Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

22K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52220

⸱

26 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Bosch Institute, University of Sydney, 2Motor Neuron Disease Research Group, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 3Advanced Microscopy Facility, Bosch Institute, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Streszczenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest dużą, cholinergiczną synapsą przekaźnikową, za pomocą której neurony ruchowe ssaków kontrolują dobrowolne skurcze mięśni. Zmiany strukturalne w NMJ mogą prowadzić do niewydolności neuroprzekaźnictwa, skutkującej osłabieniem, atrofią, a nawet śmiercią włókna mięśniowego. W wielu badaniach analizowano, w jaki sposób modyfikacje genetyczne lub choroba mogą zmienić strukturę myszy NMJ. Niestety, bezpośrednie porównanie wyników tych badań może być trudne, ponieważ często stosowano w nich różne parametry i metody analityczne. Opisano tutaj trzy protokoły. Pierwszy wykorzystuje obrazy konfokalne z projekcją o maksymalnej intensywności do pomiaru obszaru domen błony postsynaptycznej bogatych w receptor acetylocholiny (AChR) na płycie końcowej oraz obszaru barwienia pęcherzyków synaptycznych w leżącym nad nim presynaptycznym zakończeniu nerwowym. Drugi protokół porównuje względną intensywność barwienia immunologicznego białek synaptycznych w błonie postsynaptycznej. Trzeci protokół wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do wykrywania zmian w upakowaniu postsynaptycznych AChR na płytce końcowej. Protokoły zostały opracowane i dopracowane w ciągu szeregu badań. Omówiono czynniki wpływające na jakość i spójność wyników oraz przedstawiono dane normatywne dotyczące NMJ u zdrowych młodych dorosłych myszy.

Wprowadzenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest krytyczną synapsą przekaźnikową, która pośredniczy w komunikacji między układem nerwowym a mięśniami szkieletowymi. Jest ona wymagana dla każdego dobrowolnego przemieszczania się. Mikroskopia fluorescencyjna jest od dawna stosowana do badania wpływu transgenów na mysz NMJ 1-3 lub do porównywania wpływu wieku, diety, ćwiczeń i choroby na NMJ 4-11 gryzoni. Takie badania nauczyły nas wiele o fizjologii i patofizjologii NMJ, ale różnorodne zgłaszane parametry (np. obszar AChR, obszar płytki końcowej, długość obwodu, wskaźniki fragmentacji) często utrudniają porównanie wyników tych badań. Coraz częściej oczekuje się, że badacze przedkliniczni będą w stanie wykazać odtwarzalność, szczególnie w badaniach z wykorzystaniem modeli choroby u gryzoni 12. Opisane tutaj protokoły zostały udoskonalone poprzez serię badań, które badały rozwojowe, fizjologiczne i patofizjologiczne zmiany w NMJ. Takie badania wymagają pomiaru obszaru specjalizacji synaptycznych na końcówce motorycznej myszy oraz względnej gęstości upakowania białek synaptycznych w obrębie specjalizacji postsynaptycznych13-15.

Użyteczność tych metod jest zilustrowana ostatnimi badaniami na mysim modelu miastenii anty-MuSK. Codzienne wstrzykiwania IgG od pacjentów z miastenią anty-MuSK-dodatnią dorosłym myszom powodowały ich osłabienie w ciągu 2 tygodni. Konfokalne obrazy maksymalnej projekcji odcinków mięśni, które zostały podwójnie znakowane pod kątem synaptofizyny (w zakończeniach nerwowych) i postsynaptycznych AChR, ujawniły postępujący spadek w obszarze barwienia AChR jako pierwotną zmianę. Co ważne, tempo spadku było wystarczające do wyjaśnienia porównywalnych spadków amplitudy potencjałów synaptycznych, niewydolności transmisji synaptycznej i osłabienia mięśni 17,18. Jakościowo podobne wyniki zostały zgłoszone przez inne grupy badawcze 10,19. Od tego czasu te same metody pomiaru NMJ zostały wykorzystane do oceny wpływu trzech leków w leczeniu miastenii anty-MuSK w tym modelu mysim 20,21.

Siedzący tryb starzenia się może prowadzić do utraty połączeń nerwowo-mięśniowych. Opisane tutaj protokoły ujawniły związany z wiekiem spadek w obszarze synaptofizyny zakończeń nerwowych na końcach motorycznych w miarę postępu myszy w starszym wieku. Te same metody ujawniły, że dobrowolne ćwiczenia mogą w dużej mierze zapobiec zmniejszeniu obszaru zakończenia nerwu presynaptycznego 22, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami innych grup 4. Utrata połączeń nerwowo-mięśniowych występuje również w SOD1G93A mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego 9,23.

