Artykuł metodologiczny

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

30.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52197

⸱

4 maja 2015

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular Cardiovascular Research, RWTH Aachen University, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Streszczenie

Zawał mięśnia sercowego nadal pozostaje główną przyczyną zgonów w krajach zachodnich, pomimo znacznego postępu w dziedzinie rozwoju stentów w ostatnich dziesięcioleciach. W celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw i opracowania nowych strategii terapeutycznych dostępność odpowiednich modeli zwierzęcych jest obowiązkowa. Ponieważ do walki z zawałem mięśnia sercowego potrzebne są nowe informacje na temat patomechanizmów chorób sercowo-naczyniowych w warunkach in vivo, kluczowym aspektem jest trafność modelu zwierzęcego. W tym kontekście bardzo istotna jest jednak ochrona zwierząt. Dlatego tworzymy minimalnie inwazyjny i prosty model zawału mięśnia sercowego u myszy, który zapewnia wysoką odtwarzalność i przeżywalność zwierząt. Tym samym model ten spełnia wymagania zasady 3R (Replacement, Refinement and Reduction) dla doświadczeń na zwierzętach i zapewnia informacje naukowe potrzebne do dalszego rozwoju strategii terapeutycznych w chorobach sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

Zawał mięśnia sercowego jest jedną z głównych przyczyn zgonów w krajach uprzemysłowionych. Pomimo niezaprzeczalnego postępu w zakresie metod diagnostycznych i terapeutycznych, choroby układu krążenia nadal są główną przyczyną śmiertelności. Biorąc pod uwagę poprawę średniej długości życia i zagrożeń związanych z życiem, w przyszłości spodziewany jest ciągły wzrost zachorowalności na choroby sercowo-naczyniowe. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustanowienia i walidacji nowych podejść do leczenia chorób sercowo-naczyniowych. Informacje z badań na ludziach cierpią z powodu swoich ograniczeń, badania te są na ogół niewystarczające do wyjaśnienia i zrozumienia mechanizmów na poziomie molekularnym, nie będąc w stanie zapewnić rozwiązań tych głównych problemów zdrowotnych.

Ponadto, badania podstawowe zostały ograniczone ze względu na złożoność i trudności w odtworzeniu mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych w laboratorium. Dlatego, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat patofizjologii chorób sercowo-naczyniowych, niezbędna jest walidacja modeli zwierzęcych1,2. Jednak, aby zidentyfikować wszystkie kaskady zdarzeń molekularnych zaangażowanych w gojenie po zawale mięśnia sercowego, konieczna jest analiza w różnych punktach czasowych, co powoduje dużą liczbę eksperymentów na zwierzętach.

Eksperymenty z zawałem mięśnia sercowego są często przeprowadzane przy użyciu modeli zwierzęcych. Indukowanie zawału mięśnia sercowego u małych zwierząt3-11 jest najbardziej odpowiednim i skutecznym modelem stosowanym do badania zdarzeń komórkowych i molekularnych niż duże modele zwierzęce. Co więcej, żaden inny gatunek nie wykazuje takiej dostępności szczepów transgenicznych lub nokautujących jak myszy12. Te mysie modele są bardzo przydatne w innych chorobach, w tym patologiach sercowo-naczyniowych (takich jak miażdżyca, restenoza stentu)13,14. Ponadto krótki okres ciąży i duża liczba potomstwa kwalifikują modele mysie jako najbardziej atrakcyjny system do badania mechanizmów molekularnych zawału mięśnia sercowego12.

Niemniej jednak, wielkość serca u myszy oczekuje wysokiej precyzji manipulacji podczas mikrochirurgii. Szkolenie tak wykwalifikowanego i wykwalifikowanego personelu chirurgicznego jest procesem czasochłonnym i pracochłonnym. Dlatego przedstawiamy tutaj szczegółową procedurę mikrochirurgiczną, w tym wskazówki i porady, które pomogą współpracownikom nawet o przeciętnych kwalifikacjach, takim jak studenci lub technicy, wykonać złożony model zawału mięśnia sercowego u myszy.

