Technika cytometrii przepływowej opartej na obrazie do oceny zmian w funkcji granulocytów in vitro

Summary

Ta metoda demonstruje technikę oceny funkcji granulocytów poprzez jednoczesny pomiar fagocytozy bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Cytometria przepływowa oparta na obrazie pozwoliła na zidentyfikowanie trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, z których każdy różnił się względną zdolnością funkcjonalną.

Abstract

Granulocyty odgrywają kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcje bakteryjne i wirusowe. Chociaż istnieją metody pomiaru funkcji granulocytów, na ogół są one ograniczone pod względem informacji, które mogą dostarczyć. Na przykład większość istniejących testów podaje jedynie procent liczby granulocytów, które są aktywowane po pojedynczej inkubacji o ustalonej długości. Sprawę komplikuje fakt, że większość testów koncentruje się tylko na jednym aspekcie funkcji ze względu na ograniczenia w technologii wykrywania. W artykule przedstawiono technikę jednoczesnego pomiaru fagocytozy granulocytów bakterii i wybuchu oksydacyjnego. Mierząc obie te funkcje w tym samym czasie, zidentyfikowano trzy unikalne fenotypy aktywowanych granulocytów: 1) Niska aktywacja (minimalna fagocytoza, brak wybuchu oksydacyjnego), 2) Umiarkowana aktywacja (umiarkowana fagocytoza, pewien wybuch oksydacyjny, ale brak kolokalizacji dwóch zdarzeń funkcjonalnych) oraz 3) Wysoka aktywacja (wysoka fagocytoza, wysoki wybuch oksydacyjny, kolokalizacja fagocytozy i wybuch oksydacyjny). Zidentyfikowano również czwartą populację, która składała się z inaktywowanych granulocytów. Stosując inkubacje testowe trwające 10, 20 i 40 minut, oceniono wpływ czasu trwania inkubacji testu na redystrybucję aktywowanych fenotypów granulocytów. Czwartą inkubację zakończono na lodzie jako kontrolę. Wykorzystując inkubacje w czasie seryjnym, test może być w stanie wykryć, w jaki sposób leczenie wpływa przestrzennie na funkcję granulocytów. Wszystkie próbki mierzono za pomocą cytometru przepływowego opartego na obrazie, wyposażonego w opcję obrazowania ilościowego (QI), autosampler i wiele laserów (488, 642 i 785 nm).

Introduction

Granulocyty reprezentują jeden ze składników wrodzonego układu odpornościowego organizmu, który stanowi pierwszą linię obrony przed atakującymi antygenami. Poprzednie metody oceny funkcji granulocytów koncentrowały się na zdolności fagocytozy lub wybuchu oksydacyjnym przy użyciu oddzielnych metod, co utrudnia zbiorcze ustalenie, jak zmieniły się granulocyty ^1-4. Postępy w dziedzinie cytometrii przepływowej zaowocowały wyprodukowaniem przyrządów stacjonarnych zdolnych do wysokorozdzielczego, wielokolorowego obrazowania komórek w sposób wysokoprzepustowy ⁵. Możliwość połączenia obrazowania z tradycyjną cytometrią przepływową stanowi postęp, który zapewnia platformę technologiczną potrzebną do wprowadzania innowacji w istniejących metodach cytometrii przepływowej i wydobywania nowych informacji o układzie odpornościowym.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat, nasze laboratorium, między innymi, skupiało się na wpływie różnych wzorców odżywiania i ćwiczeń na wrodzoną funkcję immunologiczną ^6-9. Metoda przedstawiona w tym manuskrypcie ma praktyczne implikacje w dziedzinie immunologii klinicznej. Obecna metoda wykorzystuje moc cytometrii przepływowej opartej na obrazie do jednoczesnego pomiaru fagocytozy cząstek bakteryjnych i wybuchu oksydacyjnego. Dzięki takiemu podejściu można oddzielić aktywowane granulocyty za pomocą zmiennych dostarczonych przez część analizy opartą na obrazie. Podzbiory te można było zidentyfikować dopiero po ocenie obrazów komórkowych na poszczególnych granulocytach. Dalszy czas inkubacji testu wpłynął na przejście między trzema podzbiorami aktywacji ¹⁰. W związku z tym prawdopodobne jest, że zastosowanie wielokrotnych czasów inkubacji może pozwolić na metodę badania zmiany funkcji granulocytów po określonym leczeniu eksperymentalnym. Celem tego artykułu było zademonstrowanie metody oceny funkcji granulocytów za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie do jednoczesnego pomiaru fagocytozy z wybuchem oksydacyjnym

.

