Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

DOI:

10.3791/52242

⸱

4 stycznia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 3Biology Program, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące ze szpiku kostnego są potężnym zasobem komórkowym i były wykorzystywane w licznych badaniach jako potencjalni kandydaci do opracowania strategii leczenia różnych chorób. Celem tego badania było opracowanie i scharakteryzowanie MSCs jako wehikułów komórkowych zaprojektowanych do dostarczania czynników terapeutycznych w ramach strategii neuroprotekcyjnej ratowania uszkodzonego lub chorego układu nerwowego. W tym badaniu wykorzystaliśmy mysie MSCs, które zostały genetycznie zmodyfikowane przy użyciu wektorów lentiwirusowych, które kodują czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) lub czynnik neurotroficzny pochodzący z komórek glejowych (GDNF), wraz z białkiem zielonej fluorescencji (GFP).

Przed przystąpieniem do badań nad przeszczepami in vivo ważne było scharakteryzowanie zmodyfikowanych komórek, aby ustalić, czy modyfikacja genetyczna zmieniła aspekty normalnego zachowania komórek. Zbadano różne substraty hodowlane pod kątem ich zdolności do wspierania adhezji komórek, proliferacji, przeżycia i migracji komórek czterech subpopulacji zmodyfikowanych MSC. Przeprowadzono badania przesiewowe o wysokiej zawartości (HCS) i przeprowadzono analizę obrazu.

Badane substraty obejmowały: poli-L-lizynę, fibronektynę, kolagen typu I, lamininę, entaktynę-kolagen IV-lamininę (ECL). Do zbadania proliferacji komórek wykorzystano znakowanie immunologiczne Ki67, a do zbadania żywotności komórek wykorzystano barwienie jodkiem propidyny. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono przy użyciu systemu komór światła przechodzącego/środowiskowego w systemie przesiewowym o wysokiej zawartości.

Nasze wyniki pokazały, że różne subpopulacje genetycznie modyfikowanych MSCs wykazywały podobne zachowania, które były ogólnie porównywalne do oryginalnych, niemodyfikowanych MSCs. Wpływ różnych substratów hodowlanych na wzrost komórek i migrację komórek nie różnił się dramatycznie między grupami porównującymi różne podtypy MSC, a także substraty hodowlane.

To badanie dostarcza eksperymentalnej strategii szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach in vivo nad przeszczepami w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym problemem związanym z wdrażaniem użytecznych terapii w leczeniu zaburzeń układu nerwowego jest opracowanie skutecznych metod, które zapobiegają dalszej degeneracji, a także ułatwiają odzyskanie funkcji. Innowacyjną strategią jest inżynieria genetyczna komórek macierzystych ex vivo, w celu produkcji czynników neuroprotekcyjnych, przed ich przeszczepem. Ta kombinacja terapii komórkowej, w połączeniu z rodzajem terapii genowej, zapewnia potężną metodę leczenia choroby lub śmierci neuronów w układzie nerwowym wywołanej urazem.

Czynniki neurotroficzne są niezbędne dla wzrostu i przetrwania rozwijających się neuronów, jak również utrzymania i plastyczności dojrzałych neuronów. Wiele badań wykazało znaczącą rolę czynników neurotroficznych w promowaniu początkowego wzrostu i różnicowania neuronów w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym (OUN i PNS), a także mogą stymulować regenerację in vitro i w zwierzęcych modelach uszkodzenia neuronów1. Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) ulega silnej ekspresji w OUN i odgrywa ważną rolę w regulacji rozwoju neuronów, plastyczności synaptycznej i naprawy2. Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórkowego glejowego (GDNF) sprzyja przetrwaniu wielu typów neuronów, w tym neuronów dopaminergicznych i ruchowych3. Dlatego ważną strategią naprawy neuronów jest zapewnienie egzogennych źródeł czynników neurotroficznych do uszkodzonych lub chorych obszarów układu nerwowego.

Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące ze szpiku kostnego mają ogromny potencjał do dostarczania białek terapeutycznych do leczenia uszkodzonego lub chorego układu nerwowego. Przeszczepianie MSCs przyciągnęło znaczną uwagę w wysiłkach na rzecz opracowania terapii komórkowych kompatybilnych z pacjentem, ponieważ mają one szereg zalet, w tym: 1) względną łatwość izolacji i utrzymania, 2) zdolność multipotencjalną, 3) niewielkie obawy etyczne, 4) zdolność do przeżycia i migracji po przeszczepieniu oraz 5) potencjał przeszczepu autologicznego4,5. Obiecujące wyniki uzyskano dzięki zastosowaniu wcześniej i genetycznie modyfikowanych MSCs w modelach zwierzęcych dla wielu różnych schorzeń neurodegeneracyjnych, w tym urazu rdzenia kręgowego6,7, udaru8,9, niedoboru mieliny10 i zwyrodnienia siatkówki11-13. Sprzężenie przeszczepu komórek z dostarczaniem czynników neurotroficznych z genetycznie modyfikowanych komórek macierzystych jest nową i ważną strategią naprawy neuronów.

Kluczowym krokiem w rozwoju komórkowych systemów dostarczania czynników terapeutycznych jest określenie normalnego stanu zdrowia zmodyfikowanych komórek. W związku z tym głównym celem tego badania była ocena ogólnych parametrów wzrostu genetycznie modyfikowanych dorosłych komórek macierzystych. Ważnym podejściem do szybkiej oceny parametrów wielu komórek jest zastosowanie wysokoprzelotowych badań przesiewowych opartych na obrazie komórkowym (HTS), często nazywanych procedurami badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS)14. Technologia ta umożliwia zautomatyzowane pozyskiwanie i analizę obrazów, a podejście to szczególnie dobrze nadaje się do zastosowań badawczych nad komórkami macierzystymi. W ramach tego projektu opracowaliśmy platformę profilowania, która pozwala na szybką charakterystykę i optymalizację preferencji substratów komórkowych i funkcji komórkowych z genetycznie modyfikowanymi dorosłymi komórkami macierzystymi wykorzystującymi system HCS.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża dla płytek 96-dołkowych

  1. Stwórz mapę 96-dołkowej płytki, przedstawiając różne podłoża i typy komórek, które mają być badane (ryc. 1).
  2. Otrzymać roztwory podstawowe różnych substratów [poli-L-lizyna, fibronektyna, kolagen typu I, laminina i entaktyna-kolagen IV-laminina (ECL)], 96-dołkową płytkę wielodołkową i przygotować stację roboczą w sterylnym kapturze do hodowli komórek.
  3. Przygotować poszczególne substraty, rozcieńczając materiał w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 5 μg/ml (stężenie to zostało wcześniej określone na podstawie testu zależnego od stężenia substratu dla wzrostu i proliferacji komórek). Wymieszaj za pomocą wiru przed wlaniem do sterylnego zbiornika.
  4. Dodać 100 μl roztworu substratu do każdego dołka zgodnie z mapą 96-dołkową (rysunek 1) (12- lub 8-kanałowa mikropipeta jest wygodna do mikropipetowania do płytki 96-dołkowej). Uszczelnić pokrywkę do płytki 96-dołkowej za pomocą paska Parafilm i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Powlekanie komórek i obrazowanie poklatkowe

UWAGA: Mysie MSCs zostały wyizolowane ze szpiku kostnego dorosłych myszy C57BL/6 i utrzymywane jako przylegająca linia komórkowa. MSCs zostały zakażone za pomocą wektorów lentiwirusowych w celu zmodyfikowania ich do wydzielania neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF; ludzkie cDNA) i neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych (GDNF; ludzkie cDNA) przy użyciu kodowania wektora lentiwirusowego BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES-GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) i białko zielonej fluorescencji (GFP, LV-GFP; CMV-GFP).
UWAGA: Pożywką hodowlaną dla mysich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) jest zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove, zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej kwalifikowanej przez hybrydomę, 10% surowicy końskiej, 2 mM L-glutaminy i 10 000 U/ml penicyliny, 10 mg/ml streptomycyny. Pięć różnych typów mysich MSC (MSC, GMP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC) posiano przy około 30% zbiegu w kolbach do hodowli komórkowych T75.

