm, wyśrodkowaną na łuku piersiowym. Oczyść przycięte włosy z dala od ogolonego obszaru.
  5. Następujące wstrzyknięcia należy podać podskórnie i dystalnie na ogolony plaster za pomocą igieł 29 - 30 G i strzykawek 3/10 cm3: 1 ml/100 g mysi 5% glukozy w soli fizjologicznej (do nawodnienia), 5 mg/kg mysiego ketoprofenu (NLPZ do analgezji), 0,2 mg/kg mysiego deksametazonu (steryd przeciwzapalny w celu zmniejszenia stanu zapalnego).
  6. Za pomocą bawełnianych wacików wykonaj trzy naprzemienne płukania jodem i 70% etanolem, odczekując 1 minutę między praniami.
  7. Podawać 100 μl 0,125% bupiwakainy (blokady nerwów obwodowych) podskórnie za pomocą igieł 29 - 30 G i strzykawki 3/10 cc do środka ogolonego plastra, aby zmniejszyć ból w miejscu nacięcia.
  8. Przenieś mysz do niestandardowego stereotaxu (Rysunek 1D), włóż termometr doodbytniczy i odczekaj około 10 minut, aż bupiwakaina zacznie działać.

3. Odsłoń i oczyść blaszki grzbietowe z 3 sąsiednich kręgów piersiowych

  1. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj małe (5 mm lub mniej) nacięcie nad kręgami będącymi przedmiotem zainteresowania (ryc. 2A).
  2. Za pomocą kleszczy lub wkładając końcówkę nożyczek chirurgicznych i rozkładając uchwyty, zwiększ rozmiar otworu w skórze przez rozwarstwienie.
  3. Za pomocą skalpela lub nożyczek chirurgicznych delikatnie rozdziel powięź łączną między skórą a leżącym pod nią mięśniem.
  4. Użyj zwijaczy, aby przytrzymać skórę, pozwalając na uzyskanie jak największego obszaru roboczego (Rysunek 2B). Uważaj, aby nie zwiększać obciążenia klatki piersiowej, a tym samym nie utrudniać oddychania.
  5. Za pomocą kleszczy chwyć najbardziej wysunięty kręg rostralny, który będzie odsłonięty przez leżący nad nim mięsień. Za pomocą skalpela odetnij tkankę po obu stronach wyrostka grzbietowego ze wszystkich 3 kręgów (ryc. 2c).
  6. Używając dowolnej kombinacji ostrza skalpela, wacików bawełnianych i/lub skrobaka do kości, usuń całą leżącą na powierzchni tkankę z blaszek grzbietowych (ryc. 2D).
  7. Za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie odetnij ścięgna przyczepione do kręgów na obu bocznych krawędziach kręgosłupa (ryc. 2E).
  8. Za pomocą skalpela delikatnie usuń jak najwięcej tkanki z bocznych krawędzi kręgosłupa, aby zapewnić czystą powierzchnię zaciskania.
  9. Delikatnie oczyścić kręgi z pozostałych tkanek miękkich za pomocą skrobaka do kości i/lub wacika. Odetnij wszelkie niepasujące tkanki w innym miejscu za pomocą nożyczek chirurgicznych (ryc. 2F).
    UWAGA: Zarówno przy zaciskaniu, jak i wykonywaniu laminektomii grzbietowej ważne jest, aby kręgi były czysto odsłonięte. Kauteryzator może być przydatny w kontrolowaniu późniejszego krwawienia.
  10. Przesuń zwijacze, aby zatrzymać tkankę otaczającą kręgosłup oprócz skóry (ryc. 2F).
  11. Przymocuj pręty boczne implantu do zębów na słupkach porodowych i załaduj je do uchwytów wkładu (jak na rysunku 1E).
  12. Zacisnąć 3 kręgi za pomocą prętów bocznych, wywierając nacisk wystarczający do bezpiecznego trzymania (Rysunek 2G, H). Użyj kleszczy, aby zapewnić równe zaciśnięcie 3 kręgów. Należy pamiętać, że może być konieczne podjęcie kilku prób. Upewnij się, że pręty boczne są zarówno poziome, jak i równoległe przed wykonaniem laminektomii.
  13. Ostrożnie oczyść i osusz grzbietową powierzchnię zaciśniętych kręgów za pomocą bawełnianych wacików.