Protocol

UWAGA: Wszystkie procedury pobierania krwi opisane tą metodą zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną UNT (IRB) dla ludzi. Wszyscy badani wyrazili pisemną zgodę na pobranie krwi, która została wykorzystana w niniejszej metodzie, aby upewnić się, że są pozornie zdrowi, mają normalną masę ciała i są wolni od chorób.

1. Źródło i przygotowanie odczynnika

1. Użyj CD66b-APC (klon#G10F5; DF=1:50) i CD45-APCeFluor780 (klon#2D1; DF=1:50) dla tego testu.
   UWAGA: Przed badaniem przeciwciała CD45 i CD66b były natłuszczane w celu określenia optymalnego rozcieńczenia, które wyraźnie rozdzieliło granulocyty (CD45 + / 66b +) z innych leukocytów (CD45 + / 66b-) ¹¹. Po dodaniu rozcieńczonego przeciwciała do barwienia, końcowe rozcieńczenie w probówce wynosiło 875.
2. Kup i rozmroź zapasowe biocząstki S. aureus oznaczone czerwonym barwnikiem pHrodo. Zawiesić w stężeniu 1 mg biocząstek na ml w sterylnym PBS. Podwielokrotność rozcieńczyć biocząstkami i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania w badaniu.
3. Rozpuścić dihydroetydyd (DHE), który jest przekształcany w fluorescencyjny bromek etydyny w obecności wolnych rodników tlenowych (tj. wybuchu oksydacyjnego), w DMSO do końcowego stężenia 10 g/ml.
4. Zmieszać N-etylomaleimid (stosowany w celu zapobiegania dodatkowej fagocytozie po określonym czasie inkubacji testu) ze sterylnym PBS w 2-etapowym rozcieńczeniu odpowiednio 200 mg/ml i 17,5 mg/ml. W teście należy użyć końcowego stężenia 15 mM. Podczas rozmrażania N-etylomaleimidu należy użyć bloku grzewczego o temperaturze 37 °C, ponieważ N-etylomaleimid nie pozostaje w roztworze.
5. Po ostatnim etapie utrwalania użyj 7AAD do barwienia jądrowego DNA. Przed dodaniem rozcieńczyć bulion 7AAD w stosunku 1:10 jałowym PBS.

2. Pobieranie próbek krwi

1. Poproś badanych, aby przybyli do laboratorium po poście O/N (>8 godzin) i powstrzymaniu się od aktywności fizycznej (>12 godzin).
2. Po oczyszczeniu skóry wacikiem nasączonym alkoholem należy wprowadzić sterylną igłę do pobierania krwi do żyły obwodowej ramienia.
3. Zbierz krew do opróżnionych probówek, które są komercyjnie wypełnione heparyną sodową.
4. Po pobraniu nałóż bandaż samoprzylepny na ramię badanego.
5. Odwróć probówki z krwią, aby wymieszać 10 razy, a następnie umieść na kołysku do czasu analizy.

3. Technika oznaczania fagocytozy

1. Rozmrozić biocząstki S.aureus (RT), DHE (RT) i N-etylomaleimid (37 °C).
2. Dodaj 20 l biocząsteczek S.aureus do 4 pojedynczych probówek o pojemności 1,2 ml podczas pracy w sterylnym kapturze.
3. Dodać 40 l DHE do każdej probówki zawierającej biocząstki.
4. Delikatnie postukaj w probówki o powierzchnię stołu, aby zebrać odczynniki z dna probówki.
5. Dodaj 100 l zmieszanej krwi pełnej do każdej probówki, która została wypełniona biocząstkami i DHE.
6. Przetrzyj wewnętrzną krawędź tubek aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby usunąć zanieczyszczającą krew.
7. Wymieszaj krew i odczynniki za pomocą elektronicznego pipety do mieszania krwi i odczynników przez trzy cykle po dodaniu krwi.
8. Umieść probówki testowe w pojemniku na lód i przykryj, aby chronić przed światłem.
9. Inkubuj probówki testowe przez 10, 20 i 40 minut. Zacznij od 40-minutowej probówki, aby upewnić się, że wszystkie probówki testowe zakończą się w tym samym czasie.
10. Rozmrozić N-etylomaleimid w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 °C.
11. Odpipetować 15 l N-etylomaleimidu (opisanego powyżej w ppkt 1.4) do każdej probówki testowej, inkubować przez 30 minut.
12. Odmierzyć pipetą 10 l CD66b-APC i 10 l rozcieńczonych przeciwciał CD45-APCeFluor780 (opisanych powyżej w ppkt 1.1), inkubować przez 60 minut.
13. Odpipetować 750 l roztworu lizy WBC fix / RBC do każdej probówki testowej, inkubować przez 60 minut.
14. Odwirować (10 minut przy 400 x g) probówkach w celu zebrania osadu komórkowego.
15. Odessać próżniowo roztwór utrwalający lizę WBC / RBC, pozostawiając pozostałą objętość płynu (100 l) nad osadem komórkowym.
16. Odpipetować 10 l rozcieńczonego roztworu 7AAD (opisanego powyżej w ppkt 1.5) i 50 l PBS do każdej probówki testowej.
17. Dodaj jedną kroplę kulek kalibracyjnych (~25 l) do każdej probówki testowej, umieść nakrętki na probówkach, zawiń probówki w folię i umieść w lodówce.
18. Załaduj probówkę z próbką do cytometru przepływowego opartego na obrazie i zbierz co najmniej 3 000 zdarzeń granulocytów przy użyciu wstępnie zdefiniowanych parametrów: Autosampler, niebieskie (488 nm; 60 mW), czerwone (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) (rysunek 1).

