Artykuł metodologiczny

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/52220

⸱

26 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Bosch Institute, University of Sydney, 2Motor Neuron Disease Research Group, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 3Advanced Microscopy Facility, Bosch Institute, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest dużą, cholinergiczną synapsą przekaźnikową, za pomocą której neurony ruchowe ssaków kontrolują dobrowolne skurcze mięśni. Zmiany strukturalne w NMJ mogą prowadzić do niewydolności neuroprzekaźnictwa, skutkującej osłabieniem, atrofią, a nawet śmiercią włókna mięśniowego. W wielu badaniach analizowano, w jaki sposób modyfikacje genetyczne lub choroba mogą zmienić strukturę myszy NMJ. Niestety, bezpośrednie porównanie wyników tych badań może być trudne, ponieważ często stosowano w nich różne parametry i metody analityczne. Opisano tutaj trzy protokoły. Pierwszy wykorzystuje obrazy konfokalne z projekcją o maksymalnej intensywności do pomiaru obszaru domen błony postsynaptycznej bogatych w receptor acetylocholiny (AChR) na płycie końcowej oraz obszaru barwienia pęcherzyków synaptycznych w leżącym nad nim presynaptycznym zakończeniu nerwowym. Drugi protokół porównuje względną intensywność barwienia immunologicznego białek synaptycznych w błonie postsynaptycznej. Trzeci protokół wykorzystuje transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do wykrywania zmian w upakowaniu postsynaptycznych AChR na płytce końcowej. Protokoły zostały opracowane i dopracowane w ciągu szeregu badań. Omówiono czynniki wpływające na jakość i spójność wyników oraz przedstawiono dane normatywne dotyczące NMJ u zdrowych młodych dorosłych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest krytyczną synapsą przekaźnikową, która pośredniczy w komunikacji między układem nerwowym a mięśniami szkieletowymi. Jest ona wymagana dla każdego dobrowolnego przemieszczania się. Mikroskopia fluorescencyjna jest od dawna stosowana do badania wpływu transgenów na mysz NMJ 1-3 lub do porównywania wpływu wieku, diety, ćwiczeń i choroby na NMJ 4-11 gryzoni. Takie badania nauczyły nas wiele o fizjologii i patofizjologii NMJ, ale różnorodne zgłaszane parametry (np. obszar AChR, obszar płytki końcowej, długość obwodu, wskaźniki fragmentacji) często utrudniają porównanie wyników tych badań. Coraz częściej oczekuje się, że badacze przedkliniczni będą w stanie wykazać odtwarzalność, szczególnie w badaniach z wykorzystaniem modeli choroby u gryzoni 12. Opisane tutaj protokoły zostały udoskonalone poprzez serię badań, które badały rozwojowe, fizjologiczne i patofizjologiczne zmiany w NMJ. Takie badania wymagają pomiaru obszaru specjalizacji synaptycznych na końcówce motorycznej myszy oraz względnej gęstości upakowania białek synaptycznych w obrębie specjalizacji postsynaptycznych13-15.

Użyteczność tych metod jest zilustrowana ostatnimi badaniami na mysim modelu miastenii anty-MuSK. Codzienne wstrzykiwania IgG od pacjentów z miastenią anty-MuSK-dodatnią dorosłym myszom powodowały ich osłabienie w ciągu 2 tygodni. Konfokalne obrazy maksymalnej projekcji odcinków mięśni, które zostały podwójnie znakowane pod kątem synaptofizyny (w zakończeniach nerwowych) i postsynaptycznych AChR, ujawniły postępujący spadek w obszarze barwienia AChR jako pierwotną zmianę. Co ważne, tempo spadku było wystarczające do wyjaśnienia porównywalnych spadków amplitudy potencjałów synaptycznych, niewydolności transmisji synaptycznej i osłabienia mięśni 17,18. Jakościowo podobne wyniki zostały zgłoszone przez inne grupy badawcze 10,19. Od tego czasu te same metody pomiaru NMJ zostały wykorzystane do oceny wpływu trzech leków w leczeniu miastenii anty-MuSK w tym modelu mysim 20,21.

Siedzący tryb starzenia się może prowadzić do utraty połączeń nerwowo-mięśniowych. Opisane tutaj protokoły ujawniły związany z wiekiem spadek w obszarze synaptofizyny zakończeń nerwowych na końcach motorycznych w miarę postępu myszy w starszym wieku. Te same metody ujawniły, że dobrowolne ćwiczenia mogą w dużej mierze zapobiec zmniejszeniu obszaru zakończenia nerwu presynaptycznego 22, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami innych grup 4. Utrata połączeń nerwowo-mięśniowych występuje również w SOD1G93A mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego 9,23.

