Artykuł metodologiczny

FIM Imaging i FIMtrack: dwa nowe narzędzia umożliwiające wysokowydajną i ekonomiczną analizę lokomocji

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52207

⸱

24 grudnia 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuro and Behavioral Biology, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, 2Department of Mathematics and Computer Science, Westfälische Wilhelms-Universität Münster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

FIM to nowatorski, ekonomiczny system obrazowania przeznaczony do śledzenia małych poruszających się obiektów, takich jak C. elegans, planaria czy larwy Drosophila. Towarzyszący mu program FIMTrack został zaprojektowany tak, aby zapewnić szybką i wydajną analizę danych. Razem narzędzia te umożliwiają wysokoprzepustową analizę cech behawioralnych.

Streszczenie

Analiza funkcji sieci neuronalnej wymaga wiarygodnego pomiaru cech behawioralnych. Ponieważ zachowanie swobodnie poruszających się zwierząt jest do pewnego stopnia zmienne, wiele zwierząt musi zostać przeanalizowanych, aby uzyskać statystycznie istotne dane. To z kolei wymaga wspomaganej komputerowo automatycznej kwantyfikacji wzorców lokomocji. Aby uzyskać obrazy o wysokim kontraście prawie półprzezroczystych i małych poruszających się obiektów, opracowano nowatorską technikę obrazowania opartą na sfrustrowanym całkowitym odbiciu wewnętrznym, zwaną FIM. W tej konfiguracji zwierzęta są oświetlane światłem podczerwonym tylko w bardzo określonym miejscu kontaktu z leżącą pod spodem powierzchnią pełzania. Ta metodologia pozwala uzyskać obrazy o bardzo wysokim kontraście. Następnie te obrazy o wysokim kontraście są przetwarzane przy użyciu sprawdzonych algorytmów śledzenia konturów. Na tej podstawie opracowaliśmy oprogramowanie FIMTrack, które służy do wyodrębnienia szeregu cech potrzebnych do ilościowego opisania dużej różnorodności charakterystyk lokomocji. Podczas tworzenia tego pakietu oprogramowania skupiliśmy nasze wysiłki na architekturze open source, która pozwala na łatwe dodawanie kolejnych modułów. Program działa niezależnie od platformy i towarzyszy mu intuicyjny graficzny interfejs użytkownika prowadzący użytkownika przez analizę danych. Wszystkie wartości parametrów lokomocji podawane są w postaci plików csv umożliwiających dalszą analizę danych. Ponadto przeglądarka wyników zintegrowana z oprogramowaniem śledzącym zapewnia możliwość interaktywnego przeglądania i dostosowywania wyników, co może być potrzebne podczas integracji bodźców. Moc FIM i FIMTrack została zademonstrowana poprzez badanie lokomocji larw Drosophila.

Wprowadzenie

Większość zwierząt posiada zdolność poruszania się w sposób wysoce wyrafinowany i kontrolowany. Aby rozszyfrować podstawy genetyczne leżące u podstaw kontroli lokomocji, konieczne jest ilościowe ocenienie różnych wzorców behawioralnych. W tym względzie Drosophila może służyć jako idealny model. Śledzenie swobodnie latających osobników Drosophila jest niezwykle obiecujące. 1-4 jednak pełzanie larw Drosophila odbywa się w dwóch wymiarach przy stosunkowo niskiej prędkości, co pozwala na łatwe monitorowanie tego procesu. W celu pozyskania obrazów stosuje się układy oparte na kamerach w połączeniu z odpowiednim oświetleniem 5W eksperymentach behawioralnych wykorzystuje się zarówno światło padające, jak i przechodzące. 6,7Jednakże ze względu na półprzezroczyste ciało larw oraz możliwe odblaski światła od powierzchni, po której się poruszają, wierna rejestracja ruchów larwalnych może być trudna. Aby rozwiązać te problemy, opracowano kilka złożonych metod. Niedawno wprowadzono oświetlenie w ciemnym polu w celu zwiększenia kontrastu między obiektem a tłem. 8Jako alternatywa dla rejestracji opartej na kamerze wprowadzono techniki bezsoczewkowego obrazowania optycznego oraz akwizycji on-chip bez użycia matrycy obrazu. 9-11.

