Opracowanie systemu modelowego in vitro do badania interakcji Equus caballus IgE z jego receptorem o wysokim powinowactwie FcεRI

Summary

Obecne badanie opisuje rozwój i zastosowania genetycznie modyfikowanego systemu testowego opartego na transfekcji komórek białaczki bazofilnej szczurów z genem FcεRIα konia. Transfekowane komórki wyrażają funkcjonalny receptor, w którym uwalnianie mediatorów odpowiedzi alergicznej może być aktywowane przez IgE i antygen.

Abstract

Interakcja IgE z jego receptorem Fc o wysokim powinowactwie (FcεRI), po której następuje prowokacja antygenowa, jest główną ścieżką w reakcjach alergicznych zależnych od IgE. W wyniku wysokiego powinowactwa wiązania między IgE i FcεRI, wraz z ciągłym wytwarzaniem IgE przez limfocyty B, alergie zwykle utrzymują się przez całe życie, a obecnie nie ma trwałego lekarstwa. Konie, zwłaszcza konie wyścigowe, które są powszechnie wsobne, to gatunek ssaków, który jest bardzo podatny na rozwój reakcji nadwrażliwości, co może poważnie wpłynąć na ich wydajność. Fizjologiczne reakcje na uczulenie alergiczne u koni odzwierciedlają reakcje obserwowane u ludzi i psów. W niniejszej pracy opisano rozwój systemu testów in situ do ilościowej oceny uwalniania mediatorów odpowiedzi alergicznej odnoszącej się do układu koniowatych. W tym celu gen kodujący końskie FcεRIα został transfekowany i poddany ekspresji na powierzchni rodzicielskich komórek białaczki bazofilowej szczura (RBL-2H3.1). Produkt genu transfekowanego łańcucha α koni utworzył funkcjonalny kompleks receptorowy z endogennymi łańcuchami β i γ szczura ¹. Powstały w ten sposób system testowy ułatwił ocenę ilości mediatora wydzielanego z transfekowanych komórek RBL-2H3.1 koni transfekowanych FcεRIα po uczuleniu na IgE koni i prowokacji antygenowej przy użyciu uwalniania β-heksozaminidazy jako odczytu ^{2, 3}. Uwalnianie mediatora osiągnęło szczyt na poziomie 36,68% ± 4,88% przy 100 ng ^ml-1 antygenu. Test ten został zmodyfikowany w stosunku do poprzednich testów stosowanych do badania reakcji alergicznych ludzi i psów ^{4, 5}. Wykazaliśmy również, że ten rodzaj systemu testowego ma wiele zastosowań w opracowywaniu narzędzi diagnostycznych i ocenie bezpieczeństwa potencjalnych strategii interwencji terapeutycznej w chorobach alergicznych ^{6, 2, 3}.

Introduction

Alergia jest znana od tysiącleci. Leczenie astmy zostało opisane w starożytnym egipskim tekście medycznym znanym jako papirus Ebersa (~1550 p.n.e.) i omówiono ziołowe środki lecznicze do jej leczenia ⁷.

Dzisiaj alergia jest klasyfikowana jako reakcja nadwrażliwości typu I, gdzie ramię układu odpornościowego limfocytu T pomocniczego typu 2 (TH₂) steruje produkcją przeciwciał immunoglobuliny E (IgE) w odpowiedzi na antygeny środowiskowe zwane alergenami. Są to różnorodne substancje, które często wchodzą w interakcje z komórkami układu odpornościowego i stymulują syntezę i wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym interleuk....

Protocol

1) Przygotowanie linii komórkowej:

1. Opracowanie linii komórkowej RBL-2H3.1 wykazującej ekspresję FcεRI koniα:
   1. Stosując podstawowe techniki hodowli tkankowej dla jednowarstwowych linii komórkowych, transfekuj rodzicielskie komórki RBL-2H3.1 za pomocą plazmidu pEE6, przenoszącego gen FcεRIα koni (GenBank: Y18204.1) ²⁸. Dodać 2 μg ^μl-1 plazmidowego DNA do 0,8 ml komórek o gęstości 1,2 x10⁷ komórek ^ml-1. Elektroporuj ogniwa przy napięciu 250 V 960 μF za pomocą elektrokuwety o średnicy 0,4 cm, a następnie natychmiast inkubuj na lodzie przez 10 minut.
   2. Wybierz transformowane komór....

Results

Rodzicielskie komórki RBL-2H3.1 oraz te transfekowane genem końskiego receptora FcεRIα zostały najpierw uwrażliwione mysim IgE anty DNP-HSA i poddane próbie antygenu DNP-HSA. Mysia IgE wiąże się z endogennym receptorem szczura w obu liniach komórkowych, a tym samym działa jako kontrola w celu przetestowania żywotności uwalniania obu linii komórkowych w celu uwolnienia mediatorów (Figura 1 A). Jest to ważna kontrola i powinna być przeprowadzana rutynowo, ponieważ po przedłużonym (> 10 tygodni) pasażu w.......

Discussion

Podsumowując, wyniki tego badania wykazały, że gdy komórki RBL-2H3.1 eksprymujące FcεRIα koni są uwrażliwione na IgE koni i prowokowane antygenem, dają szczytowe uwalnianie mediatora na poziomie 36,68% ± 4,88% całkowitej ilości mediatora wewnątrz komórek, w porównaniu z komórkami rodzicielskimi RBL-2H3.1 bez ekspresji FcεRIα koni.

W związku z tym test ten stanowi użyteczne narzędzie do badania i badania reakcji alergicznych koni in vitro. Pozwala to na określenie ilości mediatora uwal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Ekspresja Fc i epsilonu koni; RI&alfa;	-		Wyprodukowano w laboratorium
IgE koni anty NIP-HSA	-		Wyprodukowano w laboratorium
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Multi
Channel Pipette	Anachem	-
Inkubator	Galaxy R	-
Kwas 4hydroksy-5-jodo-3-nitrofenylooctowy	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH został sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej w celu wytworzenia NIP-HSA w laboratorium
Dinitrofenyl sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej	Sigma	A6661	Skrócony spektrofotometr płytkowy DNP-HSA
	Anthos Labtec HT2	-
-Rury	Sigma	P1851-Chlorek
sodu	Sigma	S7653-Chlorek
potasu	Sigma	P9333-Chlorek
magnezu	Sigma	M2670-Chlorek
wapnia	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma
N-acetylo-β-D-glukozaminid	Sigma	N9376	Roztwór podstawowy zwany substratem β-heksozaminidazy został przygotowany w 50mM przygotowanym w DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650-Kwas
cytrynowy	Sigma		251275-octan
sodu	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-