Badania wspomniane powyżej pokazują, że różnorodność schorzeń może prowadzić do zmniejszenia w obszarze specjalizacji pre- lub postsynaptycznych w NMJ. Może to prowadzić do upośledzenia funkcji synaps lub może zwiastować całkowitą utratę połączenia nerwowo-mięśniowego. Opisano trzy protokoły, które pozwalają na ilościowe określenie obszaru i gęstości specjalizacji synaptycznych. Celem pierwszego protokołu jest zapewnienie praktycznego i powtarzalnego pomiaru obszarów specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz ich wyrównania w NMJ ssaków, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dwuwymiarowe obrazy konfokalne z maksymalną projekcją i analiza obrazu za pomocą NIH ImageJ służą do wykrywania zmian w obszarze barwienia synaptofizyny (pęcherzyki synaptyczne), postsynaptycznych AChR i obszaru nakładania się synaptycznego. Parametry obrazowania konfokalnego (wzmocnienie i poziom przesunięcia) są optymalizowane dla każdego NMJ tak, aby zmaksymalizować informacje wizualne wykorzystywane do rozpoznania obszaru specjalizacji synaptycznej. Niewydolność nerwowo-mięśniowa może również wynikać ze zmian gęstości postsynaptycznego AChR i/lub innych białek synaptycznych. Drugi protokół można zastosować do wykrywania zmian we względnej gęstości białek postsynaptycznych, takich jak MuSK, rapsyn, dystroglikan, fosforylowana kinaza Src i fosforylowana AChR 18,21.

W miastenii, zmniejszona gęstość AChR w błonie postsynaptycznej jest bezpośrednią przyczyną niewydolności synaptycznej i osłabienia mięśni. Trzeci protokół opisuje metodę transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do oceny zmian w pobliżu sąsiednich AChR w błonach postsynaptycznych 14,15. Ta metoda wykrywa transfer energii między sąsiednimi AChR znakowanymi fluorescencyjną α-bungarotoksyną (BGT). FRET występuje tylko wtedy, gdy fluorescencyjne sondy donorowe i akceptorowe są oddalone od siebie o mniej niż 10 nm. Może to ujawnić (submikroskopijne) zmiany w szczelności upakowania AChR, które mogą bezpośrednio odnosić się do amplitudy potencjałów synaptycznych.

Te trzy protokoły, udoskonalone w ciągu ostatniej dekady, dostarczają komplementarnych miar integralności NMJ w spójny i powtarzalny sposób. Stosowanie znormalizowanych protokołów i parametrów powinno ułatwić porównanie wpływu genów i interwencji środowiskowych na NMJ ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Projektowanie, prowadzenie i składanie sprawozdań z doświadczeń na zwierzętach powinno uwzględniać aktualne wytyczne 24. Takie prace muszą być wcześniej zatwierdzone przez lokalny organ ds. dobrostanu zwierząt (w naszym przypadku Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Sydney).

1. Eutanazja zwierzęcia i sekcja mięśni

  1. Przenieś mysz z pomieszczenia do oddzielnego pomieszczenia, gdzie jest poddawana eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia roztworu pentobarbitonu (30 mg / kg) przy użyciu metody obchodzenia się z myszą opisanej przez Shimizu 25. Umieść mysz z powrotem w klatce.
  2. Gdy oddech myszy ustanie na dłużej niż 1 minutę, przetestuj odruch wycofania stopy, delikatnie szczypiąc stopę, a odruch rogówki, lekko muskając rogówkę. Tylko wtedy, gdy nie ma reakcji odruchowych, mysz może być przygotowana do sekcji.
  3. Skonsultuj się z atlasem anatomii gryzoni, takim jak Chiasson 26 i/lub zasięgnij pomocy doświadczonego anatoma przed przystąpieniem do sekcji interesującego Cię mięśnia. W każdym przypadku usuń włosy z leżącej na powierzchni skóry za pomocą małej golarki elektrycznej przed otwarciem skóry, aby odsłonić mięśnie.
    UWAGA: Rozwarstwienie będzie się różnić dla każdego anatomicznie odrębnego mięśnia.
  4. Za pomocą kleszczy uwolnij mięsień od leżących nad nim błon i otaczających tkanek. Chwyć i przetnij dystalne ścięgno, aby oddzielić mięsień od jego przyczepu.
  5. Delikatnie drażnij i odetnij mięsień od otaczającej tkanki z powrotem do jego źródła. Nowo wypreparowany mięsień należy na krótko umieścić w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub roztworze Ringera przed dalszym przetwarzaniem.