W ostatnim czasie wprowadzono kilka programów do śledzenia, w tym oprogramowanie dostępne komercyjnie 12 oraz rozwiązania niestandardowe. Przykładami programów do śledzenia o wysokiej przepustowości są Multi Worm Tracker (MWT) 13 oraz Multianimal Gait And Track (MAGAT) 8. Obie metody mają wspólną cechę w postaci możliwości śledzenia wielu zwierząt w jednej otwartej arenie, co sprawia, że kolizje zwierząt prowadzą do powstania wielu nowych tożsamości osobników. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wprowadzono układ wielodołkowy, rozdzielający 12 zwierząt do poszczególnych dołków 14. Precyzyjną kwantyfikację lokomocji pojedynczych osobników można osiągnąć, stosując ruchomy stół do śledzenia w połączeniu z mikroskopem 15. Jednak wszystkie te podejścia są albo nieefektywne kosztowo, brakuje im wystarczającej rozdzielczości, albo są zbyt czasochłonne dla fenotypowania o wysokiej przepustowości.

Aby przezwyciężyć wspomniane powyżej ograniczenia, opracowaliśmy metodę FIM (FTIR-based Imaging Method) opartą na zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia (FTIR) 16 (Rycina 1). To nowe podejście do obrazowania zapewnia bezprecedensowo wysoki kontrast i umożliwia nawet wielokolorową rejestrację pełzających zwierząt 16. Podstawowa zasada tej praktycznej i skutecznej metody jest prosta. Płyta z pleksiglasu jest naświetlana światłem (np. podczerwienią o długości fali 875 nm). Ze względu na różne współczynniki załamania światła pleksiglasu i powietrza, światło ulega całkowitemu odbiciu na granicy szkło/powietrze. Nie odnotowano nagrzewania się pleksiglasu 16. Dopiero gdy obiekty o wyższym współczynniku załamania dotkną naświetlonego stołu, światło może wniknąć do tych obiektów. Jeśli zwierzęta dotkną powierzchni, światło zostaje odbite i może zostać przechwycone od dołu (Rycina 1). W konsekwencji tylko obszar kontaktu zwierząt pojawia się jako jasny punkt, co pozwala na szczegółowe obrazowanie na całkowicie czarnym tle. Dzięki temu obrazowanie FIM umożliwia rejestrację idealnych materiałów wideo dla algorytmów komputerowego rozpoznawania obrazu. Proste i niezawodne zastosowanie metody FIM pozwala obecnie na szczegółową analizę o wysokiej przepustowości złożonych zachowań zwierząt i może być wykorzystywane do badania przetwarzania informacji: np. węchu 8, 16, wzroku 17 lub termosensoryki 18.

Układ eksperymentalny do refrakcji optycznej; schemat z symbolami kątów θ, n; wizualizacja przepływu ciepła.
Rysunek 1. Układ FIM z integracją bodźca cieplnego i podstawowymi zasadami fizycznymi. (A) Układ FIM. Intensywność oświetlenia można regulować na przednim panelu. (B) W celu podania bodźca cieplnego, pomalowana na czarno płyta aluminiowa, przez którą z obu stron przepływa gorąca i zimna woda, jest umieszczana 2 mm nad powierzchnią agaru, który sam ma grubość 2 mm. Gradient powstaje na płycie radiatora ciepła i agarze wskutek różnic temperatur. (C) Fizyczna zasada całkowitego wewnętrznego odbicia zaburzonego: Płyta z pleksiglasu jest oświetlona światłem podczerwonym. θ1, θ2 oraz θ3 oznaczają kąty odbicia światła. nA, n1, n2 i n3 oznaczają odpowiednio współczynniki załamania światła powietrza, pleksiglasu, agaru i larwy i spełniają nierówność nA 1 2 3. Ze względu na refrakcję kąt odbicia zmienia się podczas przejścia. Jeśli kąt jest mniejszy od kąta krytycznego, światło nie jest już odbijane, może przenikać przez warstwy i może zostać zarejestrowane od dołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Zakres procesów, które można analizować za pomocą FIM, jest szeroki. Bez żadnych dodatkowych modyfikacji obrazowanie FIM może być wykorzystane do monitorowania wszystkich stadiów larwalnych muchówki Drosophila (Rysunek 5B) lub do śledzenia śladów dorosłych osobników Drosophila 19. Podobnie można łatwo rejestrować trajektorie C. elegans lub ruchy płaskunlinków z rzędu planariów (Rysunek 5C). Wykonalna wydaje się nawet analiza wzrostu strzępek grzybni lub włośników korzeniowych 19. W naszej obecnej konfiguracji FIM 4 x 16 diod emitujących światło podczerwone (IR-LED) jest zintegrowanych z akrylową płytą o wymiarach 32 x 32 cm2, nazywaną stołem śledzącym (Rysunek 1). Natężenie IR-LED jest dostosowywane w zależności od masy obiektów znajdujących się na stole śledzącym, co można łatwo zrealizować za pomocą mikrokontrolera połączonego z obwodem poprzez modulację szerokości impulsu (PWM). FIM pozwala uzyskać obrazy o bardzo wysokim kontraście w szerokim zakresie natężeń oświetlenia. Co ważne, metoda ta generuje doskonałe wyniki już przy niskim całkowitym napromieniowaniu podczerwienią.