Badania wspomniane powyżej pokazują, że różnorodność schorzeń może prowadzić do zmniejszenia w obszarze specjalizacji pre- lub postsynaptycznych w NMJ. Może to prowadzić do upośledzenia funkcji synaps lub może zwiastować całkowitą utratę połączenia nerwowo-mięśniowego. Opisano trzy protokoły, które pozwalają na ilościowe określenie obszaru i gęstości specjalizacji synaptycznych. Celem pierwszego protokołu jest zapewnienie praktycznego i powtarzalnego pomiaru obszarów specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz ich wyrównania w NMJ ssaków, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dwuwymiarowe obrazy konfokalne z maksymalną projekcją i analiza obrazu za pomocą NIH ImageJ służą do wykrywania zmian w obszarze barwienia synaptofizyny (pęcherzyki synaptyczne), postsynaptycznych AChR i obszaru nakładania się synaptycznego. Parametry obrazowania konfokalnego (wzmocnienie i poziom przesunięcia) są optymalizowane dla każdego NMJ tak, aby zmaksymalizować informacje wizualne wykorzystywane do rozpoznania obszaru specjalizacji synaptycznej. Niewydolność nerwowo-mięśniowa może również wynikać ze zmian gęstości postsynaptycznego AChR i/lub innych białek synaptycznych. Drugi protokół można zastosować do wykrywania zmian we względnej gęstości białek postsynaptycznych, takich jak MuSK, rapsyn, dystroglikan, fosforylowana kinaza Src i fosforylowana AChR 18,21.

W miastenii, zmniejszona gęstość AChR w błonie postsynaptycznej jest bezpośrednią przyczyną niewydolności synaptycznej i osłabienia mięśni. Trzeci protokół opisuje metodę transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do oceny zmian w pobliżu sąsiednich AChR w błonach postsynaptycznych 14,15. Ta metoda wykrywa transfer energii między sąsiednimi AChR znakowanymi fluorescencyjną α-bungarotoksyną (BGT). FRET występuje tylko wtedy, gdy fluorescencyjne sondy donorowe i akceptorowe są oddalone od siebie o mniej niż 10 nm. Może to ujawnić (submikroskopijne) zmiany w szczelności upakowania AChR, które mogą bezpośrednio odnosić się do amplitudy potencjałów synaptycznych.

Te trzy protokoły, udoskonalone w ciągu ostatniej dekady, dostarczają komplementarnych miar integralności NMJ w spójny i powtarzalny sposób. Stosowanie znormalizowanych protokołów i parametrów powinno ułatwić porównanie wpływu genów i interwencji środowiskowych na NMJ ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Projektowanie, przeprowadzanie i raportowanie eksperymentów na zwierzętach powinno uwzględniać aktualne wytyczne 24. Takie prace muszą zostać wcześniej zatwierdzone przez lokalny organ ds. dobrostanu zwierząt (w naszym przypadku przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Sydney).

1. Eutanazja zwierzęcia i wypreparowanie mięśnia

  1. Przenieś mysz z pomieszczenia utrzymaniowego do osobnego pomieszczenia, gdzie zostanie poddana eutanazji poprzez dostrzewalny wstrząs doprzewnowy roztworu pentobarbitalu (30 mg/kg), stosując metodę obchodzenia się z myszami opisaną przez Shimizu 25. Umieść mysz z powrotem w klatce.
  2. Gdy oddech myszy ustanie na ponad 1 min, sprawdź odruch cofania łapy, delikatnie ściskając stopę, oraz odruch rogówkowy, lekko muskając rogówkę. Dopiero po zaniku odpowiedzi odruchowych można przygotować mysz do sekcji.
  3. Przed przystąpieniem do sekcji interesującego mięśnia skorzystaj z atlasu anatomii gryzoni, np. Chiasson 26, i/lub poproś o pomoc doświadczonego anatoma. W każdym przypadku usuń włosy z nadlegającej skóry za pomocą małej maszynki elektrycznej przed rozcięciem skóry w celu odsłonięcia mięśnia.
    UWAGA: Sposób sekcji będzie się różnić dla każdego anatomicznie odrębnego mięśnia.
  4. Używając pęsety tępej, uwolnij mięsień z nadlegających błon i okolicznych tkanek. Chwyć i przetnij ścięgno dystalne, aby oddzielić mięsień od jego przyczepu.
  5. Delikatnie odseparuj i przetnij mięsień od otaczających go tkanek aż do jego początku. Przed dalszą obróbką umieść nowo wypreparowany mięsień na krótko w 0.1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) lub w roztworze Ringera.

