Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Tworzenie precyzyjnych sieci neuronowych to złożony proces rozwojowy, niezbędny dla funkcjonowania układu nerwowego. Zaburzenie tego procesu prowadzi do dysfunkcji neuronów, która jest związana z chorobami neurologicznymi człowieka^1-3. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw wzrostu aksonów i unerwienia docelowego u ssaków, opracowaliśmy protokół wizualizacji trajektorii aksonów neuronów czuciowych wyrażających TrkA przy użyciu kombinacji dwóch genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.

TrkA jest receptorem dla czynnika wzrostu nerwów NGF i jest funkcjonalnym markerem nocyceptywnych neuronów czuciowych⁴. TrkA ulega silnej ekspresji w neuronach nocyceptywnych we wczesnym okresie rozwoju i pośredniczy w zależnym od NGF przetrwaniu neuronów, wzroście aksonów, arboryzacji i unerwieniu celu^5-9. U myszy TrkA^taulacZ gen TrkA typu dzikiego jest zastępowany kasetą ekspresji taulacZ ¹⁰, tak że morfologię aksonalną przypuszczalnych neuronów TrkA-dodatnich można uwidocznić za pomocą barwienia β-gal (X-gal)¹¹. Korzystając z heterozygotycznej linii TrkA^taulacZ/WT, możemy badać czynniki, które mogą regulować lub zakłócać rozwój sensorycznych projekcji aferentnych in vivo.

Ponadto, ekspresja TrkA nie występuje u homozygotycznych myszy TrkA^{taulacZ/taulacZ}, co może być zatem wykorzystane do oceny mechanizmów sprzyjających wzrostowi aksonów przy braku sygnalizacji NGF/TrkA. Ponieważ neurony nocyceptywne zależą od sygnalizacji NGF / TrkA nie tylko dla wzrostu aksonów, ale także dla przetrwania, zatrudniamy inną linię myszy, pozbawioną proapoptotycznego genu Bax, do hamowania apoptozy w embrionalnych neuronach DRG, ratując je przed śmiercią komórki, która jest obserwowana w przypadku braku sygnalizacji TrkA. Tło Bax^{-/- 12} pozwala zatem na molekularną dyssekcję szlaków sygnałowych, które specyficznie wpływają na wzrost aksonów^7-9,13-15. U myszy TrkA^-/-: Bax^-/- neurony DRG przeżywają, ale unerwienie czuciowo-aferentne w skórze jest całkowicie zniesione^14,15. Możemy selektywnie aktywować szlaki sygnałowe, aby określić ich odpowiedni wkład w rozwój projekcji aksonów. Użyteczność tej metody polega na tym, że umożliwia ona ocenę zmian w fenotypach wzrostu aksonów, gdy różne modyfikacje genetyczne są hodowane na tłach TrkA^{taulacZ / taulacZ} : Bax^-/- lub TrkA^{taulacZ / WT} : Bax^-/-.

UWAGA: Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez IACUC w Weill Cornell Medical College.

1. Przygotowanie tkanek

1. Eutanazja samic w ciąży w czasie przez zwichnięcie szyjki macicy¹⁵. Rozbioruj zarodki E16 - E18 od samic w ciąży w czasie ciąży i umieść zarodki pojedynczo w dołkach 6-dołkowego naczynia, wypełnionego zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
2. Opłucz zarodki w zimnym PBS.
3. Usunąć niewielką część błony owodniowej zarodka i umieścić we wcześniej przygotowanym roztworze proteinazy K w celu późniejszego genotypowania. Alternatywnie, jeśli błona owodniowa zostanie utracona, usuń niewielką część końcówki ogona zarodka i umieść ją w roztworze proteinazy K
4. Zrób w skórze wokół zarodka za pomocą szpilek do owadów (co najmniej 100 z każdej strony).
5. Usuń PBS i powoli dodaj świeży 2% paraformaldehyd (PFA) o pH 7,4 do studzienki.
6. Delikatnie wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Opłucz zarodki dwukrotnie w PBS i przechowuj w PBS w temperaturze 4 °C do momentu zabarwienia.