Początkowo intubacja odbywa się za pomocą krótkiej kaniuli bez użycia tracheotomii. Nacięcie klatki piersiowej znajduje się w obszarze międzyżebrowym, co pozwala uniknąć uszkodzenia żeber i/lub otaczających tkanek. Ten podetap jest bardzo istotny, aby zapewnić szybki powrót do zdrowia i gojenie15. Podwiązanie jest zróżnicowane dla modeli przewlekłego niedokrwienia i niedokrwienia/reperfuzji, co zapewnia wysoki wskaźnik przeżycia przy jednoczesnym zachowaniu znacznego rozmiaru zawału. Z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie szwów jedwabnych zapewnia wyższą powtarzalność w porównaniu z kriourazami16.

Podsumowując, opisana tutaj metoda ma zastosowanie zarówno w modelach przewlekłego niedokrwienia, jak i niedokrwienia/reperfuzji u małych zwierząt. Porady i wskazówki przedstawione w tej procedurze mają na celu umożliwienie personelowi o nawet niskich lub średnich kwalifikacjach zastosowania jej w modelach małych zwierząt.

Protokół

UWAGA: Eksperymenty przedstawione w tym artykule są przeprowadzane zgodnie z niemieckimi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zwierzęta są hodowane w Instytucie Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych Szpitala Uniwersyteckiego w Akwizgranie w Niemczech, pod nadzorem prof. dr R. Tolba i dr A. Teubnera (inspektora ds. dobrostanu zwierząt).

1. Opieka nad zwierzętami

  1. Trzymaj myszy w specjalistycznym oddziale opieki, zapewniając odpowiedni dostęp do pożywienia oraz specjalistyczną kontrolę i leczenie weterynaryjne. Jeśli zwierzęta są przenoszone lub kupowane z zewnątrz, prosimy o zapewnienie tygodniowego zakwaterowania przed poddaniem się zabiegowi.

2. Intubacja

  1. Znieczulić 8-10 tygodniowe samce myszy typu dzikiego C57Bl/6, 25-27 g, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Monitoruj poziom znieczulenia za pomocą odruchów szczypania palców u stóp. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
  2. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy przeprowadzić terapię przeciwbólową buprenofiną w dawce 0,1 mg/kg masy ciała podskórnie, postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.
  3. Zapewnij utrzymanie sterylnych warunków, aby uniknąć infekcji podczas operacji, używając sterylnych materiałów i narzędzi.
  4. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na rozgrzanym stole operacyjnym. Usuń włosy z obu brzusznych części szyi i lewej połowy klatki piersiowej za pomocą małej maszynki do golenia i zdezynfekuj 70% alkoholem przed nacięciem.
    1. Wykonaj małe środkowe nacięcie 0,5 cm za pomocą nożyczek chirurgicznych na środku szyi. Pod skórą przejdź przez 2 ciała tłuszczowe za pomocą sterylnych zakrzywionych kleszczy i uwidocznij tchawicę pod mikroskopem stereoskopowym przez przezroczystość mięśnia pokrywającego.
  5. Wprowadzić doustnie kaniulę intubacyjną do tchawicy view za pomocą stereomikroskopu (ryc. 1A). Rozróżnij metalową kaniulę przez przezroczystą tkankę. I w każdej chwili sprawdź pozycję i lokalizację podczas operacji (Rysunek 1B).
  6. Podłącz kaniulę do respiratora dla małych zwierząt i dostosuj ustawienia wentylacji zgodnie z wytycznymi producenta (objętość oddechowa między 100-150 μl i częstość oddechów między 100-150 na minutę).

