Opracowanie systemu modelowego in vitro do badania interakcji Equus caballus IgE z jego receptorem o wysokim powinowactwie FcεRI

Podsumowanie

Obecne badanie opisuje rozwój i zastosowania genetycznie modyfikowanego systemu testowego opartego na transfekcji komórek białaczki bazofilnej szczurów z genem FcεRIα konia. Transfekowane komórki wyrażają funkcjonalny receptor, w którym uwalnianie mediatorów odpowiedzi alergicznej może być aktywowane przez IgE i antygen.

Streszczenie

Interakcja IgE z jego receptorem Fc o wysokim powinowactwie (FcεRI), po której następuje prowokacja antygenowa, jest główną ścieżką w reakcjach alergicznych zależnych od IgE. W wyniku wysokiego powinowactwa wiązania między IgE i FcεRI, wraz z ciągłym wytwarzaniem IgE przez limfocyty B, alergie zwykle utrzymują się przez całe życie, a obecnie nie ma trwałego lekarstwa. Konie, zwłaszcza konie wyścigowe, które są powszechnie wsobne, to gatunek ssaków, który jest bardzo podatny na rozwój reakcji nadwrażliwości, co może poważnie wpłynąć na ich wydajność. Fizjologiczne reakcje na uczulenie alergiczne u koni odzwierciedlają reakcje obserwowane u ludzi i psów. W niniejszej pracy opisano rozwój systemu testów in situ do ilościowej oceny uwalniania mediatorów odpowiedzi alergicznej odnoszącej się do układu koniowatych. W tym celu gen kodujący końskie FcεRIα został transfekowany i poddany ekspresji na powierzchni rodzicielskich komórek białaczki bazofilowej szczura (RBL-2H3.1). Produkt genu transfekowanego łańcucha α koni utworzył funkcjonalny kompleks receptorowy z endogennymi łańcuchami β i γ szczura ¹. Powstały w ten sposób system testowy ułatwił ocenę ilości mediatora wydzielanego z transfekowanych komórek RBL-2H3.1 koni transfekowanych FcεRIα po uczuleniu na IgE koni i prowokacji antygenowej przy użyciu uwalniania β-heksozaminidazy jako odczytu ^{2, 3}. Uwalnianie mediatora osiągnęło szczyt na poziomie 36,68% ± 4,88% przy 100 ng ^ml-1 antygenu. Test ten został zmodyfikowany w stosunku do poprzednich testów stosowanych do badania reakcji alergicznych ludzi i psów ^{4, 5}. Wykazaliśmy również, że ten rodzaj systemu testowego ma wiele zastosowań w opracowywaniu narzędzi diagnostycznych i ocenie bezpieczeństwa potencjalnych strategii interwencji terapeutycznej w chorobach alergicznych ^{6, 2, 3}.

Wprowadzenie

Alergia jest znana od tysiącleci. Leczenie astmy zostało opisane w starożytnym egipskim tekście medycznym znanym jako papirus Ebersa (~1550 p.n.e.) i omówiono ziołowe środki lecznicze do jej leczenia ⁷.

Dzisiaj alergia jest klasyfikowana jako reakcja nadwrażliwości typu I, gdzie ramię układu odpornościowego limfocytu T pomocniczego typu 2 (TH₂) steruje produkcją przeciwciał immunoglobuliny E (IgE) w odpowiedzi na antygeny środowiskowe zwane alergenami. Są to różnorodne substancje, które często wchodzą w interakcje z komórkami układu odpornościowego i stymulują syntezę i wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym interleukiny-4 i interleukiny-13 ^{8, 9}, podobnie jak cząsteczki dymu papierosowego lub cząstek spalin z silników wysokoprężnych, które zwiększają syntezę IgE ¹⁰.

Wzrost objawów alergicznych w krajach uprzemysłowionych w ciągu ostatnich 50 lat został przypisany połączeniu efektu zanieczyszczeń środowiska i tendencji do bardziej oczyszczonego środowiska, które razem przesuwają odpowiedź immunologiczną w kierunku profilu zdominowanego przez cytokiny TH₂, jak proponuje 'Hipoteza Higieny' ¹¹.