2. Przygotowanie mięśnia do kriofragmentacji

UWAGA: Optymalną konserwację struktury można osiągnąć poprzez perfuzję całego zwierzęcia, zgodnie z wcześniej szczegółowymi opisami 27, lub poprzez fiksację przez zanurzenie (w przypadku małych mięśni), jak opisano w opcjonalnym kroku 2.1. Należy jednak pamiętać, że fiksacja 4% paraformaldehydem może upośledzić późniejsze barwienie wieloma przeciwciałami oraz fluorescencyjnym BGT. Należy szczególnie unikać glutaraldehydu. Jeśli mięśnie nie mają być utrwalane, muszą zostać natychmiast zamrożone szokowo (nale należy przejść do punktu 2.3).

  1. Opcjonalna fiksacja przez imersję: Przypnij mięsień do wosku w szalce Petriego w pozycji spoczynkowej. Przykryj mięsień 2% w/v paraformaldehydem (świeżo rozpuszczonym w PBS) na 2 hr w RT. Przemyj go, zmieniając PBS 3 razy w ciągu 30 min (3 x 10 min), a następnie zastąp PBS 30% w/v sacharozą w PBS i inkubuj O/N w 4 °C.
  2. Przygotuj wcześniej formy („łódeczki”), składając kawałki folii aluminiowej o wymiarach 2 cm x 1.5 cm, jak pokazano na Rysunku 1. Umieść kawałek membrany nitrocelulozowej na dnie łódeczki. Ostrożnie wlej do łódeczki macierz do zatapiania w kriotomacie (tabela Materiały) do głębokości 2 mm, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieść mięsień w łódeczce, wyrównując go względem linii narysowanych długopisem na nitrocelulozie. Dodaj więcej macierzy do zatapiania, aby całkowicie przykryć mięsień (Rysunek 1).
  3. Oznacz wcześniej probówki z polipropylenu niezmywalnym markerem. Wlej do każdej probówki kroplę wody i schłodź probówkę w ciekłym azotcie.
    UWAGA: Zamrożona kropla wody utrzymuje ciśnienie par i zapobiega wysychaniu podczas długotrwałego przechowywania w -80 °C
  4. Używając przyłbicy, grubych rękawic ochronnych i dużych pęset tępych, częściowo zanurz mały metalowy zlew (średnica 3 cm, głębokość 8 cm) zawierający izopentan o głębokości 2 cm w pojemniku z ciekłym azotem na 30 sec. Wyjmij zlew i postaw go na blacie. Używając mniejszej pęsety tępej, umieść formę zawierającą mięsień i macierz do zatapiania w schłodzonym izopentanie. Należy uważać, aby ciekły azot nie zmieszał się z izopentanem.
  5. Odczekaj 2 min, aż blok całkowicie zamarznie, a następnie za pomocą pęsety tępej wyjmij zamrożony blok i szczelnie zamknij go w odpowiedniej, wcześniej oznaczonej i schłodzonej probówce (krok 2.3).
  6. Przechowuj probówki tymczasowo w ciekłym azocie przed przeniesieniem do -80 °C. Wpisz wszystkie próbki do arkusza zawartości zamrażarki.