Kamera z filtrem podczerwieni jest umieszczona pod stołem do śledzenia, co umożliwia integrację dodatkowych bodźców w układzie. Bodźce termiczne mogą być łatwo aplikowane za pomocą płyty grzejnej, a bodźce świetlne za pomocą projektora LCD. Ponadto zapachy mogą być utrzymywane w gradientach za pomocą prostych pokrywek 8. W eksperymentach z gradientem temperatury, płyta grzejna jest przepływana odpowiednio gorącą i zimną wodą po obu stronach i umieszczana 2 mm nad larwami (Rysunek 1B).

Generowanie wysokokontrastowych filmów wysokiej jakości umożliwia zaawansowaną komputerową analizę obrazu, dlatego wdrożyliśmy oprogramowanie FIMTrack w celu wyodrębnienia z obrazów dużego zestawu cech (Rysunek 2). Na podstawie konturu zwierzęcia zdefiniowano sześć głównych cech pierwotnych (Rysunek 3A). Cechy te stanowią podstawę do dalszego obliczania sześciu cech wtórnych, które opisują kształt zwierzęcia oraz jego pozycję podczas określonych bodźców w danym punkcie czasowym (Rysunek 3B). Obecnie obliczanych jest dziewięć cech trzeciorzędnych, które integrują aspekty czasowe i w połączeniu z cechami pierwotnymi i wtórnymi charakteryzują lokomocję zwierzęcia (Rysunek 3C).

Proces śledzenia larw, interfejs oprogramowania, schemat blokowy analizy obrazu, diagram organizmu.
Rycina 2. Przegląd FIMTrack, schemat algorytmu i reprezentacja larwy. (A) Sposób użycia FIMTrack. Obrazy zostają wczytane. Należy ustawić próg wartości szarości oraz progi rozmiaru larwy definiujące pojedyncze osobniki. Obszar larwy musi mieścić się w przedziale [min-size, max-size]. Śledzenie jest uruchamiane za pomocą podświetlonego przycisku. (B) Schemat śledzenia. Po kliknięciu przycisku start obliczany jest obraz tła (minimalne intensywności w czasie). Dopóki pozostają klatki, larwy są segmentowane na podstawie progu szarości oraz progów min- i max-size. Dla wszystkich segmentacji obliczane są reprezentacje larw (por. (C)). Każdy nowy model jest przypisany do danej trajektorii, jeśli dostępny jest prawidłowy ślad. Po osiągnięciu ostatniej klatki wykonywane jest końcowe przetwarzanie wstępne, a następnie generowane są wyniki. (C) Reprezentacja larwy. Zwierzę składa się z punktu głowy i punktu ogona (h i t). Pomiędzy tymi punktami można ustawić dowolną nieparzystą liczbę punktów kręgosłupa si o promieniu ri. Dodatkowo obliczany jest środek masy m oraz główny kąt zgięcia ciała γ. Kilka parametrów związanych z ruchem zaznaczono fioletowymi liniami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat FIMTrack przedstawiający analizę cech dla środka masy, wygięcia ciała i parametrów ruchu.
Rysunek 3. Cechy obliczane przez FIMTrack. (A) Cechy podstawowe oparte na konturze zwierząt. (B) Cechy wtórne, oparte na cechach podstawowych. (C) Cechy trzeciorzędowe, oparte na cechach podstawowych w kolejnych klatkach oraz dodatkowych danych wejściowych Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

UWAGA: Tutaj przedstawiono użycie FIM do użytecznej wysokoprzepustowej analizy lokomocji larw do badań przesiewowych w warunkach swobodnego ruchu i pod wpływem bodźca cieplnego. Inne zastosowania, takie jak analiza lokomocji zależnej od bodźców węchowych lub obrazowanie w wysokiej rozdzielczości toczenia lub innych zachowań, mogą wymagać subtelnych zmian w protokole, które są dostarczane na żądanie.

