Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52212

⸱

9 grudnia 2014

 ,  , 
1Brain and Mind Research Institute, Burke Medical Research Institute, Weill Medical College of Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Streszczenie

Wizualizacja pełnej długości projekcji neuronalnych w zarodkach jest niezbędna do zrozumienia, jak rozwijają się sieci neuronalne ssaków. W tym miejscu opisujemy metodę oznaczania in situ podzbioru projekcji aksonów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) w celu oceny ich cech fenotypowych przy użyciu kilku genetycznie zmodyfikowanych linii myszy. Neurony TrkA-dodatnie są neuronami nocyceptorowymi, przeznaczonymi do przekazywania sygnałów bólowych. Wykorzystujemy linię myszy TrkAtaulacZ do oznaczania trajektorii wszystkich TrkA-dodatnich aksonów obwodowych w nienaruszonym zarodku myszy. Następnie rozmnażamy linię TrkAtaulacZ na tle zerowym Bax, które zasadniczo znosi apoptozę neuronów, w celu oceny pytań związanych ze wzrostem niezależnie od możliwego wpływu manipulacji genetycznych na przeżycie neuronów. Następnie genetycznie zmodyfikowane myszy będące przedmiotem zainteresowania są hodowane z linią zerową TrkAtaulacZ / Bax, a następnie są gotowe do badania przy użyciu technik opisanych w niniejszym dokumencie. Prezentacja ta zawiera szczegółowe informacje na temat planów hodowlanych myszy, genotypowania w czasie sekcji, przygotowania tkanek, barwienia i oczyszczania, aby umożliwić wizualizację trajektorii aksonów na całej długości w preparacji całego wierzchowca.

Wprowadzenie

Tworzenie precyzyjnych sieci neuronowych to złożony proces rozwojowy, niezbędny dla funkcjonowania układu nerwowego. Zaburzenie tego procesu prowadzi do dysfunkcji neuronów, która jest związana z chorobami neurologicznymi człowieka1-3. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw wzrostu aksonów i unerwienia docelowego u ssaków, opracowaliśmy protokół wizualizacji trajektorii aksonów neuronów czuciowych wyrażających TrkA przy użyciu kombinacji dwóch genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.

TrkA jest receptorem dla czynnika wzrostu nerwów NGF i jest funkcjonalnym markerem nocyceptywnych neuronów czuciowych4. TrkA ulega silnej ekspresji w neuronach nocyceptywnych we wczesnym okresie rozwoju i pośredniczy w zależnym od NGF przetrwaniu neuronów, wzroście aksonów, arboryzacji i unerwieniu celu5-9. U myszy TrkAtaulacZ gen TrkA typu dzikiego jest zastępowany kasetą ekspresji taulacZ 10, tak że morfologię aksonalną przypuszczalnych neuronów TrkA-dodatnich można uwidocznić za pomocą barwienia β-gal (X-gal)11. Korzystając z heterozygotycznej linii TrkAtaulacZ/WT, możemy badać czynniki, które mogą regulować lub zakłócać rozwój sensorycznych projekcji aferentnych in vivo.

Ponadto, ekspresja TrkA nie występuje u homozygotycznych myszy TrkAtaulacZ/taulacZ, co może być zatem wykorzystane do oceny mechanizmów sprzyjających wzrostowi aksonów przy braku sygnalizacji NGF/TrkA. Ponieważ neurony nocyceptywne zależą od sygnalizacji NGF / TrkA nie tylko dla wzrostu aksonów, ale także dla przetrwania, zatrudniamy inną linię myszy, pozbawioną proapoptotycznego genu Bax, do hamowania apoptozy w embrionalnych neuronach DRG, ratując je przed śmiercią komórki, która jest obserwowana w przypadku braku sygnalizacji TrkA. Tło Bax-/- 12 pozwala zatem na molekularną dyssekcję szlaków sygnałowych, które specyficznie wpływają na wzrost aksonów7-9,13-15. U myszy TrkA-/-: Bax-/- neurony DRG przeżywają, ale unerwienie czuciowo-aferentne w skórze jest całkowicie zniesione14,15. Możemy selektywnie aktywować szlaki sygnałowe, aby określić ich odpowiedni wkład w rozwój projekcji aksonów. Użyteczność tej metody polega na tym, że umożliwia ona ocenę zmian w fenotypach wzrostu aksonów, gdy różne modyfikacje genetyczne są hodowane na tłach TrkAtaulacZ / taulacZ : Bax-/- lub TrkAtaulacZ / WT : Bax-/-.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Protokół na zwierzętach został zatwierdzony przez IACUC w Weill Cornell Medical College.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Eutanazja samic w ciąży w czasie przez zwichnięcie szyjki macicy15. Rozbioruj zarodki E16 - E18 od samic w ciąży w czasie ciąży i umieść zarodki pojedynczo w dołkach 6-dołkowego naczynia, wypełnionego zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
  2. Opłucz zarodki w zimnym PBS.
  3. Usunąć niewielką część błony owodniowej zarodka i umieścić we wcześniej przygotowanym roztworze proteinazy K w celu późniejszego genotypowania. Alternatywnie, jeśli błona owodniowa zostanie utracona, usuń niewielką część końcówki ogona zarodka i umieść ją w roztworze proteinazy K
  4. Zrób w skórze wokół zarodka za pomocą szpilek do owadów (co najmniej 100 z każdej strony).
  5. Usuń PBS i powoli dodaj świeży 2% paraformaldehyd (PFA) o pH 7,4 do studzienki.
  6. Delikatnie wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  7. Opłucz zarodki dwukrotnie w PBS i przechowuj w PBS w temperaturze 4 °C do momentu zabarwienia.