4. Wykonaj laminektomię grzbietową

  1. Włóż końcówki nożyczek vannas do przestrzeni zewnątrzoponowej przyśrodkowego kręgu zaciśniętego i lekko ściśnij uchwyty; jeśli kość jest sucha, powinna pęknąć na całej długości blaszki grzbietowej. Powtórz tę procedurę po stronie przeciwnej, aby uwolnić blaszkę.
  2. Delikatnie chwytając luźną blaszkę wyrostkiem grzbietowym kleszczami, ostrożnie odetnij tkankę łączną na rostralnych i ogonowych końcach blaszki i podnieś ją.
  3. Używając 0,9% soli fizjologicznej i/lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), dokładnie zmyj krew pokrywającą rdzeń kręgowy. Użyj bawełnianych wacików, aby wchłonąć nadmiar płynu.
  4. Za pomocą nożyczek vannas ostrożnie przytnij boczne krawędzie kości z powrotem do bocznych prętów implantu. Ponownie zmyj i zatamuj krwawienie za pomocą wacików i soli fizjologicznej/ACSF.
  5. W przypadku, gdy część okostnej oderwała się i pokrywa rdzeń kręgowy, delikatnie usuń tę tkankę za pomocą bawełnianych wacików i/lub igły 29 - 30 G. Należy uważać, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego w tej części zabiegu. Nie należy mylić luźnej okostnej z ciasno owiniętą oponą twardą.
  6. Ostrożnie uszczelnij pozostałe odsłonięte krawędzie kości jednym lub obydwoma z akrylu dentystycznego i cyjanoakrylanu (ryc. 2I). Zachowaj szczególną ostrożność, aby kleje nie spływały na odsłonięty rdzeń kręgowy.

5. Zapieczętuj komorę

  1. Ostrożnie ustaw górną płytę tak, aby 4 szczeliny pokrywały się z 4 otworami w prętach bocznych, a otwór wykraczał poza odsłonięty rdzeń kręgowy (Rysunek 1B i 2J).
  2. Za pomocą śrubokręta jubilerskiego ostrożnie wkręć pierwszą, stabilizując trzonek śrubokręta kolejną parą kleszczy. Nie dokręcaj na tym etapie, ale włóż ją tak, aby kilka pierwszych gwintów było zazębionych. Powtórz ten proces dla pozostałych 3.
    UWAGA: Na tym etapie warto użyć kleszczy tytanowych lub innych niemagnetycznych, aby pomóc w ustawieniu.
  3. Po wkręceniu wszystkich 4 dokręcaj każdą naprzemiennie o tę samą wartość w małych odstępach, aż zostaną mocno dokręcone (Rysunek 2K). Należy pamiętać, że nie jest niczym niezwykłym, że górna płyta wygina się podczas tego procesu. Uważaj, aby nie dokręcać zbyt mocno, ponieważ może się złamać, a nadmierny nacisk w dół spowoduje przemieszczenie zacisku i/lub uszkodzenie rdzenia kręgowego.
  4. Użyj elastomeru silikonowego, aby wypełnić przestrzeń między rdzeniem kręgowym a szklanym okienkiem. Ponieważ podczas utwardzania nie wytwarza kwasu octowego, należy używać elastomeru marki KwikSil i końcówek mieszających. Nałóż obficie porcję silikonu na odsłonięty rdzeń kręgowy. Należy uważać, aby pozbyć się wszelkich pęcherzyków powietrza zawierających silikon z końcówki mieszającej przed nałożeniem na rdzeń kręgowy.
  5. Pracując szybko, delikatnie wciśnij szkiełko nakrywkowe #0 o grubości 5 mm we wstawkę w górnej płycie. Zastosuj wystarczający nacisk, aby stopniowo ścisnąć płynny elastomer, aby otoczyć rdzeń kręgowy, ale nie spowodować ucisku rdzenia kręgowego (ryc. 2L). Czas wiązania elastomeru wynosi około 90 sekund, dlatego upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest nakładane szybko.
  6. W przypadku nieudanego uszczelnienia należy poczekać, aż elastomer stwardnieje, delikatnie usunąć go z implantu za pomocą kleszczyków i powtórzyć 5,4 - 5,5.
  7. Przykryj krawędzie elastomeru z wysiękiem akrylowym / cyjanoakrylem dentystycznym i przyklej do otaczającej kości tak bardzo, jak to możliwe, aby zapobiec przesuwaniu się elastomeru po powierzchni rdzenia kręgowego.
  8. Usuń retraktory i pociągnij skórę do góry wokół krawędzi implantu. Za pomocą cyjanoakrylanu przyklej skórę do krawędzi implantu (ryc. 2M, N).
  9. Włóż dociskowe #0-80 - 1/4" w skrzydła płyty górnej (Rysunek 1C i 2O).
  10. Za pomocą akrylu dentystycznego uszczelnij wszelkie szczeliny w otworach na w górnej płycie (Rysunek 2P).