3. Kriosekcjonowanie i barwienie fluorescencyjne w celu uzyskania obrazów en face złączy neuromięśniowych (NMJs)

  1. Zdejmij formę aluminiową. W komorze kriostatu o temperaturze -20 °C przymocuj zamrożony blok do uchwytu kriostatu, aby wykonać kriosekcje o grubości 20 μm równolegle do długiej osi włókien mięśniowych (Rycina 1). Przenieś sekcje na szkiełka przedmiotowe powleczone poli-L-lizyną lub żelatyną.
  2. UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli tkanka została utrwalona przed zamrożeniem. Po odczekaniu 30 min do wyschnięcia sekcji na szkiełkach, utrwal je, nakładając kroplę 2% paraformaldehydu w PBS na każdą sekcję na 15 min w RT.
  3. Przemyj szkiełka 3 x 10 min w PBS w naczyniu Copliina, a następnie zanurz szkiełka w PBS zawierającym 0,1 M glicyny na 30 min, aby zablokować pozostałe grupy aldehydowe.
  4. Przemyj szkiełka przez 10 min w PBS, a następnie zanurz w metanolu (schłodzonym do -20 ºC) na 7 min. Ten etap permeabilizacji jest rutynową częścią podwójnego znakowania fluorescencyjnym-BGT i przeciwciałem anty-synaptofizyna, ale może niekorzystnie wpływać na immunostaining niektórych innych białek.
  5. Przemyj szkiełka 2 x 10 min w PBS, a następnie umieść każde szkiełko w stabilnej i wypoziomowanej komorze nawilżającej. Natychmiast pokryj każdą sekcję 20 µl roztworu blokującego (0,2% Triton X-100, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) na 1 h w RT. Sekcje nie mogą wyschnąć na żadnym etapie procesu immunostainingu.
  6. Przeprowadź inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym: Biorąc po jednym szkiełku, ostrożnie usuń nadmiar roztworu blokującego z każdej sekcji i zastąp go 20 µl przeciwciała króliczego anty-synaptofizyna (rozcieńczonego 1:200 w roztworze blokującym).
  7. Uwzględnij szkiełko kontrolne negatywne, które będzie inkubowane wyłącznie z roztworem blokującym. Ta „kontrola bez przeciwciała pierwszorzędowego” jest niezbędna w każdym cyklu immunostainingu.
  8. Upewniając się, że przeciwciało pierwszorzędowe pozostaje na każdej sekcji, zamknij komorę nawilżającą i inkubuj przez 1-2 dni w 4 ºC.
  9. Obejrzyj każdą sekcję, aby potwierdzić, że przeciwciało pierwszorzędowe nadal znajduje się na miejscu. Użyj pipety Pasteura, aby delikatnie przepłukać każde szkiełko PBS i umieścić je w naczyniu Copliina. Przemyj wszystkie szkiełka 3 x 10 min w PBS.
  10. Przeprowadź inkubację z przeciwciałem drugorzędowym. Biorąc po jednym szkiełku, ostrożnie usuń nadmiar PBS, połóż je w komorze nawilżającej i pokryj każdą sekcję 20 µl mieszaniny zawierającej koniugowane z FITC przeciwciała osiołkowe anty-królicze IgG oraz BGT skoniugowany z tetrametylo-rhodaminą lub innym czerwonym fluoroforem (TRITC-/redBGT; 5 g/ml) rozcieńczonym w roztworze blokującym. Inkubuj w RT przez 2 h.
  11. Przemyj szkiełka 3 x 10 min w PBS w naczyniach Copliina.