1. Przygotowanie eksperymentów

  1. Użyj łącznie około 100 larw na genotyp (wymagany czas 1 godziny), aby uzyskać statystycznie znaczące wartości. UWAGA: W przypadku gdy konieczne jest porównanie i zarejestrowanie kilku genotypów w różnych dniach, należy zapisać taką samą liczbę larw na genotyp dziennie.
  2. W przypadku większości zastosowań nagrywaj z częstotliwością 10 Hz w celu analizy parametrów. W przypadku zastosowań związanych z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, w razie potrzeby zmień prędkość obrazowania.
  3. W celu śledzenia larw trzeciego stadium rozwojowego przeprowadzaj eksperymenty około 120 godzin po złożeniu jaj. Upewnij się, że kultury wydadzą wystarczającą ilość larw w okresie doświadczalnym (patrz 4.3).
  4. W przypadku zastosowań bez bodźca należy przygotować powierzchnię pełzającą zawierającą półprzezroczysty agar (patrz punkt 2). Aby zatrzymać larwy w zakresie bodźca do zastosowania gradientu ciepła, należy otoczyć pole widzenia awersyjną barierą z agaru solnego (patrz sekcja 3).
    UWAGA: Inne zastosowania mogą wymagać różnych powierzchni.
  5. Upewnij się, że korzystasz z pomieszczenia, w którym panują stałe warunki środowiskowe (temperatura, światło, przepływ powietrza, wilgotność powietrza itp.).

2. Przygotowanie powierzchni pełzającej (przezroczysty agar)

UWAGA: W konfiguracji FIM dodawana jest powierzchnia agaru, aby zapewnić wilgotną powierzchnię do pełzania. Dodatkowo poprawia również właściwości świetlne.

  1. Zagotuj 0,8% agaru spożywczego w dejonizowanej ultraczystej wodzie. Do aplikacji przesiewowej przygotować 400 ml.
  2. Wlać agar w temperaturze 50 °C (gorący ręcznie) na oddzielną płytkę akrylowo-szklaną o wymiarach 33 cm x 33 cm. Napięcie powierzchniowe agaru, a tym samym temperatura, określi grubość płyty agarowej. W temperaturze 50 °C uzyskuje się płaty agaru o grubości 2 mm. Nie mieszaj po ugotowaniu i ciągle wlewaj, aby uniknąć pęcherzyków. Przygotuj świeże płaty agaru na każdy okres obrazowania trwający około 4 godzin.
  3. Napełnij standardowe 6-centymetrowe szalki Petriego pozostałym 0,8% roztworem agaru, aby posortować, oczyścić i przyzwyczaić larwy przed eksperymentem (1 szalka na genotyp).
  4. W przypadku, gdy do aplikacji potrzebna jest awersyjna bariera agarowa, przejdź do sekcji 3.
  5. Odciąć około 2 cm obwodu płyty agarowej, aby uzyskać płaską kwadratową powierzchnię do nagrywania. Usuń nadmiar agaru.
    UWAGA: Rozmiar zależy od aplikacji.
  6. Przenieś płytę agarową do zestawu FIM bezpośrednio po schłodzeniu, delikatnie przesuwając agar ślizgający się po krawędzi płytki ze szkła akrylowego.

3. Opcjonalnie: Dodanie awersyjnej bariery agarowej do powierzchni pełzającej (agar solny)

  1. Zagotuj 2,5% agar spożywczy z 3 M NaCl w dejonizowanej ultraczystej wodzie. Do przesiewania w gradiencie ciepła przygotować 200 ml.
    UWAGA: Głośność zależy od aplikacji.
  2. Wytnij wcięcie o szerokości 2 cm w wcześniej wylanej powierzchni pełzającej otaczającej pole widzenia (22 x 22 cm).
    UWAGA: W zależności od zastosowania mogą być wymagane różne formy barier i pola widzenia.
  3. Wypełnij wycięcie agarem solnym 0,1-0,3 cm wyżej niż powierzchnia śledzenia.

4. Obsługa muchy

  1. Tylne muchy w inkubatorze o temperaturze 25 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności dostosowanym do czasu eksperymentu na standardowym pokarmie dla much przy wilgotności powietrza 65%.
  2. W przypadku krzyżówek znieczulić 30 dziewiczych samic much i 8 samców CO2 i skrzyżować je w 130 ml fiolkach hodowlanych z 35 ml żywności.
    UWAGA: Jedna fiolka hodowlana o pojemności 130 ml z 35 ml pokarmu da około 20-30 larw w późnym stadium rozwojowym w okresie obrazowania wynoszącym 4 godziny. Obrazowanie i śledzenie działa we wszystkich stadiach rozwojowych larw.
  3. Wlej trochę wody do fiolek z kulturami, aby napędzić ruch larw w późnym stadium rozwoju i zbierz największe larwy ze ścianek fiolki za pomocą małego pędzla.
  4. 2-5 minut przed nagraniem przenieś larwy na jeden film na szalkę Petriego zawierającą 0,8% agaru spożywczego w dejonizowanej ultra czystej wodzie, aby je przyzwyczaić i oczyścić.