Jak wspomniano powyżej, ludzie nie są jedynymi ssakami dotkniętymi alergią. Warto zauważyć, że konie i psy mogą również rozwijać klasyczne reakcje alergiczne, a badanie przeprowadzone przez ¹² wykazało, że podobnie jak u ludzi, alergia na konie jest przypisywana czynnikom genetycznym i środowiskowym. W związku z tym zwierzęta te stanowią dobre modele do badania wzajemnych oddziaływań między genetycznymi i środowiskowymi przyczynami alergii, jej progresji od uczulenia do choroby oraz możliwych strategii interwencyjnych po wystąpieniu objawów klinicznych

W 1887 roku Stömmer był pierwszą osobą, która opisała podobieństwo między astmą ludzką i końską ¹³, wpływ histaminy na układ sercowo-naczyniowy koni jest bardzo podobny do wpływu na ludzki ^{układ krążenia 14}. Konie są również kamieniem węgielnym branży wyścigów konnych, która jest warta 72 miliardy dolarów, a obroty zakładami wynoszą 115 miliardów dolarów rocznie ¹⁵.

Większość współczesnych koni wyścigowych to potomkowie niewielkiej liczby koni arabskich hodowanych przez Lady Anne Blunt od 1878 roku. Współczesne konie wyścigowe są powszechnie hodowane wsobnie w celu selekcji pod kątem zdolności wydajnościowych. Są podatne na zaburzenia genetyczne, z których jedną jest podatność na narastanie reakcji alergicznych. Mają również 1000 razy wyższy poziom IgE w surowicy niż nawet najciężej uczuleni ^ludzie16. Reakcje alergiczne koni objawiają się zwykle nadwrażliwością na ukąszenia owadów (IBH) ^{17, 18}. IBH powoduje zapalenie skóry z powodu ukąszeń owadów z rodzaju Culicoides. Inną formą choroby alergicznej koni jest nawracająca niedrożność dróg oddechowych (RAO), która objawia się w płucach i drogach oddechowych. Charakteryzuje się świszczącym oddechem i utrudnionym oddechem. RAO często występuje w odpowiedzi na zarodniki pleśni, a wysokie poziomy IgE specyficzne dla alergenu odnotowano u koni cierpiących na RAO w jednym z badań ¹⁹, chociaż inne badanie tego nie potwierdziło ²⁰.

Badania nad alergią koni koncentrowały się na próbie monitorowania i neutralizacji IgE koni poprzez opracowanie przeciwciał monoklonalnych anty-końskich IgE (mAbs) ^{21, 22}. Ponadto w badaniu ^{przeprowadzonym przez 23} omówiono wytwarzanie domen zewnątrzkomórkowych receptora łańcucha α receptora Fc o wysokim powinowactwie (FcεRIα) w celu wykrycia i ilościowego określenia IgE w surowicy koni. Powiązane badanie przeprowadzone przez Ledin²⁴ omawia nowe podejście mające na celu neutralizację IgE w surowicy poprzez pobudzanie układu odpornościowego za pomocą immunogenu własnego/niewłasnego. We wszystkich tych badaniach brakowało jednak skutecznego testu, który przetestowałby bezpieczeństwo i skuteczność ich protokołów. W niniejszym artykule przedstawiamy teraz taki system testowy mający zastosowanie w badaniu strategii diagnostycznych i terapeutycznych istotnych dla układu koniowatych, w którym na komórkach RBL-2H3.1 wykazujących ekspresję FcεRIα oceniano uwalnianie β-heksozaminidazy, jako wskaźnika degranulacji mediatora komórkowego. Protokół ten opiera się na wcześniejszych publikacjach ^{25, 4, 5, 2, 3} opisujących inżynierię komórek RBL transfekowanych genem kodującym domenę wiążącą IgE receptora o wysokim powinowactwie do IgE różnych gatunków. Protokół wyjaśnia, jak przeprowadzić test uwalniania β-heksozaminidazy, którego wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe z potrójnych eksperymentów.

Test uwalniania został po raz pierwszy opracowany przez Siraganian i Hook ²⁵ do badania alergii u ludzi. Grupa laboratoryjna kierowana przez dr Reubena Siraganiana opracowała również linię komórkową RBL. Te komórki RBL zostały opracowane w celu ekspresji ludzkiego FcεRIα, a protokół został opublikowany przez ⁴. Ostatnim elementem testu było opracowanie plazmidu pSV w artykule Neuberger ²⁶, który opisał wytwarzanie przeciwciał IgE poprzez klonowanie genu łańcucha ciężkiego poniżej genu myszy dla regionu zmiennego IgE, który jest ukierunkowany na hapten 4-hydroksy-3-nitro-fenacetyl (NP), powstałe przeciwciało chimeryczne było w pełni funkcjonalne. Zdolność do opracowania dowolnej IgE ukierunkowanej na ten sam hapten, przy jednoczesnym klonowaniu jego receptora na powierzchni komórek RBL, zaowocowała standaryzacją testu, dzięki czemu jest on użytecznym protokołem do pomiaru degranulacji komórek bazofilowych.