  12. Biorąc po jednym szkiełku, ostrożnie usuń nadmiar PBS i przykryj szkiełko nakrywekciem, używając minimalnej ilości glicerolowego, odpornego na zanikanie fluorescencji medium montażowego. Uszczelnij brzegi nakrywek bezbarwnym lakierem do paznokci. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
  13. Przechowuj szkiełka w ciemności w 4 ºC do jednego tygodnia lub w -20 ºC w przypadku dłuższego przechowywania (do kilku miesięcy).

4. Niestronniczy pobór próbek i obrazowanie en face płyt końcowych motorycznych

  1. Zastosuj metodę ślepej próby, etykietując każdy preparat losowym numerem kodowym, który pozostaje znany jedynie drugiemu badaczowi (niezaangażowanemu w analizę). Dzięki temu operator nie zna przypisania grup badawczych aż do momentu zakończenia kwantyfikacji parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
  2. Umieść preparat na stoliku mikroskopu i obserwuj go przy oświetleniu szerokopolowym z zestawem filtrów TRITC (obiektyw 63X olej, 1.3 N.A.). Przesuwaj preparat stopniowo (pole po polu) od lewej do prawej i z powrotem, aż w polu widzenia pojawi się blaszka końcowa (Rysunek 2A).
    UWAGA: Kryterium doboru próbek: Każda struktura barwiona na AChR, która jest stosunkowo płaska i skierowana w stronę obiektywu (t.j. rozciąga się <15 m w wymiarze z), jest uznawana za blaszkę końcową i obrazowana do analizy (półksiężycowate barwienie AChR reprezentuje przekroje poprzeczne przez blaszki końcowe i zostaje zatem wykluczone).
  3. Przy ustawieniu pinhole konfokalny na 1.0 jednostki Airy i niskiej mocy lasera zoptymalizuj poziomy wzmocnienia (gain) i offsetu dla TRITC/czerwonego-BGT (laser 532 nm) na blaszce końcowej, która ma zostać obrazowana. Następnie zoptymalizuj fluorescencję FITC/synaptofizyny, używając lasera 488 nm. Wykonaj stos z-stack blaszki końcowej z interwałem 0.7 μm między poszczególnymi przekrojami optycznymi. Zapisz obrazy w plikach, których nazwa zawiera datę sesji obrazowania, kod preparatu oraz numer blaszki końcowej.
    UWAGA: Skanowanie z użyciem laserów 488 nm i 532 nm (FITC i TRITC) powinno być przeprowadzane sekwencyjnie (nie jednocześnie), aby uniknąć zanieczyszczenia kanału FITC fluorescencją z czerwonego fluoroforu i odwrotnie (tzw. bleed-through).
  4. Powtarzaj etapy doboru i obrazowania 4.2-4.3, aż z preparatu/próbki zostanie zebranych 20 blaszek końcowych.
  5. Przejdź do następnego kodowanego preparatu i powtórz etapy 4.2-4.4. Powtórz tę czynność dla każdego z kodowanych preparatów.
  6. Wykonaj kilka obrazów blaszek końcowych z preparatu kontrolnego (kontrola bez przeciwciał pierwotnych), używając ustawień konfokalnych, które uznano za optymalne dla preparatów badawczych (kanał fluorescencji FITC powinien pozostać ciemny).
  7. Po zakończeniu sesji konfokalnej przenieś pliki obrazów na inny komputer i wykonaj kopię zapasową oryginalnych plików na dysku zewnętrznym lub serwerze.