3. Indukcja zawału mięśnia sercowego

  1. Wykonaj nacięcie skóry w odległości mniejszej niż 0,5 cm w środku linii między ksyloidem a lewą osią. Użyj kleszczy, aby oddzielić warstwę mięśniową od leżących pod nią żeber.
  2. Wykonaj małe nacięcie między żebrami za pomocą małych nożyczek, aż jama piersiowa zostanie otwarta17. W przypadku przewlekłego zawału należy wykonać nacięcie w 5. przestrzeni międzyżebrowej (ryc. 1C) i/lub w przypadku modelu niedokrwienia/reperfuzji, w 4. przestrzeni międzyżebrowej (ryc. 1D): dla łatwiejszego podejścia należy policzyć odpowiednio poniżej 2. i 3. przestrzeni międzyżebrowej).
  3. Umieść retraktory w nacięciu, aby otworzyć klatkę piersiową i uwidocznić serce.
  4. Ostrożnie usuń osierdzie, aby zapobiec nadmiernym procesom zwłóknienia.
  5. Wyobraź sobie lewą zstępującą tętnicę wieńcową (LAD) jako głęboko osadzone jasnoczerwone naczynie. Jeśli nie można zwizualizować LAD, należy wziąć pod uwagę kilka punktów odniesienia, aby zwiększyć odtwarzalność.
    1. W przypadku modelu przewlekłego zawału należy umieścić ligaturę pośrodku brzusznej strony serca (między małżowiną uszną a wierzchołkiem), mając jako odniesienie żyłę, jak pokazano na rycinie 1C. Zwiąż obie gałęzie tętnicy za pomocą jedwabnego szwu 0/7, aby uzyskać przezścienny przedni i tylny zawał. Kolor szary wskazuje położenie ligatury i w razie potrzeby można go powtórzyć (Rysunek 1C).
    2. W przypadku modelu niedokrwienia/reperfuzji umieść ligaturę pod małżowiną uszną, nad głównym korpusem LAD (ryc. 1D). Ligatura znajduje się nad silikonową rurką, aby chronić integralność naczynia. Szary kolor oznacza obszar zawału i powinien pojawić się w całym sercu (ryc. 1D). Zakładaj szwy skroniowe na żebra w okresie niedokrwienia i zwilż kompresem, aby uniknąć wysuszenia tkanek. Po niedokrwieniu usuń silikonową rurkę i przetnij szew małymi nożyczkami, aby uwidocznić reperfuzję.
  6. Oprócz środków znieczulających i przeciwbólowych stosowanych na początku zabiegu (kroki 2.1 i 2.2), podczas operacji należy stosować 0,5% izofluranu, aby zapewnić odpowiedni komfort zwierzęcia, lub postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.

4. Szwy i rekonwalescencja

  1. Wyeliminuj resztki powietrza z klatki piersiowej, wypełniając go ciepłym roztworem soli izotonicznej.
  2. Zamknij klatkę piersiową za pomocą 3 szwów 0/6 (jak pokazano na rycinie 2A i 2B). Umieścić szwy przyśrodkowe pod kątem 90°, aby zapewnić szczelne zamknięcie żeber, jak pokazano na rysunku 2 (rysunek 2A, B).
  3. Zamknij warstwę mięśniową za pomocą 2 szwów (ryc. 2C), a skórę za pomocą 3-4 szwów 0/6 (ryc. 2D). Szwy te należy wykonać osobno, aby uzyskać odpowiednie okno do dalszych pomiarów echokardiograficznych.
  4. Odłącz kaniulę intubacyjną od respiratora i pozwól na spontaniczny oddech. W celu późniejszej identyfikacji oznacz mysz za pomocą lokalnego systemu (zapytaj urzędnika ds. dobrostanu zwierząt w swojej placówce).
  5. Połóż mysz po lewej stronie pod czerwoną lampą, aż się obudzi. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności. Nie pozwól, aby zwierzę, które przeszło operację, przebywało w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
  6. Terapię przeciwbólową należy podawać buprenofiną w dawce 0,1 mg/kg masy ciała podskórnie przez następne 3 dni, postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej placówce.