6. Opieka pooperacyjna

  1. Wyjmij zwierzę ze znieczulenia i umieść w dużej, czystej klatce. Upewnij się, że klatka jest wystarczająco duża, aby komora nie zaczepiła się o nic (np. zanurzenie w kształcie litery V na butelkę z wodą i/lub jedzenie) podczas normalnego poruszania się po klatce.
    UWAGA: Standardowa klatka dla szczurów jest idealna.
  2. Umieść klatkę na rozgrzanej powierzchni, podczas gdy zwierzę dochodzi do siebie. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  3. Sprawdź zachowanie zwierzęcia w ciągu 1-2 godzin po operacji pod kątem oznak bólu lub niepokoju oraz integralności implantu.
    UWAGA: W normalnych warunkach zwierzę powinno być w stanie poruszać się z niewielkimi zaburzeniami ruchu.
  4. Kontynuuj sprawdzanie zwierzęcia co 8-12 godzin przez pierwsze 72 godziny, mierząc wagę i monitorując zachowanie. Sprawdź, czy zwierzęta są aktywne i ruchliwe w nocy. Mokra karma w postaci mielonej karmy zmieszanej z wodą lub żelami odżywczymi, granulkami karmy i wodą pitną powinna być zapewniona na poziomie gruntu. W razie potrzeby należy zapewnić dodatkowe nawodnienie za pomocą wstrzyknięć podskórnych lub dookostnowych.
  5. Podawanie 5 mg/kg ketoprofenu u myszy i 0,2 mg/kg deksametazonu u myszy należy podawać podskórnie w 24 i 48 godzinach po operacji. Dodatkowo 0,005-0,010 mg/100 g myszy należy podawać co 8 godzin we wstrzyknięciu podskórnym przez 72 godziny.

7. Obrazowanie in vivo

  1. Znieczulij mysz poniżej 5% izofluranu/tlenu w komorze indukcyjnej, aż częstość oddechów spadnie do około 1 oddechu/s.
  2. Przenieś mysz do niestandardowego stereotaxa (rysunek 1D) z poduszką grzewczą sterowaną sprzężeniem zwrotnym i włóż termometr doodbytniczy. Zmniejsz izofluran do 2%.
  3. Glikopirolan 0,05 mg/100 g myszy podawać domięśniowo do kończyn tylnych za pomocą igieł 29 - 30 G i strzykawki 3/10 cm3, dostarczając około 50% objętości wstrzyknięcia na kończynę.
  4. Podawać 1 ml/100 g mysiej 5% glukozy (dla nawodnienia) podskórnie w soli fizjologicznej raz na godzinę.
  5. Włóż gwintowane uchwyty komór do uchwytów na słupki używane do operacji (ryc. 1F). Wyreguluj wysokość i przekręć słupki na dociskowe w płycie górnej.
  6. Po zamocowaniu obu uchwytów podnieś uchwyty w uchwytach słupków, aż klatka piersiowa będzie mogła swobodnie rozszerzać się pod wpływem wdechu.
    UWAGA: Zarówno mocne mocowanie uchwytów, jak i swobodne rozszerzanie się klatki piersiowej znacznie redukują artefakty ruchu spowodowane oddychaniem.
  7. Wykonaj obrazowanie zgodnie z potrzebami.
  8. Po zakończeniu obrazowania opuść słupki, odkręć uchwyty komory, wyjmij termometr doodbytniczy i umieść mysz na rozgrzanej powierzchni, aby odzyskać sprawność. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

Wyniki

Postępując zgodnie z powyższą procedurą, każdy etap operacji powinien odzwierciedlać wyniki dla każdego etapu zabiegu przedstawione na Rysunku 2. Należy zachować szczególną ostrożność podczas nakładania elastomeru silikonowego, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza pod szkłem lub przynajmniej upewnić się, że znajdują się one na obrzeżach obszaru zainteresowania (Rysunek 2L). W przypadku doświadczonego chirurga powikłania chirurgiczne wymagające eutanazji w trakcie operacji lub w ciągu pierwszych 24 h po zabiegu występują w około 20% operacji. Powikłania te najczęściej wynikają z nadmiernego krwawienia tkanek miękkich lub nieprawidłowego przymocowania komory do kręgosłupa.