5. Dostosowywanie ustawień obrazowania FIM dla nagrań (warunki bez bodźca)

  1. W razie potrzeby dostosuj ostrość i przysłonę obiektywu aparatu. Ustaw czas ekspozycji dla odpowiedniego aparatu.
    UWAGA: Te ustawienia nie muszą być zmieniane podczas eksperymentu.
  2. Dostosuj intensywność oświetlenia, aby uzyskać dobry kontrast, obrazując jedną larwę.
  3. Utrzymuj stałe warunki środowiskowe w pomieszczeniu podczas nagrań. Zaciemnij pomieszczenie, aby nie przeszkadzać larwom światłem kierunkowym.

6. Opcjonalnie: Dostosowywanie ustawień obrazowania FIM dla nagrań (warunki stopniowego bodźca temperaturowego)

UWAGA: Urządzenie do gradientu ciepła to aluminiowa płyta o wymiarach 42 x 42 x 0,2 cm3 z matową czarną farbą i materiałem izolacyjnym na górze. Płytka jest perfuzjonowana wodą z dwóch różnych obwodów podłączonych do podgrzewaczy/chłodnic i pomp na obu końcach (patrz rysunek 1B). Temperaturę można regulować w zakresie od -5 do +50 °C.

  1. Włącz urządzenie do gradientu ciepła na 1 godzinę przed eksperymentami i umieść je nad ustawieniem, aby umożliwić ustalenie żądanego profilu temperatury i zrównoważenie komponentów.
  2. Przenieś agar do powierzchni pełzania z barierą solną do zestawu.
  3. Umieść płytkę grzejnika na agarze i wyreguluj odstęp między płytką a powierzchnią pełzającą do 2 mm (~1 mm powyżej larw).
  4. Ustalić gradient liniowy o co najmniej 0,8°C/cm od 34 °C (ok. 2 cm od bariery w polu widzenia) do 18 °C (ok. 2 cm od bariery w przeciwległym miejscu w polu widzenia), dostosowując temperaturę obiegów wodnych do 1 °C i 45 °C.
    UWAGA: Różne właściwości gradientowe metalowej płyty wymagają różnych temperatur, które należy ustalić empirycznie. Tych ustawień nie trzeba zmieniać podczas eksperymentów.
  5. Dostosuj ustawienia zgodnie z opisem w rozdziale 5.
  6. Pozwól, aby powierzchnia pełzająca zrównoważyła się w nachyleniu przed eksperymentami przez 20 minut. Przetestuj gradient temperatury za pomocą pirometru.
  7. Przejdź do sekcji 8.

7. Obrazowanie FIM (warunki bez bodźca)

  1. Użyj małego mokrego pędzla, aby delikatnie zebrać 15 larw z szalek Petriego i przenieść je na środek powierzchni śledzenia. Nie przenoś resztek jedzenia ani zbyt dużej ilości wody (patrz 7.8).
  2. Nagraj od 1 do 50 larw na obszarze śledzenia o wymiarach 22 cm x 22 cm. W większości zastosowań przesiewowych należy użyć 15 zwierząt na film (ze względów statystycznych należy użyć co najmniej 100 osobników na genotyp).
  3. Delikatnie oddziel larwy i odczekaj około 10-20 sekund, aż wszystkie larwy zaczną poruszać się prosto przed nagraniem.
  4. Rejestruj lokomocję larw przez 2 minuty z prędkością 10 klatek na sekundę w warunkach niezwiązanych z bodźcem. Użyj nieskompresowanych obrazów tif jako formatu wyjściowego.
  5. Podczas nagrywania zbierz larwy do następnego filmu z fiolek, aby je przyzwyczaić. krytyczny: Nie przeszkadzaj zarejestrowanym larwom światła.
  6. Po nagraniu usuń larwy dużym pędzlem i wyrzuć je zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa i przepisami.
  7. Po usunięciu larw za pomocą pędzla oczyść i nawilż powierzchnię pełzania ultra czystą wodą dejonizowaną.
  8. Krytyczne: Utrzymuj powierzchnię wilgotną przez cały czas, ale unikaj nadmiernej wilgoci, która może być postrzegana jako aureole lub krople otaczające larwy na nagraniach i zakłócać śledzenie.