5. Pomiar powierzchni specjalizacji synaptycznych na obrazach en face

  1. Użyj darmowego oprogramowania NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), aby przygotować obrazy maksymalnej projekcji (MIP) z każdego stosu z. Zapisz je jako pliki tiff (Rycina 2A i B). Nazwy plików powinny zawierać datę sesji obrazowania, kod próbki, numer płytki końcowej oraz kanał fluorescencyjny (np. 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. Otwórz obraz projekcji z w programie ImageJ. Wybierz kanał obrazu receptora acetylocholiny (Rycina 3A) i wybierz: Image > Type > 8-bit, aby przekonwertować 24-bitowy kolorowy obraz RGB na trzy 8-bitowe obrazy w skali szarości na ekranie.
  3. Za pomocą narzędzia wielokąta (polygon tool) w ImageJ narysuj przybliżony obrys wokół interesującej płytki końcowej w kanale barwionym redBGT (ACHR), tak aby objąć wszystkie widoczne obszary barwienia konkretnej, pojedynczej płytki końcowej, wykluczając jednocześnie wszelkie barwienie, które nie pochodzi z analizowanej płytki (Rycina 3C).
  4. Zastosuj minimalny próg intensywności do obrazu, wybierając: Image > Adjust > Threshold (Rycina 3E oraz powiązane zrzuty ekranu z ImageJ).
  5. Dostosuj poziom progu tak, aby odizolować części zabarwione AChR, wykluczając sygnał tła jako wartości poniżej progu (Rycina 3E). Aby ułatwić decyzję dotyczącą wartości progu, otwórz drugie okno z oryginalnym obrazem (o ciągłym tonie) bezpośrednio obok okna roboczego w celu porównania. Zapisz wartość progu do późniejszego wykorzystania w analizach kolokalizacji.
  6. Zachowując obrys wielokąta wokół płytki końcowej, wybierz: Analyze > Analyze Particles. W menu wyskakującym określ zakres rozmiarów jako: od 50 do nieskończoności pikseli (eliminuje to drobne artefakty wynikające z szumu elektrycznego w fotopowielaczu).
  7. Polecenie Analyze Particles generuje okno z listą dyskretnych obszarów powyżej progu oraz wartościami ich intensywności fluorescencji, ponumerowanych zgodnie z ich występowaniem na obrazie binarnym (Rycina 3G oraz powiązany zrzut ekranu z ImageJ). Skopiuj te dane do opisanego arkusza kalkulacyjnego.
  8. Zmierz całkowitą powierzchnię płytki końcowej (obszar wewnątrz wielokąta), wybierając: Analyze > Measure. Pozwala to uzyskać całkowitą powierzchnię płytki końcowej. Skopiuj i wklej dane dotyczące powierzchni i intensywności AChR do arkusza, pamiętając o odpowiednim nazwaniu kolumn; wiersze będą służyć dla poszczególnych płytek końcowych na konkretnych preparatach.
  9. Przełącz się na kanał fluorescencji anty-synaptofizyny i powtórz kroki 5.1–5.5, ale dla kanału FITC (Rycina 3B, D i F). Celem jest dostosowanie progu tak, aby utworzyć obraz binarny, który jak najdokładniej odpowiada granicom barwienia dostrzegalnym gołym okiem. Zapisz wartość progu.
  10. Zmierz powierzchnię pokrycia, wykonując następujące kroki: otwórz oryginalny plik zawierający obrazy z dwóch kanałów i rozdziel go na dwa osobne obrazy, wybierając: Image > Stacks > Stack to Images.
  11. Używając wtyczki Colocalization (pobranej i zainstalowanej ze strony ImageJ), wybierz: Pluggin > Colocalization i wprowadź wcześniej zapisane wartości progowe dla kanałów AChR i nerwowego do odpowiednich pól zapytania kanałów. Pozwoli to uzyskać obraz pokrycia w białych pikselach (Rycina 3H oraz powiązane zrzuty ekranu z ImageJ).
  12. Konwertuj nowo utworzony obraz pokrycia na format skali szarości i zastosuj próg dla wartości maksymalnej. Próg maksymalny wybierze tylko białe piksele, odpowiadające obszarowi pokrycia dwóch poprzednich kanałów. Zapisz w arkuszu wynikową wartość powierzchni „kolokalizacji”, która reprezentuje obszar pokrycia w pikselach.
  13. Przygotuj arkusz z wartościami średnimi próbek, oblicz i przedstaw odchylenia standardowe oraz błędy standardowe w formie histogramów lub wykresów punktowych 20,22. Należy pamiętać, że wartość n zazwyczaj reprezentuje liczbę myszy w grupie próbnej na potrzeby statystyczne.
  14. Przedstaw powierzchnie AChR płytek końcowych na wykresach punktowych lub histogramach częstości, aby ustalić, czy dane mają rozkład normalny przed przeprowadzeniem testów statystycznych (Rycina 6).