2. Genotypowanie

  1. Zanurzyć błony owodniowe lub ogony zarodków w mieszaninie proteinazy K zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut.
  3. Ekstrahuj DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA.
  4. Pobrać 0,5 μl z całkowitej ilości 200 μl oczyszczonego roztworu genomowego DNA, połączyć go z 0,5 μl każdego ze specyficznych dla genu starterów sensownych i antysensownych (10 μM), 2 μl dNTP Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 0,2 μl polimerazy Taq (5 U/μl) i 2 μl buforu PCR (10x), dodaćH2Odo całkowitej objętości 20 μl.
    UWAGA: Sekwencje starterów są następujące (Tabela 1):
    TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Długość fragmentu PCR: 400 par zasad (bp).
    Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; Długości fragmentów PCR: typ dziki, 304 pz; Bax null, 507 bp.
    TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; Długość fragmentu PCR: 360 pz.
  5. Uruchom PCR z następującym programem dla TrkA: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 20 s w 68 °C, krok 4: 30 s w 72 °C. Powtórz kroki 2 - 4 przez 40 cykli.
    1. W przypadku LacZ i Bax uruchom PCR z następującym programem: krok 1: 1 min w 95 °C, krok 2: 10 s w 95 °C, krok 3: 1 min w 54 °C, krok 4: 1 min w 72 °C, powtórz kroki 2 - 4 przez 35 cykli.
  6. Uruchom próbki PCR na 2% żelu agarozowym przy 100 V w 1x buforze Tris-Acetate-EDTA przez 20 minut z pasem drabinki DNA w celu oceny długości fragmentów.
  7. Analizuj zarodki pod kątem obecności alleli zerowych typu dzikiego TrkA, TrkA-tauLacZ i Bax. Genotypy zarodków doświadczalnych to TrkAtaulacZ/WT : Bax -/- i TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/-, w zależności od pytań doświadczalnych. Zarodki pozbawione reportera tauLacZ będą ujemne pod względem barwienia aksonów i dlatego mogą służyć jako kontrola ujemna w celu kalibracji procesu barwienia.

3. Barwienie zarodków

  1. Użyj komercyjnego zestawu do barwienia lacZ z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej w sekcjach 3.2 - 3.8. Tutaj użyj zestawu Millipore.
  2. Zanurz zarodki w buforze A na co najmniej 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  3. Bezpośrednio zanurzyć zarodki w buforze B na co najmniej 15 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  4. Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, należy wstępnie ogrzać roztwór zasady tkankowej w temperaturze 37 °C. Użyć 5 ml roztworu zasady tkankowej na zarodek.
  5. Gdy zarodki znajdują się w buforze A/B, przygotuj świeży 5-bromo-4-chloro-3-indolyl α-D-galaktopyranozyd (X-gal) w stężeniu 40 mg/ml w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO).
  6. Rozcieńczyć X-gal we wstępnie podgrzanym roztworze bazy tkankowej o stężeniu 1 mg/ml i dodać 5 ml mieszaniny X-gal/zasady tkankowej do szklanej fiolki scyntylacyjnej.
  7. Przenieść zarodki do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej mieszaninę X-gal/zasady tkankowej. Uszczelnić pokrywę Parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, sprawdzając, czy nie ma niebieskiej plamy.
  8. Zarodki postfiksowe ze świeżym 4% PFA, pH 7,4. Delikatnie wstrząsać przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
  9. Opłucz zarodki dwukrotnie w zimnym PBS.