8. Opcjonalnie: Obrazowanie FIM (Stopniowe Warunki Bodźca Temperaturowego)

  1. Po ustaleniu gradientu temperatury (patrz rozdział 6) przygotuj oprogramowanie rejestrujące do natychmiastowego zapisu w ciągu 20 sekund po umieszczeniu larw na powierzchni pełzającej (patrz 8.2), np. ustaw liczbę klatek na film i określ ścieżkę zapisu.
  2. Lekko podnieść płytkę chłodnicy i umieścić larwy w temperaturze 33 °C w odległości 2 cm od bariery solnej. Patrz 6. oraz 7. w celu uzyskania dalszych instrukcji ogólnych. Ponownie opuść płytę chłodnicy i rozpocznij nagrywanie przez 3-4 minuty bezpośrednio po tym, jak larwy zaczną poruszać się prosto.
  3. Po nagraniu usuń larwy bezpośrednio, oczyść i nawilż powierzchnię. Nie dotykaj agatora solnego, aby uniknąć rozprzestrzeniania się NaCl.
  4. Krytyczne: Utrzymuj powierzchnię wilgotną przez cały czas, ale unikaj nadmiernej wilgoci, która może być postrzegana jako aureole lub krople otaczające larwy na nagraniach i zakłócać śledzenie.
  5. Pozwól, aby powierzchnia agaru ponownie się zrównoważyła po nawilżeniu przez 1-2 minuty, jednocześnie zapisując obrazy i zbierając nowe zwierzęta przed przygotowaniem do następnego filmu. Kontroluj gradient temperatury za pomocą pirometru co 5 filmów i w razie potrzeby dostosuj urządzenie do pomiaru temperatury (temperatura wody, wysokość i orientacja x-y w stosunku do powierzchni śledzenia).

9. Śledzenie lokomocji larw

UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z załączoną instrukcją dla FIMTrack (uzupełnienie). Schemat blokowy programu znajduje się na rysunku 2.

  1. Dostosuj parametry śledzenia dla odpowiednich eksperymentów, korzystając z opcji podglądu.
    1. Dostosuj piksel na cm zgodnie z kamerą i polem view.
    2. Dostosuj liczbę klatek na sekundę w oparciu o ustawienia aparatu.
    3. Dostosuj progi jasności tak, aby wszystkie zwierzęta były prawidłowo wykrywane (informacja zwrotna jest podawana w podglądzie).
    4. Dostosuj progi wielkości obszaru larwalnego. Zwróć uwagę na opcję informacji zwrotnej w podglądzie: pojedyncze zwierzęta są podświetlone na żółto, zderzające się larwy są podświetlone na czerwono, a obszar każdego zwierzęcia jest podany na niebiesko.
  2. Rozpocznij śledzenie za pomocą przycisku w prawym dolnym rogu.
    UWAGA: Po pomyślnym śledzeniu, obraz ze śladami larw i plik csv zawierający obliczone cechy lokomocji i postawy jest zapisywany w katalogu obrazów.
  3. Użyj modułu przeglądarki wyników programu FIM (Edytuj >Podgląd wyników...), aby przejrzeć i ręcznie dostosować wyniki śledzenia. W razie potrzeby zdefiniuj regiony bodźca, aby ocenić dane w odniesieniu do reżimu bodźca, np. orientację pełzania w odniesieniu do gradientu ciepła lub odległość do źródła nawania. W celu uzyskania bardziej szczegółowego opisu prosimy o skorzystanie z instrukcji (suplementu).

10. Ocena danych

  1. Zaimportuj plik csv do Excela, Matlaba lub dowolnego innego programu w celu dalszej analizy statystycznej.

Wyniki

Do obrazowania przetestowano kilka różnych kamer o różnych właściwościach rozdzielczości (Rysunek 4). Wszystkie kamery zostały wyposażone w odpowiedni filtr IR. Ze względu na niską rozdzielczość najtańszej kamery w tym teście, pole widzenia zostało ograniczone do 10 cm x 10 cm. Najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu kamery 4 megapikselowej (MP). Przekłada się to na rozdzielczość 100 pikseli na długość larwy trzeciego stadium, co pozwoliło na łatwe rozpoznanie struktur wewnętrznych. Dodatkowo można łatwo wyodrębnić perystaltykę zwierzęcia (Rysunek 4A). Niemniej jednak, można uzyskać filmy o wysokim kontraście przy użyciu tańszych kamer, które również mogą być analizowane przez FIMTrack. Użycie kamery 1,4 MP z głębią 8 bit i rozdzielczością 1 392 x 1 040 pikseli kosztuje około połowę mniej i zapewnia rozdzielczość 45 pikseli na długość larwy trzeciego stadium w polu widzenia. Można rozpoznać głowę, ale żadnych innych struktur wewnętrznych (Rysunek 4B). Śledzenie i detekcja perystaltyki są możliwe, ale dokładność jest zmniejszona (Rysunek 4B).

