Opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy i pokazujemy, że jest ona wystarczająco wrażliwa na zmiany fenotypu w wielu powszechnych patologiach płuc. Metryka ta ma zatem bezpośrednie znaczenie translacyjne dla modeli mysich, ponieważ zdolność dyfuzji można również łatwo zmierzyć u ludzi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysz jest teraz głównym zwierzęciem używanym do modelowania różnych chorób płuc. Aby zbadać mechanizmy, które leżą u podstaw takich patologii, potrzebne są metody fenotypowe, które mogą określić ilościowo zmiany patologiczne. Ponadto, aby zapewnić znaczenie translacyjne dla modeli mysich, takie pomiary powinny być testami, które można łatwo przeprowadzić zarówno na ludziach, jak i na myszach. Niestety, w obecnym piśmiennictwie niewiele fenotypowych pomiarów czynności płuc ma bezpośrednie zastosowanie u ludzi. Jednym z wyjątków jest zdolność dyfuzji tlenku węgla, która jest pomiarem rutynowo wykonywanym u ludzi. W niniejszym raporcie opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru tej zdolności dyfuzyjnej u myszy. Procedura polega na krótkim napompowaniu płuc gazami znakującymi w znieczulonej myszy, a następnie 1-minutowym czasie analizy gazu. Przetestowaliśmy zdolność tej metody do wykrywania kilku patologii płuc, w tym rozedmy płuc, zwłóknienia, ostrego uszkodzenia płuc oraz grypy i grzybiczych infekcji płuc, a także monitorowania dojrzewania płuc u młodych szczeniąt. Wyniki wskazują na znaczne zmniejszenie wszystkich patologii płuc, a także wzrost zdolności dyfuzji wraz z dojrzewaniem płuc. Ten pomiar zdolności dyfuzyjnej płuc zapewnia zatem test czynnościowy płuc, który ma szerokie zastosowanie dzięki zdolności do wykrywania fenotypowych zmian strukturalnych w większości istniejących patologicznych modeli płuc.
Wprowadzenie
Mysz jest teraz głównym zwierzęciem używanym do modelowania różnych chorób płuc. Aby zbadać mechanizmy, które leżą u podstaw takich patologii, potrzebne są metody fenotypowe, które mogą określić ilościowo zmiany patologiczne. Chociaż istnieje wiele badań na myszach, w których mierzy się mechanikę wentylacji, pomiary te są na ogół niezwiązane ze standardowymi ocenami czynności płuc zwykle wykonywanymi u ludzi. Jest to niefortunne, ponieważ możliwość wykonywania równoważnych pomiarów u myszy i ludzi może ułatwić przełożenie wyników w modelach mysich na choroby ludzkie.
Jednym z najczęstszych i najłatwiejszych do wykonania pomiarów u ludzi jest zdolność dyfuzji tlenku węgla (DLCO)1,2, ale ten pomiar rzadko był wykonywany w modelach mysich. W tych badaniach, w których zgłoszono3-7 przypadków, nie przeprowadzono badań uzupełniających, częściowo dlatego, że procedury są często uciążliwe lub mogą wymagać skomplikowanego sprzętu. Innym podejściem jest zastosowanie metody ponownego oddychania CO w systemie w stanie ustalonym, który ma tę zaletę, że jest w stanie zmierzyć dyfuzję CO u świadomych myszy. Jednak ta metoda jest bardzo uciążliwa, a wyniki mogą się różnić w zależności od poziomu wentylacji myszy, a także stężeń O2 i CO2 8,9. Wydaje się, że trudności te uniemożliwiły rutynowe stosowanie zdolności dyfuzyjnej do wykrywania patologii płuc u myszy, pomimo jej kilku zalet.