5. Analiza zawału mięśnia sercowego

  1. Regularnie monitoruj czynność serca za pomocą echokardiografii (ryc. 3A): frakcji wyrzutowej, skrócenia frakcyjnego, pojemności minutowej serca i wymiarów serca.
  2. Znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przed zabiegiem poprzez brak odruchów.
  3. Otwórz klatkę piersiową i wytnij serce, umieszczając je w sterylnym roztworze PBS, obficie przepłukując pozostałą krew.
  4. W razie potrzeby należy pobrać krew bezpośrednio z serca, unikając uszkodzenia obszarów podnóża lub po usunięciu serca z jamy klatki piersiowej.
  5. Po umyciu zatrzymaj serce w diastoli w nasyconym roztworze KCl (sterylnie przefiltrowany 3M KCl w PBS). W celu analizy histologicznej zamocuj serce w 10% formalinie i przejdź do kroku 5.7.
  6. W razie potrzeby zmierz żywotność komórek serca za pomocą barwienia chlorkiem Evansa-Niebieskiego / Trifenylotetrazolium (TTC). Po odbudowaniu ligatury w początkowym miejscu, należy wykonać perfuzję serca za pomocą 200 μl 1% roztworu Evans Blue za pomocą kaniuli aortalnej i zamrozić serce w małej plastikowej torbie w temperaturze -20 °C, bez mycia.
    1. Po 2 godzinach wykonać 5 szkiełek podstawowych w kierunku poprzecznym za pomocą ostrego skalpela i inkubować je przez 10-15 minut w roztworze TTC w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem producenta. Utrwal szkiełka na 10 minut w 10% formalinie i umieść je między mikroskopijnymi szkiełkami w celu dalszej analizy.
    2. Osadź tkankę serca w parafinie, umieszczając serce na końcówce, aby wykonać przekroj poprzeczny. Wykonać przekrój szeregowy 5 μm. Zbierz pierwsze 20 sekcji i wyrzuć następne 300 μm. Kontynuuj protokół sekcji, aż do osiągnięcia poziomu zastawki mitralnej (ryc. 3A, B). Pobierane są odcinki seryjne w odstępach 400 μm wzdłuż całego serca, które można barwić w celu przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej.
  7. Zmierz rozmiar zawału za pomocą jednoetapowego barwieniaGomoriego 6-8.
  8. Analizuj angiogenezę, zawartość kolagenu lub rekrutację komórek zapalnych w sekcji szeregowej przy użyciu zwykłego barwienia immunohistologicznego.

Wyniki

Procedura wywołania zawału mięśnia sercowego trwa od 25 do 30 min, a śmiertelność wynosi 10%. Po zabiegu myszy budzą się z narkozy w ciągu kolejnych 15 min. U operowanych myszy nie zaobserwowano upośledzenia sprawności fizycznej. Istnieje jednak wyższe ryzyko pęknięcia serca tydzień po przewlekłym zawale mięśnia sercowego, jeśli procesy naprawcze zostaną zaburzone w fazie zapalnej. Ponieważ serce potrafi znacząco zmieniać swoje wymiary podczas pompowania, istotne jest, aby wszystkie pobrane serca zostały zatrzymane w tej samej pozycji, na przykład w rozkurczu. Można to osiągnąć poprzez perfuzję serca nasyconym roztworem KCl. Zwiększone stężenie K+ w przestrzeni pozakomórkowej blokuje pompy jonowe i obniża potencjał spoczynkowy błony komórek serca, co prowadzi do zatrzymania aktywności serca w rozkurczu.