  1. Posiewanie komórek
    1. Następnego dnia usunąć roztwory substratu przez aspirację i dwukrotnie przepłukać każdą studzienkę około 200 μl sterylnego PBS. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych (200 μl/basenik) do każdego dołka po ostatnim płukaniu PBS. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zrównoważenia.
    2. Podczas gdy 96-dołkowa płytka jest równoważona w inkubatorze, należy zebrać komórki (MSC w kolbach T75 powinny być w około 70% zlewające się w momencie zbierania/posiewu), zbierając pożywkę wzrostową (określaną jako pożywka kondycjonowana) z kolby T75 i przechowując w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w sterylnych warunkach (ta kondycjonowana pożywka zostanie użyta w kroku 2.1.4 poniżej).
    3. Dodać 8 ml sterylnego PBS do kolby i delikatnie zakręcić, a następnie odpipetować PBS i dodać 1 ml 0,05% trypsyny i 0,01% roztworu EDTA w celu odłączenia komórek od powierzchni hodowli kolby T75. Monitorować odłączenie komórek, oglądając kolbę za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.
    4. Po odłączeniu komórek natychmiast dodać do kolby 8 ml kondycjonowanej pożywki (zebranej w kroku 2.1.2). Zebrać zawiesinę komórek i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przez 4 minuty przy 450 x g w celu osadzenia komórek.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl świeżej i ogrzanej (37 °C) pożywki do hodowli komórkowych.
    6. Określ liczbę komórek w zawiesinie komórek, wykonując zliczanie żywych komórek błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Płytkie komórki o gęstości około 300 komórek/studzienkę należy umieścić w odpowiednich dołkach płytki 96-dołkowej.
    7. Powtórz te kroki dla każdej populacji komórek.
  2. Obrazowanie poklatkowe
    1. Po pokryciu wszystkich MSC umieść 96-dołkową płytkę w inkubatorze na 2 godziny, aby umożliwić MSC przyczepienie się do substratu.
    2. Uruchom system HCS i odczekaj 2 godziny, aż system się zrównoważy. Ustaw regulator środowiskowy na 37 °C i podłącz butlę z mieszanym gazem zawierającą 5% CO2 w powietrzu do komory środowiskowej systemu HCS dostarczającej stałe źródło powietrza.
    3. Po upływie 2-godzinnego okresu równoważenia wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i umieścić bezpośrednio w komorze wzrostu komórek systemu HCS. Odczekaj 30 minut, aby zrównoważyć wszelkie rozszerzanie się płytki związane z ciepłem, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu, aby skonfigurować ustawienia płytki.
    4. Wybierz obiektyw 20X do obrazowania. Wybierz dwie studzienki na warunek [tj. GFP-MSC na fibronektynie itp. (6 substratów x 5 podtypów MSC, co daje łącznie 30 warunków x 2 powtórzenia = łącznie 60 dołków)] w celu skonfigurowania obrazowania poklatkowego. Wybierz dwa miejsca do obrazowania w każdej studzience.
    5. Wybierz odpowiednie długości fal świetlnych do obrazowania.
      UWAGA: Do obrazowania poklatkowego wybrano dwie różne długości fal (kontrast fazowy i fluorescencja GFP).
    6. Ustaw ostrość na dnie studni za pomocą laserowego autofokusa i wykonaj zdjęcia testowe dla wielu miejsc i wielu studzienek, aby znaleźć zoptymalizowaną płaszczyznę ogniskowej.
    7. Po ustaleniu ostrości rozpocznij robienie zdjęć co 5 minut przez 48 godzin dla wszystkich 60 dołków (120 miejsc).
    8. Podawaj komórki co 24 godziny, wyjmując 96-dołkową płytkę z systemu HCS. Usunąć 75 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 100 μl świeżej pożywki do każdej studzienki (zrównoważyć tę świeżą pożywkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ).
    9. Pod koniec eksperymentu poklatkowego wyjmij 96-dołkową płytkę z systemu HCS. W sterylnych warunkach należy pobrać próbki kondycjonowanych pożywek z każdej studzienki i przenieść je na inną płytkę 96-dołkową.
      UWAGA: Próbki te można wykorzystać do dalszej analizy poprzez wykonanie testu ELISA dla czynników neurotroficznych.
    10. Przygotuj 96-dołkową płytkę z hodowanymi MSCs do dodatkowych testów, takich jak test proliferacji komórek Ki67 lub test barwienia żywych/martwych jodków propidyny (patrz szczegóły poniżej).
    11. Wykonaj analizę obrazowania poklatkowego dla migracji komórek/śledzenia komórek, jak opisano w sekcji 5 poniżej.