2. Przygotowanie mięśnia do kriosekcji

UWAGA: Optymalne zachowanie struktury można osiągnąć poprzez perfuzję całego zwierzęcia, jak poprzednio opisano w 27, lub fiksację zanurzeniową (dla małych mięśni), jak opisano w opcjonalnym kroku 2.1. Jednak 4% wiązanie paraformaldehydu może upośledzać późniejsze barwienie wieloma sondami przeciwciał i fluorescencyjnym BGT. W szczególności należy unikać aldehydu glutarowego. Jeśli mięśnie nie mają być naprawione, muszą być natychmiast zamrożone (przejdź do 2.3).

  1. Opcjonalne mocowanie przez zanurzenie: Przypnij mięsień do woskowania na szalce Petriego na długości spoczynkowej. Przykryj mięsień paraformaldehydem o zawartości 2% w/v (świeżo rozpuszczonym w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyj go 3 zmianami PBS w ciągu 30 minut (3 x 10 min), a następnie zastąp PBS 30% w/v sacharozą w PBS i inkubuj O/N w temperaturze 4 °C.
  2. Wykonaj wcześniej formy ("łodzie"), składając kawałki folii aluminiowej o wymiarach 2 cm x 1,5 cm, jak pokazano na rysunku 1. Umieść kawałek membrany nitrocelulozowej na dnie łodzi. Delikatnie wlej matrycę do zatapiania kriostatu (tabela materiałów) do łodzi na głębokość 2 mm, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Umieść mięsień w łodzi, wyrównując go z liniami długopisu na nitrocelulozie. Dodaj więcej matrycy osadzającej, aby całkowicie pokryć mięsień (ryc. 1).
  3. Wstępnie oznacz tuby polipropylenowe nieusuwalnym markerem. Umieść kroplę wody w każdej probówce i schłodź probówkę w ciekłym azocie.
    UWAGA: Zamrożona kropla wody utrzymuje ciśnienie pary i zapobiega wysuszeniu podczas długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C
  4. Za pomocą osłony twarzy, grubych rękawic ochronnych i dużej pary kleszczy częściowo opuść małą metalową zlewkę (3 cm średnicy, 8 cm głębokości) zawierającą izopentan o głębokości 2 cm do pojemnika z ciekłym azotem na 30 sekund. Wyjmij zlewkę i umieść ją na blacie stołu. Za pomocą mniejszej pary kleszczy umieść formę zawierającą mięsień i matrycę osadzającą w schłodzonym izopentanie. Należy uważać, aby nie mieszać ciekłego azotu z izopentanem.
  5. Odczekaj 2 minuty, aż blok całkowicie zamarznie, zanim użyjesz kleszczyków do wyjęcia zamrożonego bloku i zamknij go w odpowiedniej, wstępnie oznakowanej i schłodzonej probówce (krok 2.3).
  6. Przechowywać probówki tymczasowo w ciekłym azocie przed przeniesieniem do temperatury -80 °C. Zapisać wszystkie próbki w arkuszu kalkulacyjnym zawartości zamrażarki.