W przypadku pomyślnie zaimplantowanych komór okno zazwyczaj pozostaje optycznie przezroczyste przez wiele tygodni (Rysunek 3). Mimo dołożenia wszelkich starań, często w ciągu kilku dni tworzy się nieprzezroczysty, włóknisty rozrost nowotworowy, co prowadzi do częściowego przesłonięcia okna (Rysunek 3C - F, czarna przerywana linia). Struktury fluorescencyjne są trudne do zaobserwowania za pomocą mikroskopii 2PEF pod taką tkanką włóknistą. Odnotowaliśmy bimodalny rozkład wyników: w około 50% przypadków pomyślnie zaimplantowane okna pozostawały przejrzyste przez ponad 5 tygodni po operacji, a w około 50% stały się nieprzejrzyste w ciągu 1 - 3 tygodni. W przypadku okien, które pozostały przejrzyste, w większości miejsc w obrębie okna obserwacyjnego występuje jedynie umiarkowany stopień neowaskularyzacji w obrębie lub powyżej opony twardej (Rysunek 3D - F, zielone gwiazdki), co nie utrudnia obrazowania 2PEF. Nasze poprzednie badanie30 wykazało wzrost gęstości mikrogleju, ale nie astrocytów pod oknem i w sąsiednich kręgach, co wskazuje na łagodny stan zapalny analogiczny do tego obserwowanego w preparatach okien czaszkowych5.

U myszy transgenicznych wykazujących ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w podzbiorze neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG) (linia YFPH; Jackson Labs), aksony były wyraźnie rozróżnialne przez wiele tygodni po operacji (Rycina 4A i b), a u jednego zwierzęcia nawet przez cztery miesiące (dane nie pokazano). Naczynia krwionośne (Rycina 4A i B) uwidoczniono poprzez retroorbitalne wstrzyknięcie do osocza krwi dekstranu znakowanego fluorescencyjnie Texas Red. Mikroglej wizualizowano również u myszy z knock-in GFP w genie CX3CR1 (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) skrzyżowanych z linią YFPH (Rycina 4C). Kontrast i rozdzielczość ulegały umiarkowanemu pogorszeniu w czasie (Rycina 4C) z powodu tworzenia się opisanego wcześniej przerostu włóknistego30. Rutynowo obrazowano przez 3 hr w jednej sesji bez śmiertelności i tak często, jak co 12 hr. Czas trwania i częstotliwość sesji są ograniczone tolerancją zwierzęcia na indukcję znieczulenia, zgodnie z względami etycznymi dotyczącymi bólu i stresu zwierząt laboratoryjnych.