Rysunek 1. Metoda i szablon pozyskiwania. Próbki pobrano za pomocą obrazowego cytometru przepływowego (A). Podczas akwizycji wygenerowano wykresy punktowe współczynnika proporcji jasnego pola w porównaniu z CD66b-APC, aby oddzielić granulocyty od kolczastych kulek kalibracyjnych za pomocą oprogramowania INSPIRE v. 100.2.292.0 (B). Dla każdej próbki pobrano co najmniej 5 000 granulocytów za pomocą automatycznego podajnika próbek, laserów niebieskich (488 nm; 60 mW), czerwonych (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW). Należy pamiętać, że podczas akwizycji występuje wiele histogramów w celu monitorowania ustawień lasera i innych aspektów gromadzenia danych. Wszystkie te histogramy są opcjonalne i potrzebne tylko wtedy, gdy standardowe procedury operacyjne laboratorium wymagają ich w ramach kontroli jakości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Pobieranie i analiza próbek

1. Skorzystaj z automatycznego kreatora kompensacji programowej w oprogramowaniu IDEAS, aby zastosować macierz kompensacji do plików obrazów RAW (RIF) i utworzyć pliki z kompensacją obrazu (CIF).
2. Załaduj poszczególne pliki CIF do oprogramowania IDEAS i wygeneruj następujące wykresy, aby zidentyfikować podzbiory granulocytów:
3. Ustal początkowe bramki, aby zidentyfikować komórki, które zostały uznane za ostre, za pomocą histogramu dla gradientu RMS jasnego pola (Rysunek 2A). Wykonaj to oznaczenie dla każdej próbki pacjenta, używając niestymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia.
4. Użyj wykresów drugorzędnych, aby oddzielić komórki singletowe od szczątków i dubletów, używając wykresu punktowego o proporcjach jasnego pola (stosunek wysokości komórki do szerokości) w stosunku do obszaru jasnego pola (rysunek 2B). Wykonaj to oznaczenie dla każdej próbki pacjenta, używając niestymulowanej kontroli jako wzorca odniesienia.
5. Po zidentyfikowaniu czystej populacji komórek ustal wykres kropkowy CD45 w porównaniu z CD66b (Figura 2C), aby pozytywnie zidentyfikować granulocyty (CD45 + / 66b +). Utwórz wykres potomny (ryc. 3) o intensywności jasnych szczegółów dla S. aureus (oś x) w porównaniu z intensywnością jasnych szczegółów dla wybuchu oksydacyjnego (DHE, oś y), aby zidentyfikować podzbiory aktywowanych granulocytów. Zbieraj obrazy jasnego pola w kanale 1 i 9, biocząstki w kanale 2, DHE w kanale 4, 7AAD w kanale 5, CD66b w kanale 11 i CD45 w kanale 12.

Rysunek 2. Szablon analizy. To przedstawia serię wykresów, które zostały wygenerowane w celu identyfikacji komórek, które były w centrum uwagi (A), pojedynczych komórek (B), granulocytów (C). Dodatkowe wykresy wykorzystano do identyfikacji trzech podzbiorów aktywowanych granulocytów i nieaktywnych granulocytów. Cała analiza pozyskanych plików graficznych została zakończona przy użyciu oprogramowania IDEAS v.6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Użycie cytometrii przepływowej opartej na obrazie pozwoliło nam rozdzielić jednorodną populację aktywowanych granulocytów na trzy różne podzbiory aktywacji (Rysunek 3). W tej metodzie najskuteczniejszym sposobem rozwiązania trzech podzbiorów aktywacji jest wykreślenie intensywności jasnych szczegółów dla fagocytozy (S. aureus) w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym (DHE) (ryc. 3; Rysunek 4). Również zastosowanie kreatora kolokalizacji w oprogramowaniu IDEAS pozwoli na ilościowe określenie obecności jednoczesnej fagocytozy i wybuchu oksydacyjnego, co jest znakiem rozpoznawczym wysoce aktywowanych granulocytów.