3. Kriosekcja i barwienie fluorescencyjne dla obrazów en face NMJ

  1. Oderwij aluminiową formę. W komorze kriostatu o temperaturze -20 °C przymocuj zamrożony blok do uchwytu kriostatu tak, aby przeciąć kriosekcje o wielkości 20 μm równolegle do długiej osi włókien mięśniowych (ryc. 1). Podnieś skrawki na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną lub żelatyną.
  2. UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli tkanka jest utrwalona przed zamrożeniem. Po odczekaniu 30 minut na wyschnięcie skrawków na szkiełkach, przymocuj je, umieszczając kroplę 2% paraformaldehydu w PBS na każdej sekcji na 15 minut w temperaturze suchej.
  3. Umyj szkiełka 3 x 10 min w PBS w słoiku Coplin, a następnie zanurz szkiełka w PBS zawierającym 0,1 M glicyny na 30 minut, aby zablokować resztkowe grupy aldehydowe.
  4. Myć szkiełka przez 10 minut w PBS, a następnie zanurzyć w metanolu (schłodzonym do -20 ºC) na 7 minut. Ten etap przenikania jest rutynową częścią podwójnego znakowania fluorescencyjnym BGT i anty-synaptofizyną, ale może niekorzystnie wpływać na barwienie immunologiczne niektórych innych białek.
  5. Umyj szkiełka 2 x 10 min w PBS, a następnie umieść każde szkiełko w stabilnej i wypoziomowanej wilgotnej komorze. Natychmiast przykryć każdy skrawek 20 μl roztworu blokującego (0,2% Triton X-100, 2% albumina surowicy bydlęcej (BSA) w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków na żadnym etapie procesu barwienia immunologicznego.
  6. Przeprowadzić inkubację pierwotną: Ostrożnie usuwając nadmiar roztworu blokującego z każdej sekcji i zastępując go 20 μl króliczej antysynaptofizyny (rozcieńczonej w stosunku 1:200 w roztworze blokującym).
  7. Dołączyć szkiełko kontroli negatywnej, które będzie inkubowane tylko z roztworem blokującym. Ta "kontrola przeciwciał pierwotnych bez pierwotnego przeciwciał" jest niezbędna w każdym badaniu immunomarkera.
  8. Uważając, aby przeciwciało pierwotne pozostało na miejscu w każdej sekcji, zamknąć wilgotną komorę i inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C.
  9. Sprawdź każdą sekcję, aby potwierdzić, że przeciwciało pierwszorzędowe pozostaje na swoim miejscu. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie przepłucz każde szkiełko PBS i umieść je w słoiku Coplin. Umyj wszystkie szkiełka 3 x 10 min w PBS.
  10. Przeprowadzić wtórną inkubację. Pobierając po jednym szkiełku na raz, ostrożnie usunąć nadmiar PBS, umieścić go w wilgotnej komorze i przykryć każdy odcinek 20 μl mieszaniny zawierającej sprzężone z FITC przeciwciała anty-królicze IgG i BGT sprzężone z tetrametylodaminą lub innym czerwonym fluoroforem (TRITC-/redBGT; 5 g/ml) rozcieńczonym w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  11. Umyj szkiełka 3 x 10 min w PBS w słoikach z kopliny.