Komponenty zestawu mechanicznego do spektroskopii, schemat i zdjęcia; układ do pomiarów optycznych.
Rycina 1. Niestandardowy zestaw chirurgiczny ułatwia wprowadzanie komory podczas implantacji i stabilizuje ją podczas późniejszych sesji obrazowania. Dwa boczne wsporniki i płyta górna (A) są montowane (B) za pomocą małych śrub w komorze rdzenia kręgowego (C). Stół chirurgiczny z wysuwanymi wspornikami (D) umożliwia wprowadzanie i mocowanie bocznych wsporników do kręgów za pomocą pinów mocujących (E). W kolejnych sesjach obrazowania zamiast nich stosuje się wsporniki z wewnętrznym gwintem, które są mocowane do komory za pomocą śrub ustalających na skrzydłach implantu (F). Panel b tej ryciny został zmodyfikowany na podstawie pracy Farrar et al., Nature Methods, 201230 za zgodą Nature Publishing Group. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Metoda chirurgiczna; nacięcie skóry zwierzęcia i stabilizacja kości; sekwencja; procedura badań medycznych.
Rycina 2. Wykonanie laminektomii grzbietowej i implantacja chronicznej komory obrazowania w celu zapewnienia dostępu optycznego do rdzenia kręgowego. Procedura została przedstawiona w formie montażu. Najpierw odsuwa się skórę (panele A, B; sekcje protokołu 3.1 - 3.4) i mięśnie (C; 3.5), aby odsłonić trzy leżące poniżej kręgi. Tkankę pokrywającą te trzy kręgi usuwa się (D, E, F; 3.6 - 3.10), a wyrostki boczne oczyszcza się przez skrobanie przed ich zaciśnięciem po obu stronach (G, H; 3.12). Ostrożnie usuwa się blaszkę łukową kręgu centralnego i uszczelnia krawędzie kości (I; 4. 6). Następnie nakłada się płytkę górną (J; 5.1) i dokręca śruby (K; 5.3), aby zabezpieczyć komorę przed jej uszczelnieniem elastomerem silikonowym i szkiełkiem nakrywkowym (L; 5.5). Po usunięciu pinów pozycjonujących (M; 5.8) skórę przykleja się do boków komory (M, N; 5.8), a śruby dociskowe wkłada się w skrzydła (O; 5.9). Na koniec otwory na śruby uszczelnia się akrylem dentystycznym (P; 5.10), a mysz umieszcza się w czystej klatce w celu rekonwalescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces gojenia mózgu; obrazy z mikroskopu poklatkowego; 7 etapów; strzałka wskazuje kierunek gojenia.

Rysunek 3. Przewlekła komora rdzeniowa pozostaje optycznie przezroczysta przez wiele tygodni. Obrazy rdzenia kręgowego w świetle białym, od kilku minut (A) do trzech tygodni po operacji (F). Punkty orientacyjne naczyń krwionośnych są możliwe do zidentyfikowania we wszystkich punktach czasowych (żółte strzałki). W pierwszym dniu po operacji (B) widoczne są niewielkie zmiany. Gęty rozrost włóknisty (C - F, ograniczony przerywaną linią w prawym dolnym rogu) pojawia się już w trzecim dniu i prowadzi do częściowego przesłonięcia obszaru obrazowania. Obecna jest również łagodna neowaskularyzacja (D, E, F, zielone gwiazdki), która jednak nie przesłania pierwotnych naczyń w obrazowaniu w świetle białym ani w 2PEF.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

<p>Fluorescencyjne obrazowanie naczyń; wzrost w ciągu 1–14 dni; wyniki mikroskopii konfokalnej.</p>

Rycina 4. Przewlekła komora rdzeniowa umożliwia wielokrotne obrazowanie wielofotonowe bez konieczności przeprowadzania ponownych operacji. Wielokrotne obrazowanie myszy transgenicznych wykazujących ekspresję YFP w podzbiorze aksonów zwojów korzeni grzbietowych (DRG) (zielony) w sznurach tylnych rdzenia kręgowego oraz naczyń krwionośnych (czerwony) znakowanych poprzez dożylny wtrysk barwnika (A, B). Aktywność mikrogleju (jasnofioletowy) może być również monitorowana w czasie u myszy podwójnie transgenicznych Thy1-YFP/CX3CR1-GFP (C). Choć aksony i mikroglej pozostają widoczne, kontrast i rozdzielczość ulegają niewielkiemu pogorszeniu w czasie (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zaprezentowana tutaj technika pozwala na wielokrotne, poklatkowe, obrazowanie in vivo myszy grzbietowej SC od wielu tygodni po operacji bez konieczności wykonywania kolejnych zabiegów chirurgicznych. Procedura ta stanowi znaczną poprawę w porównaniu z badaniami obrazowania z powtarzanymi operacjami chirurgicznymi lub z metodami histologicznymi typu portmortem, w których dochodzi do utraty informacji na temat dynamiki komórkowej. Wcześniej30 osób wykazało wartość tej techniki w badaniu patologii SCI in vivo.

Maksymalny zakres podłużny obrazowania określono na podstawie wzrostu gęstej, włóknistej tkanki na grzbietowej powierzchni SC. Z biegiem czasu wzrost ten spowodował utratę kontrastu i rozdzielczości obrazu. Wzrost ten zaobserwowano również w alternatywnych preparatach chirurgicznych31. Anegdotycznie zaobserwowaliśmy, że wzrost ten można zminimalizować poprzez staranne umycie grzbietowej powierzchni SC w celu usunięcia produktów krwiopochodnych, uszczelnienie powierzchni przeciętej kości cyjanoakrylanem, uszczelnienie krawędzi komory elastomerem silikonowym i zminimalizowanie przestrzeni śródmiąższowej między grzbietowym SC a szkłem nakrywkowym.