Obszar zawału można zaobserwować w analizie ultrasonograficznej (Rysunek 3A, dolny panel). W porównaniu do prawidłowego mięśnia sercowego, obszary niedokrwienne wydają się cienkie i hipokinetyczne (Rysunek 3A, górny panel). W zależności od zastosowanego modelu wielkość zawału będzie się różnić. Przewlekły model zawału indukuje kolisty, transmuralny zawał wierzchołka (Rysunek 3B), podczas gdy model niedokrwienia/reperfuzji indukuje cienki zawał w obrębie środkowej ściany w całym sercu (Rysunek 3C). Istnieje wiele metod określania wielkości zawału. Jeśli celem jest analiza bezpośredniego wpływu na żywotność serca, wskazane jest przeprowadzenie barwienia Evans-Blue/TTC18 co najmniej 2 godziny po reperfuzji, aby móc zaobserwować wszelkie zmiany w mięśniu sercowym. Przekroje można analizować natychmiast (Rysunek 3B, środkowy panel) po barwieniu lub przechowywać między szkiełkami w formalinie przez 2-3 dni (Rysunek 3C, środkowy panel). Niebieski obszar reprezentuje zdrowe mięśnie sercowe, nieobjęte niedokrwieniem. Czerwony obszar reprezentuje żywotny mięsień sercowy w obrębie obszaru niedokrwiennego (mięsień zagrożony), a biały obszar reprezentuje martwą tkankę. Zazwyczaj wielkość zawału wyraża się jako procent obszaru zagrożonego.

Dojrzałą bliznę powstałą w wyniku procesów przebudowy można łatwo zmierzyć za pomocą immunohistochemii, stosując jednokrokową metodę barwienia Gomori. Niebiesko zabarwione obszary zawałowe oraz czerwono zabarwione zdrowe obszary komory (Rysunek 3B oraz C, panele prawe) są wyznaczane w pierwszym przekroju z każdego poziomu, aż do zastawki mitralnej. Aby uniknąć zmienności wynikającej z wiązania LAD na różnych poziomach, bierze się pod uwagę zawał ze wszystkich przekrojów i wyraża go jako procent całkowitej objętości lewej komory. W modelu zawału przewlekłego można uzyskać objętość zawału rzędu 15-20%, a w modelu niedokrwienia/reperfuzji 10-15%. Ponadto model zawału przewlekłego indukuje nasilone rozszerzenie, którego nie obserwuje się w modelu niedokrwienia/reperfuzji (Rysunek 3B oraz C, panel prawy).

Można zastosować konwencjonalne procedury barwienia, takie jak: barwienie CD31 w celu uwidocznienia angiogenezy (czerwony, Rysunek 4A) lub barwienie na aktynę mięśni gładkich w celu zidentyfikowania myofibroblastów (zielony, Rysunek 4B). Można również zastosować podwójne barwienie fluorescencyjne w celu identyfikacji różnych cząsteczek docelowych w obszarze zawału, ponieważ brak kardiomiocytów sprawia, że nie występuje autofluorescencja immunologiczna (Rysunek 4C).