Test ma swoje plusy i minusy. Zaletą testu jest jego zdolność adaptacji do stosowania w dowolnym systemie ssaków, nasze laboratorium wykorzystało go zatem do testowania degranulacji w systemach ludzkich, psich i konnych, a jest to osiągalne po prostu poprzez syntezę IgE organizmu i klonowanie jego receptora na powierzchni komórek RBL.

Z drugiej strony, wadą testu jest to, że komórki RBL są bardzo wrażliwe na zmiany termiczne, mechaniczne i pH, co sprawia, że dają różne poziomy degranulacji w ramach tego samego testu. W związku z tym zdecydowanie zaleca się, aby testy były zawsze powtarzane w trzech egzemplarzach, a następnie pobierana była z nich średnia. Co więcej, komórki RBL mają tendencję do przesuwania się w kierunku fenotypu nieuwalniającego, jeśli są pozostawione w hodowli tkankowej przez dłuższy czas (>10 tygodni) ²⁷, co sprawia, że ich utrzymanie jest uciążliwe. Są również podatne na infekcje bakteriami mykoplazmowymi, które nie są widoczne pod mikroskopem świetlnym i nie zmieniają morfologii komórki, ale drastycznie zmieniają jej poziom degranulacji. W związku z tym konieczne są regularne badania na obecność mykoplazmy.

Protokół

1) Przygotowanie linii komórkowej:

1. Opracowanie linii komórkowej RBL-2H3.1 wykazującej ekspresję FcεRI koniα:
   1. Stosując podstawowe techniki hodowli tkankowej dla jednowarstwowych linii komórkowych, transfekuj rodzicielskie komórki RBL-2H3.1 za pomocą plazmidu pEE6, przenoszącego gen FcεRIα koni (GenBank: Y18204.1) ²⁸. Dodać 2 μg ^μl-1 plazmidowego DNA do 0,8 ml komórek o gęstości 1,2 x10⁷ komórek ^ml-1. Elektroporuj ogniwa przy napięciu 250 V 960 μF za pomocą elektrokuwety o średnicy 0,4 cm, a następnie natychmiast inkubuj na lodzie przez 10 minut.
   2. Wybierz transformowane komórki za pomocą pożywki zawierającej 0,4 g siarczanu genetycyny G418, a następnie posortuj pozostałe żywe komórki przez FACS, oznaczając je fluorescencyjnym przeciwciałem IgE. Do badania należy wykorzystać otrzymaną linię komórkową RBL-2H3.1 z ekspresją końskiego FcεRIα 2^{, 3}.
2. Uczulenie na przeciwciała przed testem:
   1. Zebrać komórki RBL-2H3.1 z ekspresją FcεRIα koni z konflującej się szalki Petriego. Przemyć, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do gęstości komórek 5x10⁵ komórek ^ml-1.
   2. Dodać IgE będące przedmiotem zainteresowania do zawieszonych komórek do końcowego stężenia 1 ng ^ml-1, następnie rozsiać 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce w kolumnach 1-6 i inkubować w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ + 90% wilgotności względnej przez 16 godzin. Po czasie inkubacji, a przed wykonaniem testu uwalniania, sprawdź studzienki pod mikroskopem pod kątem zbiegu studni i przylegania komórek.

2) Test wydania:

1. Mycie komórek:
   1. Bufor o ciepłym uwalnianiu (25 mM RURY, 120 mM chlorek sodu, 5 mM chlorek potasu, 0,04 mM chlorek magnezu i 1 mM chlorek wapnia) w temperaturze 37 °C, aby umożliwić delikatne mycie komórek.
   2. Przemyć komórki, przesuwając płytkę w celu usunięcia pożywki komórkowej i dodając 100 μl ciepłego buforu o temperaturze 37 °C. Powtórz dwa razy.
2. Prowokacja antygenowa:
   1. Przygotować seryjne rozcieńczenie antygenu (NIP-HSA lub DNP-HSA) 0 ng ^ml-1, 0,1 ng ^{ml-1, 1 ng ml-1}, 10 ng ^ml-1, 100 ng ^ml-1, 1 000 ng ^ml-1, 10 000 ng ^ml-1 w buforze uwalniającym i ogrzać w temperaturze 37 °C.
   2. Po drugim przemyciu komórek należy wyrzucić pożywkę i zastąpić ją 100 μl roztworów antygenu. Upewnij się, że studzienki w tym samym rzędzie (na przykład A1-6) mają dodane to samo stężenie antygenu.
   3. Ustawić kontrolę ujemną w wierszu A, dodając antygen 0 ng ^ml-1. Dodaj rosnące stężenie antygenu w dół rzędów (B-G), a następnie bufor tryton-x (5% Triton X-100) w komórkach rzędu H, aby zlizować komórki, które mają być użyte jako kontrola pozytywna. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby umożliwić komórkom uwolnienie mediatorów.
3. Ustawianie indywidualnych kontroli odwiertów:
   1. Po inkubacji przenieść 50 μl supernatantu komórkowego do drugiej połowy płytki (studzienki A1-6 do studzienek A7-12 itd.). Odrzucić pozostałe 50 μl supernatantu i zastąpić 50 μl buforu tryton-x, aby umożliwić pomiar ilości uwolnionych mediatorów w każdym dołku w kolumnach 7-12 jako procent całkowitej liczby mediatorów wewnątrz komórek w kolumnie 1-6.
4. Substrat enzymatyczny:
5. Dodać 50 μl substratu β-heksozaminidazy (50 mM 4-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozaminidu przygotowanego w DMSO, rozcieńczonego do 2 mM przez dodanie go do buforu cytrynianowego 0,2 M kwasu cytrynowego i 0,2 M octanu sodu, pH 4,5) do wszystkich studzienek, aby ułatwić konwersję substratu do 4-nitrofenolu przez enzym β-heksozaminidazy. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.