2. Genotypowanie

1. Zanurzyć błony owodniowe lub ogony zarodków w mieszaninie proteinazy K zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut.
3. Ekstrahuj DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA.
4. Pobrać 0,5 μl z całkowitej ilości 200 μl oczyszczonego roztworu genomowego DNA, połączyć go z 0,5 μl każdego ze specyficznych dla genu starterów sensownych i antysensownych (10 μM), 2 μl dNTP Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 0,2 μl polimerazy Taq (5 U/μl) i 2 μl buforu PCR (10x), dodać_H2Odo całkowitej objętości 20 μl.
   UWAGA: Sekwencje starterów są następujące (Tabela 1):
   TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Długość fragmentu PCR: 400 par zasad (bp).
   Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; Długości fragmentów PCR: typ dziki, 304 pz; Bax null, 507 bp.
   TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; Długość fragmentu PCR: 360 pz.
5. Uruchom PCR z następującym programem dla TrkA: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 20 s w 68 °C, krok 4: 30 s w 72 °C. Powtórz kroki 2 - 4 przez 40 cykli.
   1. W przypadku LacZ i Bax uruchom PCR z następującym programem: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 1 min w 54 °C, krok 4: 1 min w 72 °C, powtórz kroki 2 - 4 przez 35 cykli.
6. Uruchom próbki PCR na 2% żelu agarozowym przy 100 V w 1x buforze Tris-Acetate-EDTA przez 20 minut z pasem drabinki DNA w celu oceny długości fragmentów.
7. Analizuj zarodki pod kątem obecności alleli zerowych typu dzikiego TrkA, TrkA-tauLacZ i Bax. Genotypy zarodków doświadczalnych to TrkA^taulacZ/WT : Bax ^-/- i TrkA^{taulacZ/taulacZ} : Bax^-/-, w zależności od pytań doświadczalnych. Zarodki pozbawione reportera tauLacZ będą ujemne pod względem barwienia aksonów i dlatego mogą służyć jako kontrola ujemna w celu kalibracji procesu barwienia.

3. Barwienie zarodków

1. Użyj komercyjnego zestawu do barwienia lacZ z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej w sekcjach 3.2 - 3.8. Tutaj użyj zestawu Millipore.
2. Zanurz zarodki w buforze A na co najmniej 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
3. Bezpośrednio zanurzyć zarodki w buforze B na co najmniej 15 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
4. Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, należy wstępnie ogrzać roztwór zasady tkankowej w temperaturze 37 °C. Użyć 5 ml roztworu zasady tkankowej na zarodek.
5. Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, przygotuj świeży 5-bromo-4-chloro-3-indolyl α-D-galaktopyranozyd (X-gal) w stężeniu 40 mg/ml w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO).
6. Rozcieńczyć X-gal we wstępnie podgrzanym roztworze bazy tkankowej o stężeniu 1 mg/ml i dodać 5 ml mieszaniny X-gal/zasady tkankowej do szklanej fiolki scyntylacyjnej.
7. Przenieść zarodki do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszaninę X-gal/zasady tkankowej. Uszczelnić pokrywę Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, sprawdzając, czy nie ma niebieskiej plamy.
8. Zarodki postfiksowe ze świeżym 4% PFA, pH 7,4. Delikatnie wstrząsać przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
9. Opłucz zarodki dwukrotnie w zimnym PBS.

4. Odwodnienie i oczyszczanie tkanek

1. Umieść zarodki w mieszaninie 50% metanolu/50% PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
2. Kontynuuj odwadnianie w 75% metanolu / 25% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
3. Kontynuuj odwadnianie w 90% metanolu / 10% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
4. Kontynuuj odwadnianie w 100% metanolu przez 30 minut (2x) w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
5. Podczas odwadniania zarodków przygotuj mieszaninę alkoholu benzoilowego i benzoesanu benzoilu w proporcji 1:1 (v:v).
   UWAGA: Alkohol benzoilowy i benzoesan benzoilu są toksyczne.
6. Zanurz zarodki w mieszaninie 1:1 (v:v) 100% metanolu: 100% BABB na 15 minut. Używaj tylko szkła, ponieważ BABB rozpuści plastik.
7. Zanurz zarodki w 100% BABB, aby całkowicie oczyścić tkankę i uwidocznić barwienie X-gal w oczyszczonym zarodku.
   UWAGA: Obraz tak szybko, jak to możliwe, ponieważ plama X-gal z czasem wyblaknie.