Ilustracje operacji serca myszy; schematy przedstawiające nacięcie i zawał w badaniach nad LAD.
Rycina 1: Nacięcie w linii pośrodkowej i wprowadzenie kaniuli intubacyjnej (A). Wizualizacja stereomikroskopowa metalowej kaniuli przez prześwit tkanki (B). Wskazano pierścienie tchawicy (niebieskie strzałki) oraz kaniulę (czarna strzałka). Nacięcie międzyżebrowe dla modelu przewlekłego zawału i podwiązanie LAD (C). Podwiązanie znajduje się w środkowej części serca (pomiędzy uszkiem a wierzchołkiem, kolor czarny na dolnym panelu), przyjmując za punkt odniesienia koniec żyły (schemat na niebiesko, dolny panel). Obie gałęzie tętnicy powinny zostać podwiązane (kolor czerwony na dolnym panelu). Kolor szary oznacza obszar zawału, który pojawia się w dolnej połowie serca (prawy dolny panel). Podwiązanie dla modelu niedokrwienia/reperfuzji wykonuje się pod uszkiem, wiążąc główny pień LAD (kolor czerwony na dolnym panelu) nad rurką silikonową (prawa strona) (D). Kolor szary oznacza obszar zawału, który obejmuje całe serce (prawy dolny panel). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy szwów chirurgicznych A, B oraz obrazy C szwów żeber, mięśni i skóry do celów badań medycznych.
Rysunek 2: Szew żeber zamyka nacięcie klatki piersiowej, jeśli szwy przyśrodkowe są ustawione pod kątem 90° zarówno w modelu przewlekłym (A), jak i w modelu niedokrwienia/reperfuzji (B, panel lewy). Obrazowanie in vivo szwu żeber (C, panel lewy), szwu mięśniowego (C, panel środkowy) oraz szwu skóry (C, panel prawy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ultradźwięki serca prawidłowego i zzawałowanego; schemat zawału przewlekłego, niedokrwienia/reperfuzji, wyniki barwienia TTC i Gomoriego.
Rycina 3: Obrazy echokardiograficzne. Obrazy obszarów prawidłowych (A, górny panel) oraz zzawałowanych (A, dolny panel) wykonane w osi długiej (podłużnie, lewe panele) lub w osi krótkiej (poprzecznie, prawe panele). Zawał wywołany przewlekłym podwiązaniem (B) oraz jedną godziną niedokrwienia z następującą po niej reperfuzją (C). Barwienie błękitem Evansa/TTC pozwala na identyfikację obszarów ukrwionych (niebieskich) i nieukrwionych, a także żywotnego (czerwonego) i martwego (białego) mięśnia sercowego (B, C, środkowe panele). Jednoetapowe barwienie metodą Gomoriego umożliwia identyfikację obszarów zzawałowanych (niebieskich) i odróżnienie ich od regionów prawidłowych (czerwonych) (B, C, prawe panele). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej pokazujące CD31 i aktynę mięśni gładkich z nakładką DAPI.
Rycina 4: W obszarze zawału można przeprowadzić różne barwienia, takie jak barwienie na CD31 w celu opisania neoangiogenezy (A, czerwony, pojedyncze strzałki), lub na aktynę mięśni gładkich dla miofibroblastów (B, zielony, pojedyncze strzałki), a także barwienie podwójne (C, CD31-czerwony/aktyna mięśni gładkich-zielony), z przeciwbarwieniem jąder DAPI (niebieski). Miofibroblasty można łatwo odróżnić od komórek mięśni gładkich małych lub dużych tętnic, którym zawsze towarzyszy warstwa śródbłonka (C, strzałki). Podwójne strzałki wskazują autofluorescencję erytrocytów. Pasek skali 50 µm.

Dyskusja

Podczas zabiegu należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów: intubację, otwarcie klatki piersiowej i podwiązanie LAD. Pierwszym krytycznym krokiem jest intubacja zwierzęcia przed doświadczeniami. Wiele grup używa pionowego wspornika do mocowania myszy i źródła światła do wprowadzania kaniuli bezpośrednio do tchawicy. Metoda ta jest niepewna co do prawidłowego wprowadzenia kaniuli do tchawicy i jest najbardziej podatna na niepowodzenia przez nowicjuszy. Wykonując małe nacięcie, położenie kaniuli może być kontrolowane podczas całego manewru, zmniejszając w ten sposób domyślną stawkę. Co więcej, tracheotomia zostaje przekroczona, co zmniejsza powikłania i skraca czas operacji.

Kolejnym krytycznym krokiem jest otwarcie jamy klatki piersiowej. Środkowa sternotomia stanowi manewr wysokiego ryzyka, opóźniający powrót zwierząt do zdrowia. Boczne lewe nacięcie oznaczające przecięcie 2-3 żeber15 prowadzi do niedostatecznej rekonwalescencji i zwiększonej śmiertelności. Zastosowaliśmy w modelu małe, dyskretne nacięcie między żebrami zapewniające minimalne obciążenie. Zwierzęta bardzo szybko wracają do zdrowia po operacji i nie wykazują wad ani zaburzonego gojenia. Za punkt odniesienia przyjmuje się dolną przestrzeń międzyżebrową. Biorąc to pod uwagę, prawidłowy i zróżnicowany dostęp do miejsca podwiązania dla modelu przewlekłego i niedokrwienno-reperfuzyjnego, nie rodzi poważnych problemów.