6. Porównanie względnych intensywności barwienia z wykorzystaniem poprzecznych przekrojów optycznych

UWAGA: W przypadku tego protokołu wszystkie próbki mięśni należy przetwarzać jednocześnie i obrazować podczas jednej sesji konfokalnej. Planując eksperyment, należy przewidzieć do 30 min czasu obrazowania dla każdej próbki mięśnia.

  1. Wyciąć krioprzekroje o grubości 15 µm prostopadle do długiej osi włókien mięśniowych i zebrać je na szkiełkach zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  2. Przeprowadzić barwienie fluorescencyjne zgodnie z opisem w krokach 3.2-3.13.
  3. Oznakować zabarwione szkiełka w taki sposób, aby obrazowanie i analizy były wykonywane przez operatora w sposób zaślepiony względem grupy badawczej, zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  4. Używając obiektywu fluorescencyjnego 40X (N.A. 0.75), krótko przejrzeć przekrój z każdego szkiełka, aby ustalić pojedyncze ustawienie wzmocnienia (gain) i poziomu przesunięcia (offset) dla AChR, które będzie odpowiednie dla wszystkich płyt końcowych we wszystkich szkiełkach z próbkami. Najjaśniejsza płyta końcowa powinna znajdować się tuż poniżej wartości 256 w skali szarości. Optymalizację tę należy przeprowadzić oddzielnie dla drugiego kanału fluorescencji (zbieranego sukcesywnie). Zapisać stałe ustawienia wzmocnienia i poziomu przesunięcia i nie zmieniać ich podczas całej sesji obrazowania.
  5. Na początku i na końcu sesji konfokalnej zebrać obrazy szkiełka ze standardem fluorescencji (np. nieblaknących kulek fluorescencyjnych), używając tych samych parametrów, w celu wykrycia ewentualnych wahań natężenia lasera.
  6. Użyć kanału AChR do stopniowego skanowania szkiełka w celu zlokalizowania płyt końcowych.
  7. Ustawić ostrość, aby znaleźć w każdym polu mikroskopowym pojedynczą płaszczyznę przekroju optycznego, która zawiera największą liczbę płyt końcowych zabarwionych na AChR.
  8. Zeskanować ten pojedynczy przekrój optyczny dwukrotnie i zapisać obraz uśredniony (Rycyna 4G).
  9. Zachowując tę samą płaszczyznę ogniskowania, przełączyć na drugi kanał fluorescencji (białko zainteresowania) i zebrać obraz zgodnie z krokiem 6.8. Zapisać plik obrazu, zawierając w nazwie pliku: datę sesji obrazowania, kod próbki, numer obrazu oraz symbol wskazujący kanał fluorescencyjny. Rycina 4A-F przedstawia przykłady rozmieszczenia AChR w płytach końcowych w porównaniu do rapsyny, MuSK lub dystroglikanu (-DG).
  10. Przesunąć stolik do następnego pola zawierającego jedną lub więcej płyt końcowych i powtórzyć kroki 6.8-6.9. Powtarzać czynność do momentu obrazowania łącznie 60 płyt końcowych.
  11. Po zakończeniu sesji obrazowania przenieść wszystkie pliki na inny komputer i wykonać kopię zapasową.
  12. Otworzyć każdy oryginalny plik obrazu i podczas przeglądania kanału AChR wybrać: Image > Stacks > Stack to Images, aby rozdzielić kanały.
  13. Wybrać: Image > Type > 8bit, aby przekonwertować obraz na ekranie na 8-bitowy format skali szarości. Wykonać to dla obu kanałów fluorescencji.
  14. Wybrać: Image > Stacks > Images to Stack. Otworzyć nowy stos z dwóch wcześniej rozdzielonych obrazów 8-bitowych. Pozwala to na wygodne przełączanie się między dwoma kanałami fluorescencji w jednym oknie.
  15. Użyć narzędzia wielokąta (polygon tool), aby narysować linię ściśle przylegającą do granicy zabarwienia AChR (Rycina 4I).
  16. Wybrać: Analyze > Measure, aby zmierzyć średnie natężenie pikseli dla AChR wewnątrz zamkniętego obszaru (należy zwrócić uwagę na precyzyjne narysowanie linii). Skopiować tę wartość do opisanego arkusza kalkulacyjnego.
  17. Zachowując ten sam obrys wielokąta (w celu zdefiniowania mierzonego obszaru), przełączyć na drugi kanał fluorescencji (np. Rycina 4B, D, F) i wybrać: Analyze > measure. Pozwoli to uzyskać średnie natężenie zabarwienia białka zainteresowania w obszarze synaptycznym zdefiniowanym przez zabarwienie AChR.
  18. Wybrać obszar oddalony od widocznego zabarwienia płyt końcowych, a następnie wybrać: Analyze > Measure, aby zmierzyć średnie natężenie fluorescencji tła. Powtórzyć to dla pozostałych kanałów fluorescencji i skopiować wartości tła do arkusza z wartościami fluorescencji.
  19. Odejmować średnie wartości tła od wartości płyt końcowych, aby uzyskać skorygowane natężenia dla AChR i białka zainteresowania dla każdej płyty końcowej.
  20. Podzielić skorygowane wartości natężenia płyt końcowych dla białka zainteresowania przez skorygowane natężenie fluorescencji tła (BGT), aby uzyskać stosunki natężeń fluorescencji 14,21.

7. Porównanie gęstości AChR błony postsynaptycznej przy użyciu FRET

UWAGA: Niniejszy protokół ocenia stopień, w jakim AChR są gęsto upakowane (odległość <10 nm) w błonie postsynaptycznej. Precyzyjny dobór kombinacji fluoroforów donora i akceptora jest kluczowy dla tego testu FRET. Nazwy i szczegóły dotyczące fluoroforów podano w tabeli Materiały. Ich właściwości widmowe w kontekście FRET omówiono w naszych poprzednich pracach 14,15.

