Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wizualizacja pełnej długości projekcji neuronalnych w zarodkach jest niezbędna do zrozumienia, jak rozwijają się sieci neuronalne ssaków. W tym miejscu opisujemy metodę oznaczania in situ podzbioru projekcji aksonów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) w celu oceny ich cech fenotypowych przy użyciu kilku genetycznie zmodyfikowanych linii myszy. Neurony TrkA-dodatnie są neuronami nocyceptorowymi, przeznaczonymi do przekazywania sygnałów bólowych. Wykorzystujemy linię myszy TrkAtaulacZ do oznaczania trajektorii wszystkich TrkA-dodatnich aksonów obwodowych w nienaruszonym zarodku myszy. Następnie rozmnażamy linię TrkAtaulacZ na tle zerowym Bax, które zasadniczo znosi apoptozę neuronów, w celu oceny pytań związanych ze wzrostem niezależnie od możliwego wpływu manipulacji genetycznych na przeżycie neuronów. Następnie genetycznie zmodyfikowane myszy będące przedmiotem zainteresowania są hodowane z linią zerową TrkAtaulacZ / Bax, a następnie są gotowe do badania przy użyciu technik opisanych w niniejszym dokumencie. Prezentacja ta zawiera szczegółowe informacje na temat planów hodowlanych myszy, genotypowania w czasie sekcji, przygotowania tkanek, barwienia i oczyszczania, aby umożliwić wizualizację trajektorii aksonów na całej długości w preparacji całego wierzchowca.
Wprowadzenie
Tworzenie precyzyjnych sieci neuronowych to złożony proces rozwojowy, niezbędny dla funkcjonowania układu nerwowego. Zaburzenie tego procesu prowadzi do dysfunkcji neuronów, która jest związana z chorobami neurologicznymi człowieka1-3. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw wzrostu aksonów i unerwienia docelowego u ssaków, opracowaliśmy protokół wizualizacji trajektorii aksonów neuronów czuciowych wyrażających TrkA przy użyciu kombinacji dwóch genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.
TrkA jest receptorem dla czynnika wzrostu nerwów NGF i jest funkcjonalnym markerem nocyceptywnych neuronów czuciowych4. TrkA ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez IACUC w Weill Cornell Medical College.
1. Przygotowanie tkanek
- Eutanazja samic w ciąży w czasie przez zwichnięcie szyjki macicy15. Rozbioruj zarodki E16 - E18 od samic w ciąży w czasie ciąży i umieść zarodki pojedynczo w dołkach 6-dołkowego naczynia, wypełnionego zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
- Opłucz zarodki w zimnym PBS.
- Usunąć niewielką część błony owodniowej zarodka i umieścić we wcześniej p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Genotypy zarodków TrkAWT/taulacZ : Bax-/- oraz TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- można jednoznacznie określić za pomocą standardowego genotypowania metodą PCR (Rycina 1). Barwienie X-gal wykazuje szczegółowe obwody aksonalne w obrębie tkanki podskórnej w zarodkach barwionych konwencjonalnie (Ryciny 2, 3a) oraz w całym organizmie zarodka po przejaśnieniu tkanek (Ryciny 3b, 4).
Skrzyżowaliśmy linię TrkA
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana powyżej procedura barwienia X-gal embrionalnych myszy TrkAtaulacZ pozwala na szybką i szczegółową wizualizację projekcji aksonów na duże odległości w nienaruszonym utrwalonym zarodku. Ze względu na zerowe tło Bax , myszy te pozwalają na sondowanie mechanizmów sygnałowych, które mogą przyczyniać się zarówno do wzrostu aksonów, jak i przeżycia neuronów. Kojarzenie się z interesującymi myszami transgenicznymi lub nokautowymi pozwala na kompleksową ocenę fenotypów aksonalnych i m.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Louisowi Reichardtowi za myszy TrkA taulacZ oraz dr Annette Markus za wnikliwą dyskusję i sugestie. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe z Fundacji Burke'a, a także grant badawczy Fundacji Whitehall 2010-08-61, grant badawczy z Fundacji Wings for Life (WFL-US-028/14), grant ZB1-1102-1 z Fundacji Christophera i Dany Reeve oraz granty 1R01EY022409 i 3R01EY022409-01S1 z National Eye Institute, dla JZ. KJO jest stypendystą Goldsmitha.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Roztwór do płukania tkanek A | Milipore | BG-6-B | |
| Roztwór do płukania tkanek B | Millipore | BG-7-B | |
| Roztwór bazowy do barwienia tkanek | Milipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Szklana fiolka scyntykalizacyjna | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Inkubator | Labline | Model 120 | |
| Szpilki do owadów | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-dołkowa miska | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Startery | IDT | niestandardowe startery | |
| Mieszanina Takara dNTP | Takara | 4030 | |
| Bufor Takara LA | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| Maszyna do PCR | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Alkohol benzylowy | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzoesan benzylu | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Mikroskop preparacyjny | Leica | M205A | |
| Aparat | Leica | DFC310FX | |
| Lampa pierścieniowa | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Bibliografia
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents wi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