Sama ligatura stanowi najbardziej krytyczny krok. Lewa zstępująca tętnica wieńcowa jest trudna do uwidocznienia i często musi być związana bez widoku. Dlatego wskazane są pewne anatomiczne punkty odniesienia, aby pomóc chirurgowi w wykonaniu prawidłowego podwiązania. W przypadku modelu przewlekłego zawału ligaturę umieszcza się pośrodku brzusznej strony serca, między małżowiną uszną a wierzchołkiem, powyżej zakończenia głównej żyły przedniej (ryc. 2B). Wydajność można kontrolować, wizualizując wygląd szarego koloru w dotkniętych obszarach. Jeśli obszar zawału wydaje się być przedni i nie obejmuje tylnej ściany, nowy szew można założyć po lewej stronie pierwszego szwu. Główny korzeń LAD jest zawsze widoczny pod małżowiną uszną18, dlatego nie stwarza poważnych problemów z wykryciem tej części. Jednak małżowina uszna stwarza duże ryzyko krwawienia i należy się z nią obchodzić ostrożnie.

Procedura jest ograniczona przez istnienie odpowiedniego sprzętu. Respirator i odpowiedni system znieczulenia dla małych zwierząt są drogie i wymagają podłączenia do systemu gazowego i wentylacyjnego pomieszczenia. Ponadto konieczny jest ścisły nadzór nad zwierzętami w pierwszym tygodniu po zabiegu, aby wykryć możliwe objawy kliniczne. Aby zbadać czynność serca podczas eksperymentu, wymagane są badania ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości, złożony system perfuzji Langendorfa lub pomiary małego cewnika dokomorowego, co wiąże się z wysokimi kosztami i dodatkową wiedzą specjalistyczną.

Biorąc pod uwagę zawał mięśnia sercowego, nie ma dostępnych alternatywnych metod odtwarzania złożoności zdarzeń in vitro. W zależności od interesującego nas miejsca, perfuzja ex vivo izolowanego serca w systemie Langendorffa dostarcza informacji o kurczliwości, funkcji serca i żywotności mięśnia sercowego w odpowiedzi na różne bodźce lub leki. Wyklucza jednak wszelkie ingerencje składników krwi i układu odpornościowego i nie jest wskazany do długich badań nad przebudową i gojeniem po zawale mięśnia sercowego.

Po wykonaniu zabiegu zawału mięśnia sercowego można przeprowadzić wszystkie inne analizy funkcjonalne, takie jak pomiary ciśnienia dokomorowego, ultrasonografia (systemy ultrasonograficzne dla małych zwierząt) lub izolowana perfuzja Langendorffa serca. Co więcej, wszystkie analizy biologiczne i molekularne mogą być wykonywane w celu identyfikacji komórek, białek, mRNA, mikroRNA, genów lub innych biomarkerów, które mogą być wykorzystane jako cele terapeutyczne do opracowania nowych strategii leczenia zawału mięśnia sercowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych IZKF Aachen (młodsza grupa badawcza E.A.L.) na wydziale Medycyny Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie. Jesteśmy wdzięczni dr Rusu i Ashley Christinie Vourakis za krytyczną recenzję manuskryptu oraz Pani Royi Soltan za profesjonalną pomoc w barwieniu immunohistochemicznym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ/X9
Wentylator myszyAparat Harvard730043Minient 845
(wersja stołowa)AparatSamodzielna jednostka anestezjologiczna na bazie izofluranu do użytku na stołach laboratoryjnych, o kompaktowej powierzchni 8 "x 11".
Kaniula intubacyjnaAparat Harvard 732737
KleszczeFST, Niemcy9119700standardowa końcówka zakrzywiona 0,17 mm x 0,1 mm
NożyczkiFST, Niemcy9146011proste
nożyczki VannasAesculap, NiemcyOC 498 R
RetraktoryFST, Niemcy1820010Zwijacze o szerokości 2,5 mm
FST, Niemcy1820011szerokość 5 mm
Uchwyty drucianeFST, Niemcy1820005  10 cm
Uchwyty drucianeFST, Niemcy1820006  14 cm
Ketamina 10%CEVA, Niemcy
Ksylazyna 2%Medistar, Niemcy
Bepanthene krem pod oczy i nosBayer, Niemcy
Rurka silikonowaIFK Isofluor, Niemcyna zamówienie średnica produktu 500 &mikro; m
grubość przekroju 100 &mikro; m
Cewnik
Szew PROLENE 6/0 ETHICON8707Hpolipropylenowy szew monofilamentowy, niewchłanialny, igła CC1, 13 mm, 3/8 Circle
7/0 SilkSeraflexIC 1005171Z
Ultradźwięki Vevo, Kanada770 Vevo
Model Podwójny system anestezjologiczny Harvard politetrafluoroetylenowy