  1. Przygotować utrwalone poprzeczne krioprzekroje zgodnie z opisem w sekcji 6.1. Wszystkie grupy próbek muszą być przetwarzane wspólnie i obrazowane podczas tej samej sesji konfokalnej.
  2. Dokładnie wymieszać 2,5 g/ml red-BGT (donor FRET) z 10 g/ml far red-BGT (akceptor FRET) w roztworze blokującym w małej plastikowej probówce, pipetując roztwór w górę i w dół 12 razy. Ta mieszanina w stosunku molowym 1:4 maksymalizuje wydajność FRET 14.
  3. Umieścić każdy preparat w komorze nawilżanej, ostrożnie pokryć każdy przekrój kroplą (12 µl) powyższej mieszaniny i inkubować przez 1,5 hr w RT.
  4. Przekroje kontrolne: pokryć niewielką liczbę przekrojów roztworem 2,5 g/ml red-BGT (tylko donor; oznaczone jako kontrole C1) oraz niektóre przekroje roztworem 10 g/ml far-red-BGT (tylko akceptor; oznaczone jako kontrole C2). Inkubować te kontrole zgodnie z krokiem 7.3.
  5. Przemyć preparaty 3 x 10 min w PBS i zamontować w glicerolowym, odpornym na blaknięcie medium montażowym (patrz krok 3.12).
  6. Przeprowadzić próbkowanie płytek końcowych zgodnie z krokiem 6.7. Fluorescencja donora i akceptora powinna być idealnie współlokalizowana w płytkach końcowych ze względu na losowe wiązanie fluorescencyjnych cząsteczek BGT.
  7. Obrazy kontrolne: korzystając z obiektywu 40X i niskiej mocy lasera, zoptymalizować ustawienia wzmocnienia (gain) i poziomu offsetu dla redBGT w płytkach końcowych z preparatu kontrolnego C1. Zoptymalizować poziomy wzmocnienia i offsetu dla far-redBGT w płytkach końcowych z preparatu kontrolnego C2. Potwierdzić brak jakiegokolwiek przenikania fluorescencji (bleed-through).
  8. Bez zmiany mocy lasera oraz ustawień wzmocnienia i poziomu offsetu, przejść do preparatów doświadczalnych i zebrać obrazy (przed fotowybielaniem) dla obu kanałów fluorescencji.
  9. Selektywnie fotowybielić far-red-BGT w części pojedynczej płytki końcowej, powiększając obszar skanowania, a następnie skanując 10 razy laserem 633 nm przy 100% mocy. Fluorescencja w skanowanym obszarze powinna stać się słaba.
  10. Zresetować moc lasera oraz powiększenie i zebrać obrazy po wybielaniu w obu kanałach fluorescencyjnych, korzystając z ustawień konfokalnych ustalonych w punkcie 7.7.
  11. Obliczyć wydajność FRET (E) na podstawie procentowego wzrostu fluorescencji donora (red-BGT) po fotowybielaniu akceptora (far-red-BGT) zgodnie z następującym wzorem*:
    Wzór na powrót fluorescencji po fotowybielaniu, równanie analizy danych eksperymentalnych.
    *Dla wszystkich sytuacji, w których fluorescencja donora wzrasta po fotowybielaniu akceptora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiar powierzchni synaptycznej w NMJ

Każda ocena powierzchni opiera się na wyznaczeniu granicy definiującej zasięg specjalizacji synaptycznych. W obrazach NMJ z mięśni zdrowych młodych osobników dorosłych powinny być widoczne wyraźne granice barwienia zarówno dla AChR, jak i synaptofizyny (Ryc. 2A i B). Intensywność fluorescencji dla AChR i synaptofizyny gwałtownie rośnie na granicy między częścią perysynaptyczną a synaptyczną płytki końcowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj protokoły umożliwiły nam wiarygodny pomiar i ilościowe określenie zmian właściwości NMJ w różnych warunkach, w tym w normalnych stanach starzenia się i chorobowych. Metody opisane dla obrazów NMJ en face pozwolą naukowcom porównać obszar specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz obszar nakładania się/wyrównania synaptycznego. Aby porównać względną intensywność białek pre- i postsynaptycznych, preferowany jest drugi protokół, który wykorzystuje poprzeczne przekroje optyczne. Trzeci protokół w szczególności...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych [570930]. Obrazowanie przeprowadzono w Zakładzie Mikroskopii Zaawansowanej Instytutu Bosch. Byłym członkom laboratorium, których prace są cytowane, dziękuje się za ich wkład w rozwój tych metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaDM 2000 z  System TCS SP2Większość skaningowych mikroskopów konfokalnych powinna być odpowiednia. 
ZeissLSM 510 Meta 
LeicaSPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)Life technologiesB35451Używany do oznaczania AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT)Life technologiesB35450Daleka czerwona fluorescencja: ledwo widoczna przez okular 
królicza antysynaptofizynaTechnologie życiowe18-0130Różne partie przeciwciała pierwszorzędowego różnią się skutecznym rozcieńczeniem roboczym
FITC-anty-rapsyn mab1234MiliporeFCMAB134FPrzeciwciało monoklonalne sprzężone z FITC
FITC-osioł anty-królik IgGJackson711-095-152Poliklonalne przeciwciała drugorzędowe mogą różnić się jakością w zależności od źródła i partii
Mieszanka o optymalnej temperaturze skrawania (O.T.C.)ProSciTechIA018Matryca do zatapiania kriostatu do zamrażania  mięśni
DABCOSigma10981Pożywka montażowa, która spowalnia fotowybielanie fluoroforów

Bibliografia

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663(2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640(2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970(2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412(2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840(2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnaPomiar wielko ci synapsTransfer energii rezonansowej fluorescencjiProjekcja maksymalnej intensywno ciBarwienie receptor w acetylocholinyKolokalizacja synaptofizynyAnaliza w programie Image JAnaliza z cza nerwowo mi niowego myszy
Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.