5. Obrazowanie całego mocowania

1. Ustabilizuj zarodek, zanurzony w 100% BABB, pod odpowiednimi kątami do fotografii za pomocą metalowych kleszczyków. Oświetlaj za pomocą kombinacji źródeł światła w górę i w dole.
2. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową. Wykonaj wiele ekspozycji w jasnym polu w pięciu kolejnych płaszczyznach ogniskowych oddalonych od siebie o 0,5 mm wzdłuż osi Z. Czasy naświetlania i przysłony mogą się różnić w zależności od oświetlenia i specyfikacji aparatu i muszą być zoptymalizowane dla każdej konfiguracji.
3. Użyj standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przetwarzać obrazy nakładkowe i generować fotomontaże.

Genotypy zarodków TrkAWT/taulacZ : Bax-/- i TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- embriony można jednoznacznie określić za pomocą standardowego genotypowania PCR (Rysunek 1). Barwienie X-gal pokazuje szczegółowe obwodowe altanki aksonalne podskórnie w konwencjonalnie barwionych zarodkach (ryc. 2, 3a) i na całym zarodku po oczyszczeniu tkanek (ryc. 3b, 4).

Wyhodowaliśmy linię TrkAWT/taulacZ : Bax-/- z myszami posiadającymi konstytutywnie aktywowaną kinazą mutację B-RAF (V600E) (LSL-kaBraf16) pod kontrolą specyficznego dla neuronu promotora nestyny17, aby uzyskać myszy LSL-kaBraf : TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-. W tych zarodkach, które są całkowicie pozbawione sygnalizacji TrkA, morfologia obwodowych projekcji nocyceptorów rozwinęła się jednak prawie normalnie (ryc. 4). Pokazuje to kluczową funkcję sygnalizacji B-RAF w obwodowym wzroście aksonów, a także pokazuje, że funkcje sygnalizacji TrkA promujące przeżycie i wzrost aksonów można rozdzielić, a tło genetyczne Bax-/- zastępuje utratę sygnalizacji przeżycia zależnej od TrkA.

Rycina 1: Genotypowanie myszy transgenicznych. Reprezentatywne obrazy żelu agarozowego. Próbka 1: TrkAWT/taulacZ : BaxWT/-, próbka 2: TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-, próbka 3: TrkAWT/taulacZ : Bax-/-.

Rysunek 2: Mysz E18.5TrkA WT/taulacZ barwiona X-gal. Wypustki aksonów ze zwojów nerwu trójdzielnego w tułowiu i głowie są pokazane w nieoczyszczonym zarodku. Podziałka: 1 mm.

Rysunek 3: Mysz E18.5 TrkAWT/taulacZ barwiona X-gal (A) przed i (B) po oczyszczeniu za pomocą BABB. Pokazane są projekcje z DRG w połowie tułowia. Podziałka: 2 mm.

Ryc. 4: E16.5 LSL-kaBraf : TrkAtaulacZ / taulacZ : Bax-/- : zarodek myszy nestin-Cre barwiony X-gal i oczyszczony BABB. kaBraf koduje aktywowane kinazą białko kinazy B-RAF, B-RAFV600E. Ekspresja kaB-RAF w neuronach DRG skutkowała pełnowymiarowym, zbliżonym do normalnego wydłużeniem aksonu przy braku sygnalizacji TrkA. Podziałka: 1 mm. Aby uzyskać więcej obrazów, w tym elementy sterujące, patrz ref. 15, Rysunek 2.

Tabela 1: Startery używane do genotypowania PCR.

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.