Aby obejść problemy z pomiarem zdolności dyfuzyjnej u myszy, ostatnio opisano szczegóły prostego sposobu jej pomiaru u myszy10. Procedura eliminuje trudny problem pobierania próbek niezanieczyszczonego gazu pęcherzykowego poprzez szybkie pobranie próbki objętości równej całemu wdychanemu gazowi. Procedura ta daje bardzo powtarzalny pomiar, określany jako współczynnik dyfuzji tlenku węgla (DFCO), który jest wrażliwy na wiele patologicznych zmian w fenotypie płuc. DFCO oblicza się zatem jako 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec), gdzie indeksy dolne c i 9 odnoszą się odpowiednio do stężeń wstrzykiwanych gazów kalibracyjnych i gazów usuwanych po 9-sekundowym czasie wstrzymania oddechu. DFCO jest zmienną bezwymiarową, która waha się między 0 a 1, gdzie 1 oznacza całkowity absorpcję całego CO, a 0 oznacza brak absorpcji CO.
W tej prezentacji pokazujemy, jak dokonać pomiaru zdolności dyfuzyjnej i jak można go użyć do udokumentowania zmian w prawie wszystkich istniejących modelach chorób płuc myszy, w tym rozedmy płuc, zwłóknienia, ostrego uszkodzenia płuc oraz infekcji wirusowych i grzybiczych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Przygotowanie zwierząt
- Przygotuj 6 myszy kontrolnych C57BL/6 do pomiaru DFCO, znieczulając je ketaminą i ksylazyną, jak opisano w kroku 2.3 poniżej.
- Przygotuj wszystkie inne myszy z różnymi patologiami płuc pokazanymi w Tabeli 1, stosując tę samą procedurę, co w przypadku kontroli. Szczegółowe informacje potrzebne do ustalenia każdego z tych modeli można znaleźć w odpowiednich odniesieniach. Myszy kontrolne i te z innych kohort patologicznych są w wieku 6-12 tygodni.
2. Pomiar współczynnika dyfuzji tlenku węgla (DFCO)
- Skonfiguruj moduł chromatografu gazowego dostarczony z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania należy używać wyłącznie danych neonu i CO.
UWAGA: Ten instrument wykorzystuje kolumnę sita molekularnego z helem jako gazem nośnym, z folią 12,00 μm, średnicą wewnętrzną 320,00 μm i długością 10 m. Kolumna chromatografu ma objętość 0,8 ml, ale użyliśmy 2 ml, aby zapewnić odpowiednie udrażnienie rurki łączącej z próbką. - Na początku każdego dnia doświadczalnego, przed wykonaniem pomiarów próbek od myszy, należy pobrać próbkę o objętości 2 ml bezpośrednio z worka na mieszaninę gazów zawierającego około 0,5% Ne, 0,5% CO i powietrza równoważącego, a następnie użyć tej próbki do kalibracji chromatografu gazowego.
- Znieczulij myszy ketaminą (90 mg/kg) i ksylazyną (15 mg/kg) i potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Tracheostomię myszy za pomocą kaniuli igłowej (18 G u dorosłych lub 20 G u bardzo młodych myszy).
UWAGA: DFCO jest zakończone w mniej niż 10 minut po znieczuleniu i przed jakąkolwiek wentylacją mechaniczną lub innymi zabiegami. - U myszy w wieku powyżej 6 tygodni należy użyć strzykawki o pojemności 3 ml, aby pobrać 0,8 ml gazu z worka z mieszaniną gazów. Podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuco. Za pomocą metronomu odlicz 9 sekund, a następnie szybko odciągnij 0,8 ml (wydychane powietrze).
- To pobrane 0,8 ml wydychanego powietrza rozcieńczyć do 2 ml powietrzem z pomieszczenia, pozostawić na co najmniej 15 sekund. Następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego w celu analizy.
- Analizując tę pierwszą próbkę DFCO, napompuj płuco myszy drugim 0,8 ml z worka z mieszaniną gazów, a następnie przetrzyj tę próbkę identycznie jak pierwszą próbkę. Uśrednij dwa pomiary DFCO.