5. Zakończenie reakcji:
   1. Zatrzymaj reakcję, dodając 150 μl buforu Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) do każdej studzienki, ponieważ wysokie pH buforu zatrzymuje reakcję i zmienia 4-nitrofenol w żółty kolor.
6. Odczytywanie i analizowanie wyników:
   1. Odczytać płytkę za pomocą spektrofotometru płytkowego o długości fali 405 nm w celu zmierzenia absorbancji koloru żółtego. Obliczono procent uwolnionej β-heksozaminidazy przy użyciu następującego wzoru:

2. Zastosuj tę formułę do każdej studzienki, po czym przyjmuje się średnią dla każdego rzędu. A1 i A7 reprezentują lokalizację studzienek w płycie 96-dołkowej. Wykreśl wykres procentowego uwalniania β-heksozaminidazy (co odpowiada całkowitemu uwalnianiu mediatora) w stosunku do stężenia antygenu ^{2, 3}.

Wyniki

Rodzicielskie komórki RBL-2H3.1 oraz te transfekowane genem końskiego receptora FcεRIα zostały najpierw uwrażliwione mysim IgE anty DNP-HSA i poddane próbie antygenu DNP-HSA. Mysia IgE wiąże się z endogennym receptorem szczura w obu liniach komórkowych, a tym samym działa jako kontrola w celu przetestowania żywotności uwalniania obu linii komórkowych w celu uwolnienia mediatorów (Figura 1 A). Jest to ważna kontrola i powinna być przeprowadzana rutynowo, ponieważ po przedłużonym (> 10 tygodni) pasażu w...

Dyskusja

Podsumowując, wyniki tego badania wykazały, że gdy komórki RBL-2H3.1 eksprymujące FcεRIα koni są uwrażliwione na IgE koni i prowokowane antygenem, dają szczytowe uwalnianie mediatora na poziomie 36,68% ± 4,88% całkowitej ilości mediatora wewnątrz komórek, w porównaniu z komórkami rodzicielskimi RBL-2H3.1 bez ekspresji FcεRIα koni.

W związku z tym test ten stanowi użyteczne narzędzie do badania i badania reakcji alergicznych koni in vitro. Pozwala to na określenie ilości mediatora uwal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RBL-2H3.1 Ekspresja Fc i epsilonu koni; RI&alfa;	-		Wyprodukowano w laboratorium
IgE koni anty NIP-HSA	-		Wyprodukowano w laboratorium
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Multi
Channel Pipette	Anachem	-
Inkubator	Galaxy R	-
Kwas 4hydroksy-5-jodo-3-nitrofenylooctowy	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH został sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej w celu wytworzenia NIP-HSA w laboratorium
Dinitrofenyl sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej	Sigma	A6661	Skrócony spektrofotometr płytkowy DNP-HSA
	Anthos Labtec HT2	-
-Rury	Sigma	P1851-Chlorek
sodu	Sigma	S7653-Chlorek
potasu	Sigma	P9333-Chlorek
magnezu	Sigma	M2670-Chlorek
wapnia	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma
N-acetylo-β-D-glukozaminid	Sigma	N9376	Roztwór podstawowy zwany substratem β-heksozaminidazy został przygotowany w 50mM przygotowanym w DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650-Kwas
cytrynowy	Sigma		251275-octan
sodu	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-