  12. Biorąc jedno szkiełko na raz, ostrożnie usuń nadmiar PBS i zamocuj za pomocą szkiełka nakrywkowego, używając minimalnej objętości odpornego na blaknięcie podłoża montażowego na bazie glicerolu. Uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych bezbarwnym lakierem do paznokci. Pozostaw do wyschnięcia.
  13. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 ºC przez okres do jednego tygodnia lub w temperaturze -20 ºC przez dłuższy okres przechowywania (do kilku miesięcy).

4. Bezstronne próbkowanie i obrazowanie en face płyt końcowych silnika

  1. Zaślep slajdy, oznaczając każdy slajd losowym numerem kodu, który pozostaje znany tylko drugiemu badaczowi (niezaangażowanemu w analizę). W rezultacie, operator pozostaje ślepy na grupy poddane działaniu substancji, dopóki nie zostanie zakończona ocena ilościowa parametrów NMJ dla wszystkich próbek.
  2. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i view w oświetleniu szerokokątnym za pomocą zestawu filtrów TRITC (obiektyw 63X oil 1.3 N.A.). Poruszaj się stopniowo (pole po polu) od lewej do prawej i do tyłu, aż w polu pojawi się tabliczka końcowa (Rysunek 2A).
    UWAGA: Kryterium próbkowania: Każda struktura zabarwiona AChR, która jest stosunkowo płaska i zwrócona w stronę obiektywu (tj. rozciąga się na <15 m w wymiarze z), jest uważana za płytę końcową i jest obrazowana do analizy (półksiężyce barwienia AChR reprezentują przekroje poprzeczne przez płyty końcowe i dlatego są wykluczone).
  3. Z otworkiem konfokalnym ustawionym na jednostkę 1.0 Airy i niską mocą lasera, zoptymalizuj poziomy wzmocnienia i przesunięcia dla TRITC/red-BGT (laser 532 nm) na płycie końcowej, która ma być obrazowana. Następnie zoptymalizuj fluorescencję FITC/synaptofizyny za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Zbierz stos z płytki końcowej w odstępie 0,7 μm między każdym wycinkiem optycznym. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera datę sesji obrazowania, nazwę kodową szkiełka i numer płyty końcowej.
    UWAGA: Skany wykonane przy użyciu laserów 488 nm i 532 nm (FITC i TRITC) powinny być zbierane sekwencyjnie (nie równocześnie), aby uniknąć zanieczyszczenia kanału FITC przez fluorescencję z czerwonego fluoroforu i odwrotnie (przebijanie).
  4. Powtarzać pobieranie próbek i obrazowanie zgodnie z krokami 4.2-4.3 do momentu pobrania 20 płytek końcowych ze szkiełka/próbki.
  5. Przejdź do następnego zakodowanego slajdu i powtórz 4.2-4.4. Powtórz tę czynność dla każdego z zakodowanych slajdów.
  6. Zbierz kilka obrazów płytek końcowych ze szkiełka kontrolnego (kontrola bez przeciwciał pierwszorzędowych) przy użyciu ustawień konfokalnych, które okazały się optymalne dla szkiełek eksperymentalnych (kanał fluorescencyjny FITC powinien wydawać się ciemny).
  7. Pod koniec sesji konfokalnej przenieś pliki obrazów na inny komputer i wykonaj kopię zapasową oryginalnych plików na dysku zewnętrznym lub serwerze.