Rysunek 3. Identyfikacja aktywowanych podzbiorów granulocytów. Po zidentyfikowaniu granulocytów za pomocą markerów powierzchniowych komórek (CD45+/66b+) wygenerowano wykres potomny z intensywnością jasnych szczegółów dla fagocytozy w porównaniu z intensywnością jasnych szczegółów dla wybuchu oksydacyjnego. Stosując to podejście, określono odsetek granulocytów nieaktywnych (fioletowy), niskoaktywnych (czerwony, A), umiarkowanie aktywnych (niebieski, B) i wysokoaktywnych (żółty, C). Ta technika bramkowania została również wykorzystana do oceny wpływu czasu inkubacji testu na względną obfitość różnych aktywowanych podzbiorów granulocytów. Najwyższy odsetek "wysokoaktywnych" granulocytów był obecny po 40-minutowej inkubacji. Cała analiza pozyskanych plików graficznych została zakończona przy użyciu oprogramowania IDEAS v.6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oprócz wykazania obecności trzech odrębnych podzbiorów aktywowanych granulocytów, wykazano, że czas inkubacji testu wpłynął na względną obfitość każdego aktywowanego podzbioru granulocytów. W szczególności 40-minutowa inkubacja spowodowała największy odsetek "wysoce aktywnych" granulocytów. Uwzględniając co najmniej trzy czasy trwania inkubacji testu, można określić, w jaki sposób dane leczenie kliniczne zmienia czasowy stan aktywacji granulocytów. Jest to pierwsza opublikowana metoda wykorzystująca cytometrię przepływową opartą na obrazie do identyfikacji różnych aktywowanych podzbiorów granulocytów w funkcji jednoczesnych pomiarów fagocytozy i wybuchu oksydacyjnego.

Rysunek 4. Reprezentatywne obrazy markerów komórkowych. Na tym rysunku przedstawiono galerię obrazów komórek sklasyfikowanych jako wysoce aktywne (A), umiarkowanie aktywne (B) i niskoaktywne (C). Biocząstki S.aureus są w Ch03, wybuch oksydacyjny jest w Ch04, 7AAD dla jądra jest w Ch05, rozproszenie boczne jest w Ch06, CD66b jest w Ch11, a CD45 jest w Ch12. Wyświetlany jest również kolokalizowany obraz łączenia fagocytozy (Ch03) w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym (Ch04). Żółte obszary na obrazie scalania oznaczają, że fagocytoza i wybuch oksydacyjny występują w tej samej przestrzeni anatomicznej w tym samym czasie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Niniejsza metoda stanowi udoskonalenie istniejących metod oceny funkcji granulocytów za pomocą cytometrii przepływowej ^1,3,4,12-14. Krytyczne etapy tego testu są zwykle związane z prawidłowym wymieszaniem próbki krwi z biocząstkami i DHE. Niepełne mieszanie spowoduje niedokładne wyniki. Chociaż całkowite wymieszanie ma kluczowe znaczenie, metoda mieszania powinna być z natury delikatna. Sugeruje się, aby mieszanie odbywało się za pomocą pipety elektronicznej z funkcją mieszania, a nie mieszalnika wirowego. Kolejnym krytycznym krokiem w teście jest zawsze upewnienie się, że górna połowa probówki testowej nie zanieczyszcza krwi. Tę pozostałą krew można usunąć za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Całkowite usunięcie jest ważne, ponieważ niezastosowanie się do tego może spowodować zanieczyszczenie końcowego preparatu testowego niezlizowanymi krwinkami czerwonymi.

Przed zastosowaniem tej metody należy dodać odpowiednie kontrole kompensacyjne w celu kontroli nakładania się widm między odczynnikami stosowanymi do identyfikacji różnych aspektów funkcji granulocytów. W przypadku tej metody kontrole kompensacyjne polegają na pobraniu próbek krwi, którym zasugerowano 40-minutową inkubację testu, a następnie znakowaniu pojedynczym markerem (tj. E. coli, DHE itp.). Po oznakowaniu zbierane są pojedyncze zdarzenia pozytywne, a za pomocą automatycznego kreatora w oprogramowaniu analitycznym IDEAS generowana jest matryca kompensacji. Bardzo ważne jest, aby w przypadku zastosowania tego testu przeprowadzono odpowiednie kontrole kompensacyjne w celu zapewnienia prawidłowej wydajności testu.