Bibliografia

  1. Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines. J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).
  2. Liehn, E. A., Radu, E., Schuh, A. Chemokine contribution in stem cell engraftment into the infarcted myocardium. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (4), 278-283 (2013).
  3. Alexander, S., et al. Repetitive transplantation of different cell types sequentially improves heart function after infarction. J Cell Mol Med. 16 (7), 1640-1647 (2012).
  4. Liehn, E. A., et al. Compartmentalized protective and detrimental effects of endogenous macrophage migration-inhibitory factor mediated by CXCR2 in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (9), 2180-2186 (2013).
  5. Liehn, E. A., et al. Ccr1 deficiency reduces inflammatory remodelling and preserves left ventricular function after myocardial infarction. J Cell Mol Med. 12 (2), 496-506 (2008).
  6. Liehn, E. A., et al. A new monocyte chemotactic protein-1/chemokine CC motif ligand-2 competitor limiting neointima formation and myocardial ischemia/reperfusion injury in mice. J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1847-1857 (2010).
  7. Liehn, E. A., et al. Double-edged role of the CXCL12/CXCR4 axis in experimental myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2415-2423 (2011).
  8. Oral, H., et al. CXC chemokine KC fails to induce neutrophil infiltration and neoangiogenesis in a mouse model of myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 60, 1-7 (2013).
  9. Projahn, D., et al. Controlled intramyocardial release of engineered chemokines by biodegradable hydrogels as a treatment approach of myocardial infarction. J Cell Mol Med. 18 (5), 790-800 (2014).
  10. Schuh, A., et al. Novel insights into the mechanism of cell-based therapy after chronic myocardial infarction. Discoveries. 1 (2), e9(2014).
  11. Schuh, A., et al. Effect of SDF-1 alpha on Endogenous Mobilized and Transplanted Stem Cells in Regeneration after Myocardial Infarction. Curr Pharm Des. 20 (12), 1964-1970 (2013).
  12. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).
  13. Kanzler, I., Liehn, E. A., Koenen, R. R., Weber, C. Anti-inflammatory therapeutic approaches to reduce acute atherosclerotic complications. Curr Pharm Biotechnol. 13 (1), 37-45 (2012).
  14. Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis. Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).
  15. Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. J. Vis. Exp. (32), 1438(2009).
  16. Ryu, J. H., et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrin matrix enhances neovascularization in infarcted myocardium. Biomaterials. 26 (3), 319-326 (2005).
  17. Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix. J. Vis. Exp. (91), e51390(2014).
  18. Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model mysima oinwazyjna chirurgiapodwi zanie t tnicy wie cowejkaniula intubacyjnanaci cie klatki piersiowejniedokrwienie i reperfuzjaanaliza wielko ci zawa ubarwienie TTCperfuzja b kitem Evansa
Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.