5. Pomiar obszaru specjalizacji synaptycznych w obrazach en face

  1. Użyj darmowego oprogramowania NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), aby przygotować obrazy z maksymalną projekcją (MIP) z każdego stosu z. Zapisz je jako pliki tiff (Rysunek 2A i B). Nazwy plików powinny zawierać datę sesji zdjęciowej, przykładowy kod, numer tabliczki końcowej i kanał fluorescencyjny (np. 060414_5723_7_FITC.tiff ).
  2. Otwórz obraz z projekcją z w programie ImageJ. Wybierz kanał obrazu receptora acetylocholiny (rysunek 3A) i wybierz: Typ > obrazu > 8-bitowy, aby przekonwertować 24-bitowy kolorowy obraz RGB na trzy 8-bitowe obrazy w skali szarości na ekranie.
  3. Za pomocą narzędzia wielokąta ImageJ narysuj przybliżony kontur wokół interesującej nas płyty końcowej w kanale barwionym na czerwono BGT (ACHR), tak aby uwzględnić wszystkie widoczne zabarwione obszary danej pojedynczej płytki końcowej, wykluczając jednocześnie wszelkie barwienia, które nie pochodzą z interesującej płytki końcowej (Rysunek 3C).
  4. Zastosuj minimalny próg intensywności do obrazu, wybierając: Image > Adjust > Threshold (Rysunek 3E i powiązane zrzuty ekranu ImageJ).
  5. Dostosuj poziom progowy tak, aby odizolować części zabarwione AChR, wykluczając otaczający sygnał tła jako podpróg (rysunek 3E). Otwórz drugie okno z oryginalnym obrazem (o ciągłych przejściach tonalnych) bezpośrednio obok okna w celu porównania, aby ułatwić podjęcie decyzji o wartości progowej. Zapisz wartość progową do późniejszego wykorzystania w analizach kolokalizacji.
  6. Zachowując kontur wielokąta wokół blachy końcowej wybierz: Analizuj > Analizuj cząstki. W menu podręcznym określ zakres rozmiarów jako: od 50 do nieskończoności pikseli (eliminuje to drobne artefakty wynikające z szumu elektrycznego w fotopowielaczu).
  7. Polecenie Analizuj cząstki generuje okno z listą dyskretnych obszarów nadprogowych i ich wartościami intensywności fluorescencji ponumerowanymi tak, jak pojawiają się na obrazie binarnym (Rysunek 3G i powiązany zrzut ekranu ImageJ). Skopiuj te dane do arkusza kalkulacyjnego oznaczonego etykietą.
  8. Zmierz całkowitą powierzchnię blachy końcowej (obszar w wielokącie), wybierając: Analizuj > Zmierz. W ten sposób uzyskuje się całkowitą powierzchnię blachy końcowej. Skopiuj i wklej dane dla obszarów i intensywności AChR do arkusza kalkulacyjnego, upewniając się, że kolumny są odpowiednio oznaczone, wiersze będą używane dla poszczególnych płyt końcowych dla określonych slajdów.
  9. Przełącz się na kanał fluorescencyjny antysynaptofizyny i powtórz kroki 5.1 - 5.5, ale dla kanału FITC (Figura 3B, D i F). Celem jest dostosowanie progu w taki sposób, aby tworzył binarny obraz, który jak najwierniej odpowiada granicom barwienia postrzeganego przez oko. Zapisz wartość progową.
  10. Zmierz obszar nakładania się, wykonując następujące czynności: Otwórz oryginalny plik zawierający dwa obrazy kanałów i podziel go na dwa osobne obrazy, wybierając: Stosy obrazów > > Stos do obrazów.
  11. Za pomocą wtyczki Kolokalizacja (pobranej i zainstalowanej ze strony internetowej ImageJ) wybierz: Pluggin > Kolokalizacja i wprowadź wartości progowe wcześniej zarejestrowane dla kanałów AChR i nerwowych w odpowiednim polu zapytania kanału. Spowoduje to uzyskanie nakładającego się obrazu w białych pikselach (rysunek 3H i powiązane zrzuty ekranu ImageJ).
  12. Przekonwertuj nowo utworzony obraz nakładający się na format w skali szarości i zastosuj próg do wartości maksymalnej. Maksymalny próg wybierze tylko białe piksele, odpowiadające obszarowi nakładania się dwóch poprzednich kanałów. Zapisz w arkuszu kalkulacyjnym wynikową wartość obszaru "kolokalizacji", która reprezentuje obszar nakładania się w pikselach.
  13. Przygotuj arkusz kalkulacyjny ze średnimi próbnymi danych, oblicz i wykreśl odchylenia standardowe i błędy standardowe w postaci histogramów lub wykresów rozrzutu 20,22. Należy zauważyć, że wartość n ogólnie reprezentuje liczbę myszy w grupie próbki do celów statystycznych.
  14. Przed testami statystycznymi należy wykreślić obszary AChR płyty końcowej jako wykresy rozrzutu lub histogramy częstotliwości, aby określić, czy dane mają rozkład normalny (rysunek 6).