Analiza jest przeprowadzana za pomocą wyszukiwarki funkcji i kreatorów kolokalizacji, aby określić, że intensywność jasnych szczegółów jest najlepszą zmienną do oddzielenia populacji, a także określić, w jakim stopniu istnieje nakładanie się sygnałów wybuchu oksydacyjnego i fagocytozy. W szczególności zastosowanie cytometrii opartej na obrazie umożliwiło segregację aktywowanych granulocytów na trzy podzbiory. Ten podział podzbioru został określony na podstawie intensywności jasnych szczegółów fagocytozy w porównaniu z wybuchem oksydacyjnym. Oprócz zbadania tych pojedynczych funkcji komórek, zidentyfikowano komórki, które wykazywały oba zdarzenia w tym samym czasie w tym samym miejscu anatomicznym (kolokalizacja). Granulocyty, które należały do podzbioru "wysoce aktywnego", były jedynym fenotypem, który wykazywał stałą kolokalizację między fagocytozą a wybuchem oksydacyjnym. Ta identyfikacja aktywowanych podzbiorów granulocytów jest największym obszarem, w którym potrzebne jest rozwiązywanie problemów. Bardzo ważne jest, aby nowy użytkownik poświęcił czas na zrozumienie przebiegu procesu próbkowania w IDEAS i zrozumienie mechaniki bramkowania populacji komórek za pomocą komponentu obrazowania. Inne modyfikacje, które użytkownik może chcieć wprowadzić, obejmują wybór alternatywnych lub dodatkowych czasów inkubacji testu. Obecna metoda sugeruje stosowanie czasu trwania 10-40 minut; Jednak w zależności od modelu doświadczalnego, w którym metoda ta ma być stosowana, może być konieczne wybranie dłuższych czasów trwania testu. Taka modyfikacja musiałaby być oceniana indywidualnie.

Ponadto ustalono, że czas trwania inkubacji testu ma znaczący wpływ na pojawienie się trzech aktywowanych podzbiorów. Podejście opisane w tym raporcie stanowi rozszerzenie tego, co można było wcześniej uzyskać na temat funkcji granulocytów ^3,4,13,15. Inne laboratoria wykazały znaczenie oceny zmian w funkcji granulocytów w ramach kompleksowej oceny odporności i choroby ^15-17. Pomimo potencjału tego testu, nie jest on pozbawiony ograniczeń. Jednym z głównych ograniczeń jest koszt i czasochłonność związane z wysoką przepustowością przetwarzania próbek. Gdy projekt badania wymaga dużej liczby próbek w danym dniu, może to być trudne do przetworzenia. Przetwarzanie jest usprawnione dzięki zastosowaniu elektronicznych pipet i dozowników, ale są one zwykle drogie i niekoniecznie są dostępne w każdym laboratorium.

Nasz obszar badań koncentruje się na badaniu, w jaki sposób ćwiczenia i nawyki żywieniowe wpływają na zdrowie i funkcjonowanie układu odpornościowego ^6,8-10,18-20. Cele te mają istotne implikacje praktyczne dla różnych dziedzin zdrowia ludzkiego. Poza badaniami nad ćwiczeniami fizycznymi i efektami żywieniowymi, metoda fagocytozy przedstawiona w tym manuskrypcie może być przydatna w innych obszarach immunologii klinicznej, w których monitorowanie funkcji fagocytozy ma kluczowe znaczenie dla wyników leczenia. Obecny test jest pierwszym z wielu, które są testami immunologicznymi, które mogą zostać ponownie wynalezione poprzez wykorzystanie unikalnych informacji obrazowych, które można uzyskać z cytometru przepływowego opartego na obrazie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		używane do pobierania krwi
WBC Fixative / RBC Roztwór do lizy	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	klon G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	klon 2D1
S. biocząstki złociste złociste	Technologies	A10010
dihydroethidium	Sigma-Aldrich	D7008
N-etylomalemid	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Milipore
Analizator hematologiczny	Mindray	BC-3200
96-kanałowa pipeta	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Inkubator	LabArmour	BeadBath
Obrazowanie Cytometr przepływowy	EMD Millipore	Amnis FlowSight
Oprogramowanie INSPIRE	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Oprogramowanie	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plate Sealer	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Stacja robocza	Komputery Dell	Różne	używane do analizy IDEAS