UWAGA: Do pomiarów u myszy w wieku zaledwie 2 tygodni należy użyć objętości 0,4 ml, ponieważ 0,8 ml to zbyt duża objętość, aby dokonać pomiarów w płucach bardzo młodych myszy. Lepiej jest użyć objętości 0,8 ml dla myszy starszych niż 6 tygodni, a jeśli objętość 0,4 ml jest potrzebna dla niektórych myszy, należy ją stosować konsekwentnie dla wszystkich myszy w badanej kohorcie. - Obliczyć DFCO jako 1 – (CO9 / COc) / (Ne9 / Nec), gdzie indeksy dolne c i 9 odnoszą się odpowiednio do stężeń wstrzykiwanych gazów kalibracyjnych i gazów usuwanych po 9-sekundowym czasie wstrzymania oddechu.
- Analizuj i porównuj różnice za pomocą jednokierunkowej ANOVA i oceń poziom istotności za pomocą poprawki Tukeya dla wielokrotnych porównań we wszystkich myszach kohortowych. Za wartość znaczącą należy uznać p <0,05.
UWAGA: Wszystkie myszy użyte tutaj były częścią badań eksperymentalnych obejmujących kilka kolejnych pomiarów wentylacji płuc, mechaniki, płukania płuc lub histologii, które nie są tutaj opisane. Ponadto, ponieważ metoda jest taka sama we wszystkich modelach eksperymentalnych, jak to zostało zrobione powyżej u myszy kontrolnych, przedstawiono tylko wyniki z różnych modeli patologicznych. Więcej informacji na temat tych modeli znajduje się w tabeli uzupełniającej. - Poddaj zwierzęta eutanazji przez przedawkowanie głębokiego znieczulenia, a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy. W razie potrzeby należy usunąć komórki i/lub tkanki płuc od martwych myszy w celu dalszego przetwarzania i analizy biologicznej lub histologicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia pomiary DFCO u dorosłych myszy w grupach A, B, C, D, E i F. Odnotowano istotne spadki zarówno przy infekcjach Aspergillus, jak i grypą, a także istotne spadki w modelach włóknienia, rozedmy i ostrego uszkodzenia płuc. Rysunek 2 przedstawia zmiany rozwojowe DFCO w czasie w grupie G, w miarę starzenia się myszy od 2. do 6. tygodnia. W tym przedziale czasowym zaobserwowano niewielki, ale istotny wzrost wraz z rozwojem płuc. Efekt zastosowania mniejszej objętości inflac...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy zdefiniowaliśmy nową metrykę do ilościowego określenia zdolności płuc myszy do wymiany gazów. Wskaźnik ten jest analogiczny do zdolności dyfuzyjnej, powszechnej miary klinicznej, która mierzy podstawową funkcję płuc, czyli ich zdolność do wymiany gazu. Zdolność dyfuzyjna jest jedynym pomiarem funkcjonalnym płuc, który można łatwo i szybko wykonać zarówno u myszy, jak i u ludzi. W przypadku wykrywania chorób płuc u myszy głównym celem jest ilościowe określenie zmian w czynności płuc między kohortami kon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żadnych konfliktów interesów i nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH HL-10342
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chromatograf gazowy | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent produkuje porównywalny model |
| 18 G Igła Luer Becton | Dickenson | Kilku innych możliwych sprzedawców | |
| Plastikowa strzykawka 3 ml | Becton Dickenson | Kilku innych możliwych dostawców | |
| Worki na próbki gazu polipropylenowego | Pojemność SKC 1 lub 2 L | dobrze sprawdzają się inne gazoszczelne worki | |
| Zbiornik gazu, 0,3% Ne, 0,3% CO, powietrze równoważące; (rozmiar ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | Jest to standardowa mieszanina stosowana do DLCO u ludzi |
| 25 TCID50 / myszy wirusa grypy A / PR8 rozcieńczonego w buforze fosforanowym soli fizjologicznej. | |||
| Elastaza trzustkowa wieprzowa | Produkty elastynowe, Owensville, MO | 5.4 | |
| U Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0,25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μ g/g masy ciała; O55: B5 | |
| Aspergillus fumigatus (izolat Af293) konidia zebrano z dojrzałych kolonii wyhodowanych na agarze z dekstrozą ziemniaczaną. |
Bibliografia
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299(2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