6. Względne intensywności barwienia porównane przy użyciu poprzecznych przekrojów optycznych

UWAGA: Dla tego protokołu przetwarzaj wszystkie próbki mięśni razem i obraz podczas jednej sesji konfokalnej. Planując eksperyment, należy przeznaczyć do 30 minut czasu obrazowania na próbkę mięśnia.

  1. Wyciąć kriosekcje 15 μm poprzecznie do długiej osi włókien mięśniowych i zebrać na szkiełkach, jak opisano w kroku 3.1.
  2. Przeprowadzić barwienie fluorescencyjne zgodnie z opisem w krokach 3.2-3.13.
  3. Zakoduj barwione szkiełka w taki sposób, aby obrazowanie i analizy były wykonywane z operatorem ślepym na grupę leczoną, jak opisano w kroku 4.1.
  4. Używając obiektywu fluorescencyjnego 40X (N.A. 0.75), krótko zbadaj sekcję z każdego szkiełka, aby określić pojedyncze ustawienie wzmocnienia i poziomu przesunięcia dla AChR, które będzie odpowiednie dla wszystkich płytek końcowych na wszystkich szkiełkach próbki. Najjaśniejsza płyta końcowa powinna znajdować się nieco poniżej 256 szarości na skali. Optymalizację tę należy wykonać osobno dla drugiego kanału fluorescencji (zbieranego kolejno). Zapisz stałe ustawienia wzmocnienia i poziomu przesunięcia i nie zmieniaj ich podczas sesji obrazowania.
  5. Zbierz obrazy standardowego szkiełka fluorescencyjnego (np. niewybielających kulek fluorescencyjnych), używając tych samych parametrów, na początku i na końcu sesji konfokalnej, aby wykryć wszelkie możliwe wahania intensywności lasera.
  6. Użyj kanału AChR, aby stopniowo skanować suwak w celu zlokalizowania płyt końcowych.
  7. Ustaw ostrość, aby znaleźć pojedynczą płaszczyznę przekroju optycznego w każdym polu mikroskopu, które zawiera największą liczbę płytek końcowych barwionych AChR.
  8. Zeskanuj ten pojedynczy przekrój optyczny dwukrotnie i zapisz uśredniony obraz (rysunek 4G).
  9. Zachowując tę samą płaszczyznę ogniskowej, przełącz się na drugi kanał fluorescencyjny (białko będące przedmiotem zainteresowania) i zbierz obraz jak w kroku 6.8. Zapisz plik obrazu, podając w nazwie: datę sesji obrazowania, kod próbki, numer obrazu oraz symbol wskazujący kanał fluorescencyjny. Rysunek 4A-F przedstawia przykłady rozkładu AChR na płytce końcowej w porównaniu z rapsynem, MuSK lub -dystroglikanem (-DG).
  10. Przenieś stół montażowy do następnego pola, które zawiera co najmniej jedną blachę końcową, a następnie powtórz kroki 6.8–6.9. Powtarzaj tę czynność, aż zostanie zobrazowanych łącznie 60 płyt końcowych.
  11. Pod koniec sesji obrazowania przenieś wszystkie pliki na inny komputer i utwórz ich kopię zapasową.
  12. Otwórz każdy oryginalny plik obrazu i podczas przeglądania kanału AChR wybierz: Stosy obrazów > > Stos do obrazów, aby podzielić kanały.
  13. Wybierz: Obraz > Wpisz > 8 bitów, aby przekonwertować na ekranie 8-bitowy format skali szarości. Zrób to dla obu kanałów fluorescencyjnych.
  14. Wybierz: Obraz > Układa > obrazy w stos. Otwórz nowy stos z dwóch wcześniej rozdzielonych obrazów 8-bitowych. Następnie można wygodnie przełączać się między dwoma kanałami fluorescencji w jednym oknie.
  15. Użyj narzędzia wielokąta, aby narysować linię ściśle wokół granicy barwienia AChR (Rysunek 4I).
  16. Wybierz: Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć średnią intensywność pikseli dla AChR w zamkniętym obszarze (zwróć uwagę na znaczenie ścisłego narysowania linii). Skopiuj tę wartość do arkusza kalkulacyjnego oznaczonego etykietą.
  17. Zachowując ten sam kontur wielokąta (aby zdefiniować obszar, który ma być mierzony), przełącz się na drugi kanał fluorescencyjny (np. Rysunek 4B, D, F) i wybierz: Analizuj > mierz. W ten sposób uzyska się średnią intensywność barwienia dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w obszarze synaptycznym zdefiniowanym przez barwienie AChR.
  18. Wybierz obszar z dala od widocznego barwienia płyty końcowej, a następnie wybierz: Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji tła. Powtórz to dla drugiego kanału/kanałów fluorescencji i skopiuj wartości tła do arkusza kalkulacyjnego wartości fluorescencji.
  19. Odejmij średnie wartości tła od wartości płytki końcowej, aby uzyskać skorygowane intensywności dla AChR i białka będącego przedmiotem zainteresowania na każdej płycie końcowej.
  20. Podzielić skorygowane wartości intensywności płytki końcowej dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez skorygowaną intensywność fluorescencji BGT, aby otrzymać współczynniki intensywności fluorescencji 14,21

7. Porównywanie gęstości AChR błony postsynaptycznej za pomocą FRET

UWAGA: Ten protokół ocenia stopień, w jakim AChR są ściśle upakowane (odstęp <10 nm) w błonie postsynaptycznej. Precyzyjna kombinacja fluoroforu dawcy i akceptora ma kluczowe znaczenie dla tego testu FRET. Nazwy i szczegóły dotyczące fluoroforów są podane w tabeli Materiały. Ich właściwości spektralne w odniesieniu do FRET zostały omówione w naszych poprzednich pracach 14,15.