4. Odwodnienie i oczyszczanie tkanek

  1. Umieść zarodki w mieszaninie 50% metanolu/50% PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
  2. Kontynuuj odwadnianie w 75% metanolu / 25% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
  3. Kontynuuj odwadnianie w 90% metanolu / 10% PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
  4. Kontynuuj odwadnianie w 100% metanolu przez 30 minut (2x) w temperaturze pokojowej, wstrząsając szklanymi fiolkami.
  5. Podczas odwadniania zarodków przygotuj mieszaninę alkoholu benzoilowego i benzoesanu benzoilu w proporcji 1:1 (v:v).
    UWAGA: Alkohol benzoilowy i benzoesan benzoilu są toksyczne.
  6. Zanurz zarodki w mieszaninie 1:1 (v:v) 100% metanolu: 100% BABB na 15 minut. Używaj tylko szkła, ponieważ BABB rozpuści plastik.
  7. Zanurz zarodki w 100% BABB, aby całkowicie oczyścić tkankę i uwidocznić barwienie X-gal w oczyszczonym zarodku.
    UWAGA: Obraz tak szybko, jak to możliwe, ponieważ plama X-gal z czasem wyblaknie.

5. Obrazowanie całego mocowania

  1. Ustabilizuj zarodek, zanurzony w 100% BABB, pod odpowiednimi kątami do fotografii za pomocą metalowych kleszczyków. Oświetlaj za pomocą kombinacji źródeł światła w górę i w dole.
  2. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową. Wykonaj wiele ekspozycji w jasnym polu w pięciu kolejnych płaszczyznach ogniskowych oddalonych od siebie o 0,5 mm wzdłuż osi Z. Czasy naświetlania i przysłony mogą się różnić w zależności od oświetlenia i specyfikacji aparatu i muszą być zoptymalizowane dla każdej konfiguracji.
  3. Użyj standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przetwarzać obrazy nakładkowe i generować fotomontaże.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Genotypy zarodków TrkAWT/taulacZ : Bax-/- oraz TrkAtaulacZ/taulacZ : Bax-/- można jednoznacznie określić za pomocą standardowego genotypowania metodą PCR (Rycina 1). Barwienie X-gal wykazuje szczegółowe obwody aksonalne w obrębie tkanki podskórnej w zarodkach barwionych konwencjonalnie (Ryciny 2, 3a) oraz w całym organizmie zarodka po przejaśnieniu tkanek (Ryciny 3b, 4).

Skrzyżowaliśmy linię TrkA

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana powyżej procedura barwienia X-gal embrionalnych myszy TrkAtaulacZ pozwala na szybką i szczegółową wizualizację projekcji aksonów na duże odległości w nienaruszonym utrwalonym zarodku. Ze względu na zerowe tło Bax , myszy te pozwalają na sondowanie mechanizmów sygnałowych, które mogą przyczyniać się zarówno do wzrostu aksonów, jak i przeżycia neuronów. Kojarzenie się z interesującymi myszami transgenicznymi lub nokautowymi pozwala na kompleksową ocenę fenotypów aksonalnych i m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Louisowi Reichardtowi za myszy TrkA taulacZ oraz dr Annette Markus za wnikliwą dyskusję i sugestie. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe z Fundacji Burke'a, a także grant badawczy Fundacji Whitehall 2010-08-61, grant badawczy z Fundacji Wings for Life (WFL-US-028/14), grant ZB1-1102-1 z Fundacji Christophera i Dany Reeve oraz granty 1R01EY022409 i 3R01EY022409-01S1 z National Eye Institute, dla JZ. KJO jest stypendystą Goldsmitha.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PFASigma-AldrichP6418
PBSLife Tech10010-023
Roztwór do płukania tkanek AMiliporeBG-6-B
Roztwór do płukania tkanek BMilliporeBG-7-B
Roztwór bazowy do barwienia tkanekMiliporeBG-8-C
X-galSigma-AldrichB4252
Szklana fiolka scyntykalizacyjnaKimble Chase74500-20
InkubatorLablineModel 120
Szpilki do owadówFST26000-30
DMSOSigma-AldrichD8418
6-dołkowa miskaUSA ScientificCC7672-7506
StarteryIDTniestandardowe startery
Mieszanina Takara dNTPTakara4030
Bufor Takara LATakaraRR002A
Takara LA TaqTakaraRR002A
Maszyna do PCRBio-RadDNA Engine Dyad
Alkohol benzylowySigma-AldrichB-1042
Benzoesan benzyluSigma-AldrichB-6630
Mikroskop preparacyjnyLeicaM205A
AparatLeicaDFC310FX
Lampa pierścieniowaLeica MEB110
PhotoshopAdobePhotoshop 4.0
DNA

Bibliografia

  1. Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
  2. Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
  3. Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
  4. Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
  5. White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
  6. Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
  7. Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
  8. Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
  9. Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
  10. Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
  11. Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
  12. Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
  13. Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
  14. Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
  15. Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
  16. Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
  17. Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
  18. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  19. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  20. Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

neurony TrkA-dodatniereporter Tau LacZtło Bax nullprzejrzyszczanie tkanekroztwór BABBbarwienie ALSprotokół genotypowania
Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.