Ostatnio zademonstrowano inne podejście podobne do naszego, wykorzystujące komorę z poliwęglanu32. Zastosowanie poliwęglanu jest korzystne, ponieważ jest on kompatybilny z metodami obrazowania rentgenowskiego i akustycznego, co nie ma miejsca w przypadku naszych części ze stali nierdzewnej. Jednak dzięki wszechobecnej obecnie technologii drukarek 3D, części komór mogą być wytwarzane z szerokiej gamy materiałów, aby dopasować je do konkretnych potrzeb. Niedawno wydrukowaliśmy wszystkie nasze części z przezroczystego fotopolimeru.

Jedną z kluczowych wad zamkniętej komory jest brak możliwości podawania wielokrotnych dawek leków lub barwników egzogennych odpowiednich do obrazowania SC34. Jednakże, wykorzystując stabilność mechaniczną naszego obecnego systemu, wykorzystaliśmy już naszą obecną komorę do pomyślnego zakotwiczenia cewnika dooponowego połączonego z podskórnie wszczepionym portem iniekcyjnym, co pozwoliło na dostarczanie leku w wielu punktach czasowych, nawet w systemie zamkniętej komory (nieopublikowana praca). Ponadto, ze względu na modułowy charakter górnej płytki, przyszłe wersje tego preparatu będą zawierały zamykaną komorę, która pozwoli na wielokrotne nakładanie zarówno środków terapeutycznych, jak i etykiet fluorescencyjnych. Możliwe jest również wyobrażenie sobie górnych płyt z mocowaniami do elektrod rejestrujących, wkładek optycznych i portów do podawania leków. Takie dodatki byłyby prawdopodobnie trudniejsze do wdrożenia przy użyciu bardziej minimalistycznego systemu Fenricha i wsp. 31. Podsumowując, nasza izba stanowi platformę bramową, na której można opierać różnorodne eksperymenty.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Josephowi R. Fetcho za jego wkład w rozwój procedury. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe ze strony amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (R01 EB002019 dla C.B.S i DP OD006411 dla Josepha R. Fetcho) oraz Narodowej Rady Nauki i Badań Kanady (dla M.J.F.) za wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nożyczki VannasFine Science Tools15000-04
kleszcze, nożyczki, skalpel itp.Narzędzia Fine Sciencewielokrotne 
zestaw zwijacza -stabilizator magnetycznyFine Science Tools18200-02
zestaw zwijacza -zwijaczFine Science Tools18200-09można również stosować inne zwijacze
zestaw zwijacza -elastomerFine Science Tools18200-07
koc grzewczy sterowany sprzężeniem zwrotnymCWE Inc.Model: Mysz TC-1000                          Część nr 08-13000
stereotaxpatrz Farrar i wsp., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplement (online)
komorapatrz Farrar i wsp., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplement (online)
uchwytypatrz Farrar i wsp., Nat. Meth., 9, 297, 2012, Suplement (online)
Klej cyjanoakrylowyLoctite Loctite495wielokrotny dostawcy
Teets Cold Cure Coral Powder (dentystyczny proszek akrylowy)TeetsMfg. Część: 8101wielu dostawców
Teets Cold Cure Liquid (dentystyczny płyn akrylowy)TeetsMfg. Część: 8501wielu dostawców
GlikopirolanMWI Zaopatrzenie weterynaryjneMWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG5767
Zaopatrzenie weterynaryjneBupiwakainyMWI Kod produktu: 029841 (Hospira 116301)
KetoprofenMWI Zaopatrzenie weterynaryjneMWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
DeksametazonMWI Zaopatrzenie weterynaryjneMWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
KwikSil Końcówki mieszająceWorld Precision Inc.KWIKMIX (Mieszanka Przemysłowa
rdzeniowa komory rdzeniowej

Bibliografia

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459(2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910(2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227(2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760(2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081(2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Implantacja komory rdzeniowejprocedura chirurgicznamikroskopia wielofotonowazaciskanie kr g wlaminektomia grzbietowauszczelnianie elastomerem silikonowymobrazowanie chroniczneopieka pooperacyjna
Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.