Przy użyciu jeszcze tańszej kamery 0,8 MP o rozdzielczości przestrzennej porównywalnej z kamerą 1,4 MP, głowa larwy nie może być już wiernie rozpoznana (Rysunek 4C). Śledzenie i analiza perystaltyki są możliwe, lecz wykazują większe drgania wynikające ze zwiększonego poziomu szumów. Co zaskakujące, nawet kamera internetowa USB o niskiej rozdzielczości zapewnia filmy wystarczającej jakości do obliczenia trajektorii larw (kamera 0,3 MP, poniżej 20 €, Rysunek 4D). Perystaltykę można obliczyć na podstawie pola powierzchni, jednak pomiary są bardzo zaszumione.

W naszej konfiguracji rutynowo korzystamy z kamery 4 MP. W przypadku przesiewania kamera ta umożliwia monitorowanie areny o wymiarach 22 cm x 22 cm, co oczywiście daje możliwość jednoczesnej analizy dużych grup zwierząt, umożliwiając tym samym analizę wysokoprzepustową. Przy takim ustawieniu długość larwy odpowiada 40 pikselom, co wciąż pozwala na rejestrację i analizę perystaltyki. Przykładowy obraz 15 trajektorii larw w gradiencie temperatury przedstawiono na ryc. 5A. Ponadto zastosowanie obiektywu makro pozwala na obrazowanie larw z bardzo wysoką rozdzielczością, dzięki czemu widoczne stają się liczne narządy wewnętrzne, a rozpoznawanie głowy zostaje dodatkowo usprawnione (ryc. 5B). Mogą one być ponadto wykorzystywane do bardziej szczegółowej analizy szerokiego zakresu zachowań20. Tę samą konfigurację można z łatwością wykorzystać do obrazowania pełzających nicieni C. elegans (ryc. 5C).

Analiza lokomocji drobnoustrojów; diagramy trajektorii, obrazy mikroskopowe, wykresy powierzchni w pikselach; badanie ruchu.
Rycina 4. Wyniki obrazowania i śledzenia FIM dla różnych kamer. (A) Lewo: obrazowanie FIM trzech larw pełzających na platformie śledzącej o wymiarach 10 cm x 10 cm, zarejestrowane przy użyciu kamery 4 MP z częstotliwością 10 fps. Środek: wycinek obrazu i trajektoria środka masy pojedynczej larwy. Wskazano obszar zwierzęcia. Prawo: powierzchnia larwy wykreślona w ciągu 100 klatek. Czerwona strzałka wskazuje punkt czasowy odpowiadający wycinkowi obrazu. (B) Analogicznie do (A), lecz zarejestrowane przy użyciu kamery 1,4 MP. (C) Analogicznie do (A), lecz zarejestrowane przy użyciu kamery 0,8 MP. (D) Analogicznie do (A), lecz zarejestrowane przy użyciu kamery 0,3 MP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki śledzenia neuronów; obrazy mikroskopowe nicieni; ścieżki neuronów na schemacie z kodowaniem kolorystycznym.
Rycina 5. Bodziec cieplny oraz zastosowania w wysokiej rozdzielczości. (A) Zastosowanie bodźca cieplnego (porównaj z Rycina 1). Trajektorie obliczone za pomocą FIMTrack. (B) Obraz z zastosowania w wysokiej rozdzielczości przedstawiający larwy trzeciego, drugiego i pierwszego stadium rozwojowego wykonany za pomocą obiektywu makro. Długość larwy trzeciego stadium odpowiada 400 pikselom w polu widzenia 2.5 x 2.5 cm. (C) Nicień C. elegans uchwycony za pomocą obrazowania FIM. Paski skali są zaznaczone. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W neuronauce behawioralnej obowiązkowe jest ilościowe rozszyfrowanie złożonych cech behawioralnych. W związku z tym duża liczba osób musi być obserwowana w wysokiej rozdzielczości, a do analizy statystycznej potrzebne są zautomatyzowane procedury. W tym miejscu opisano obrazowanie FIM, nowatorską, prostą i solidną konfigurację obrazowania, która zapewnia środki do monitorowania lokomocji szerokiej gamy zwierząt. Skuteczność systemu obrazowania FIM testowano przy użyciu larw Drosophila, płazińców wypławkowych i robaków C. elegans . Technologia FIM zapewnia wewnętrznie wysoki kontrast, aby wykryć nawet wewnętrzne struktury zwierząt, takie jak mózg, tchawica, jelita lub przedsionek. Co ważne, te wewnętrzne struktury są solidnie identyfikowane, dzięki czemu mogą służyć do automatycznej identyfikacji orientacji zwierzęcia19.

Na jakość filmów może mieć wpływ nadmierna ilość wody na powierzchni pełzającej. Dlatego tak ważne jest, aby kontrolować wilgotność agaru. Zbyt stary agar lub zbyt dużo wody na powierzchni może powodować artefakty. Podobnie upewnij się, że na powierzchni pełzającej nie ma pęcherzyków powietrza. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze przygotowana powierzchnia agaru pozwala na nagrywanie filmów przez 4 godziny.