  1. Przygotować utrwalone kriosekcje poprzeczne zgodnie z opisem w sekcji 6.1. Wszystkie grupy próbek muszą być przetwarzane razem i obrazowane w tej samej sesji konfokalnej.
  2. Dokładnie wymieszać 2,5 g/ml red-BGT (donor FRET) z 10 g/ml far red-BGT (akceptor FRET) z roztworem blokującym w małej plastikowej probówce, pipetując w górę i w dół 12 razy. Ta mieszanina molowa 1:4 maksymalizuje wydajność FRET 14.
  3. Umieścić każde szkiełko w wilgotnej komorze, ostrożnie przykryć każdą sekcję kroplą (12 μl) powyższej mieszaniny i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Sekcje kontrolne: obejmują niewielką liczbę sekcji z 2,5 g / ml red-BGT (tylko dawca; oznaczone kontrole C1), a także niektóre sekcje z 10 g / ml far-red-BGT (tylko akceptor; oznaczone kontrole C2). Inkubuj te kontrole zgodnie z krokiem 7.3.
  5. Umyj szkiełka 3 x 10 min w PBS i zamontuj w odpornym na blaknięcie podłożu montażowym na bazie glicerolu (patrz krok 3.12).
  6. Pobrać próbki z płyt końcowych jak w kroku 6.7. Fluorescencja od donora i akceptora powinna być idealnie zlokalizowana na płytkach końcowych ze względu na losowe wiązanie cząsteczek fluorescencyjno-BGT.
  7. Obrazy kontrolne: Korzystając z obiektywu 40X i niskiej mocy lasera, zoptymalizuj ustawienia wzmocnienia i poziomu przesunięcia redBGT dla płyt końcowych z suwaka kontrolnego C1. Zoptymalizuj poziomy wzmocnienia i przesunięcia dalekiej czerwieni BGT dla płyt końcowych z suwaka sterującego C2. Potwierdzić, że nie ma przesiąknięć fluorescencyjnych.
  8. Bez zmiany mocy lasera, ustawienia na poziomie wzmocnienia lub przesunięcia przenoszą się na szkiełka eksperymentalne i zbierają obrazy (przed fotowybielaczem) dla obu kanałów fluorescencji.
  9. Selektywnie fotowybielaj daleką czerwień BGT na części pojedynczej płytki końcowej, powiększając obszar skanowania, a następnie skanując 10 razy laserem 633 nm przy 100% mocy. Fluorescencja w skanowanym obszarze powinna stać się przyciemniona.
  10. Zresetuj moc lasera i zoom, a następnie zbierz obrazy po wybielaniu na obu kanałach fluorescencyjnych, korzystając z ustawień konfokalnych ustalonych na 7.7.
  11. Obliczyć wydajność FRET (E) na podstawie procentowego wzrostu fluorescencji donorowej (red-BGT) po fotowybielaniu akceptora (far-red-BGT) według następującego wzoru*:
    figure-protocol-1
    *Do wszystkich sytuacji, w których fluorescencja dawcy wzrasta po fotowybielaniu akceptora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar obszaru synaptycznego w NMJ

Każde oszacowanie obszaru opiera się na rysunku granicy w celu określenia zakresu specjalizacji synaptycznych. W zdrowych, młodych mięśniach dorosłych obrazy NMJ powinny wykazywać dobrze zdefiniowane granice zarówno dla barwienia AChR, jak i synaptofizyny (ryc. 2A i B). Intensywność fluorescencji zarówno dla AChR, jak i synaptofizyny gwałtownie wzrasta na granicy między okołosynaptyczną i synaptyczną częścią ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły umożliwiły nam wiarygodny pomiar i ilościowe określenie zmian właściwości NMJ w różnych warunkach, w tym w normalnych stanach starzenia się i chorobowych. Metody opisane dla obrazów NMJ en face pozwolą naukowcom porównać obszar specjalizacji pre- i postsynaptycznych oraz obszar nakładania się/wyrównania synaptycznego. Aby porównać względną intensywność białek pre- i postsynaptycznych, preferowany jest drugi protokół, który wykorzystuje poprzeczne przekroje optyczne. Trzeci protokół w szczególności...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych [570930]. Obrazowanie przeprowadzono w Zakładzie Mikroskopii Zaawansowanej Instytutu Bosch. Byłym członkom laboratorium, których prace są cytowane, dziękuje się za ich wkład w rozwój tych metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaDM 2000 z  System TCS SP2Większość skaningowych mikroskopów konfokalnych powinna być odpowiednia. 
ZeissLSM 510 Meta 
LeicaSPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)Life technologiesB35451Używany do oznaczania AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT)Life technologiesB35450Daleka czerwona fluorescencja: ledwo widoczna przez okular 
królicza antysynaptofizynaTechnologie życiowe18-0130Różne partie przeciwciała pierwszorzędowego różnią się skutecznym rozcieńczeniem roboczym
FITC-anty-rapsyn mab1234MiliporeFCMAB134FPrzeciwciało monoklonalne sprzężone z FITC
FITC-osioł anty-królik IgGJackson711-095-152Poliklonalne przeciwciała drugorzędowe mogą różnić się jakością w zależności od źródła i partii
Mieszanka o optymalnej temperaturze skrawania (O.T.C.)ProSciTechIA018Matryca do zatapiania kriostatu do zamrażania  mięśni
DABCOSigma10981Pożywka montażowa, która spowalnia fotowybielanie fluoroforów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663(2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640(2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970(2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412(2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840(2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnaPomiar wielko ci synapsTransfer energii rezonansowej fluorescencjiProjekcja maksymalnej intensywno ciBarwienie receptor w acetylocholinyKolokalizacja synaptofizynyAnaliza w programie Image JAnaliza z cza nerwowo mi niowego myszy

Powiązane artykuły