Ze względu na podstawowe zasady fizyki, obrazowanie FIM generuje nagrania obrazu prawie wolne od szumów, co skutkuje doskonałą jakością obrazu. To z kolei ułatwia późniejszą komputerową analizę obrazu i umożliwia wysoką przepustowość. Jednak metodologia ogranicza się do analizy zwierząt, które mają bezpośredni kontakt z powierzchnią agaru. Oprogramowanie śledzące jest wyzwaniem dla zwierząt tworzących kształt pączka. Chociaż wskaźnik binarny rozpoznaje kształt pączka, może zostać obliczony nieprawidłowy grzbiet.

Ze względu na modułową konstrukcję stołu śledzącego, dwu- i trzykolorowe obrazowanie jest w zasięgu ręki. Co więcej, dodatkowe bodźce (światło, substancje zapachowe, bodźce elektryczne lub mechaniczne) mogą być łatwo dostarczane z góry. Program FIMTrack zaprojektowany z myślą o możliwościach obrazowania FIM może być łatwo zaadaptowany do śledzenia larw Drosophila, C. elegans lub wypławków. W związku z tym, a także ze względu na prostą i tanią konstrukcję (patrz http://FIM.uni-muenster.de), obrazowanie FIM jest możliwe do wykonania w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych, a w szczególności umożliwia pilnie potrzebne badania o wysokiej przepustowości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni S. Thomasowi, który zainicjował ten projekt, J. Hermannowi i U. Burgbacherowi za pomoc w budowie zestawu FIM. Prace te zostały sfinansowane przez DFG (SFB 629 B6).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Konfiguracja FIMNiestandardowa szczegóły dotyczące budowy lub zakupu zestawów są dostępne na życzenie
Płyta ze szkła akrylowegoCustom Dodatkowe do nalewania agaru
Płyta grzejnikowaCustom Płyta aluminiowa (lakier w kolorze czarnym matowym) przepuszczalna w przeciwległych miejscach z regulowanym mocowaniem
Pompy i węże do podgrzewania wody/chłodzeniaCustom oparty na GE healthcare MultiTempIII (nr: 18-1102-78) i Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Kamera standardowa (4 MP)Kamera BasleracA2040-25gmdomyślnie używana do konfiguracji FIM
Kamera testowa (1,4 MP)QImaging  1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)Aparat używany do porównania
Aparat testowy (0.8 MP)Point GreyDragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)Aparat używany do porównania
Aparat testowy (0.3 MP)Aparat SonyPS Eye USB2.0Aparat używany do porównania
Niestandardowy komputer wyposażony w procesor Intel co najmniej i5 lub lepszy, 16 GB pamięci RAM i wystarczającą ilość miejsca na dysku twardym [>1 TB]
Standardowe jedzenie dla muchNiestandardowe 
Fiolki standardowe na muchy 135 mlSarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Niemcy78 895
szalki Petriego 9 cmSarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Niemcy821,473
Ultraczysta woda dejonizowanaMerck Millipore, Darmstadt, NiemcySynergia 
NaClCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy3957.2
Agar spożywczyAppliChem GmbH, Darmstadt, NiemcyA0917,5000
Pędzel (mały i duży)MilanAquarell 310 Rozmiar 0 i 2
PirometrTrotecBP20

Bibliografia

  1. Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila. Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).
  2. Frye, M. A., Dickinson, M. H. Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).
  3. Fry, S. N. The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila. Science. 300 (5618), 495-498 (2003).
  4. Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Klämbt, C. Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects. EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57(2013).
  5. Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. Object tracking: A Survey. ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).
  6. Pistori, H., et al. Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model. Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PloS one. 3 (5), e2208(2008).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).
  9. Cui, X., et al. Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).
  10. Heng, X., et al. Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip. Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).
  11. Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion. Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).
  12. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).
  13. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  14. Yu, C. -C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PloS one. 8 (7), e69653(2013).
  16. Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nature communications. 2, 441(2011).
  17. Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).
  18. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  19. Risse, B., Thomas, S., Otto, N., Löpmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis. PLoS one. 8 (1), e53963(2013).
  20. Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C. Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images. Comput Biol Med. 14, (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oprogramowanie FIMtracklarwy Drosophilasfrustrowane ca kowite wewn trzne odbiciealgorytmy ledzenia kontur wurz dzenie do generowania gradientu temperaturywyj ciowe dane w formacie CSVmodu przegl dania wynik wwysokoprzepustowe przesiewanie
FIM Imaging i FIMtrack: dwa nowe narzędzia umożliwiające wysokowydajną i ekonomiczną analizę lokomocji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.