3. Proliferacja komórek Ki67 i test na żywy/martwy jodek propidyny

  1. Test proliferacji komórek Ki67 (immunocytochemia)
    1. Przepłukać kultury komórkowe 0,1 M buforem fosforanowym (PO4) przez jedną minutę dwa razy. Utrwal kulturę za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i przepłucz studzienki PBS przez siedem minut trzy razy.
    2. Po ostatnim płukaniu dodać 100 μl roztworu blokującego (sól fizjologiczna z buforu fosforanowego, 5% normalnej surowicy osła, 0,4% surowicy albuminy bydlęcej i 0,2% Triton X-100) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, królicze przeciwciało anty-Ki67, rozcieńczając je w roztworze blokera w stosunku roboczym 1:200.
    3. Usuń roztwór blokujący i nałóż 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Przykryć 96-dołkową płytkę i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał i płucz PBS przez 7 minut, 3 razy.
    5. Przygotować przeciwciało drugorzędowe, anty-królicze Cy3 osła w roztworze blokującym w stosunku roboczym 1:500. Dodać barwienie jądrowe DAPI do roztworu przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu ostatniego płukania PBS nanieść 100 μl roztworu przeciwciała wtórnego/DAPI do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut.
    6. Usuń wtórne przeciwciało/roztwór DAPI i płucz każdą studzienkę PBS przez 7 minut, 3 razy. Przykryć płytkę 96-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.
  2. Test żywego/martwego jodku propidymu
    1. Zmierz śmierć komórki za pomocą testu wykluczającego jodek propidyny (PI), jak opisano poniżej.
    2. Przygotować roztwór barwienia jodku propidyny o stężeniu 1,5 μM w pożywce hodowlanej.
    3. Dodać 100 μl 70% etanolu do jednego dołka MSCs na 2 minuty z zamiarem zabicia tych komórek. To dobrze służy jako pozytywna kontrola dla plamy PI. Większość MSCs będzie wybarwiona PI, co wskazuje na śmierć komórki. Usunąć roztwór etanolu.
    4. Dodać 100 μl roztworu barwienia jodku propidyny do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    5. Przepłukać komórki 0,1 M buforem fosforanowym przez 1 minutę, 2 razy. Utrwalić komórki za pomocą 4% PFA w buforze 0,1 M P04 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usuń PFA i spłucz PBS trzy razy przez 7 minut.
    6. Inkubować z roztworem DAPI (1:50) rozcieńczonym w roztworze blokera przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać wszystkie studzienki PBS przez 7 minut, 3 razy.
    7. Usuń roztwór DAPI i płucz każdą studzienkę PBS przez 7 minut, 3 razy. Przykryć płytkę 96-dołkową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.

4. Zautomatyzowane obrazowanie i analiza punktacji na wielu długościach fal

  1. Załaduj 96-dołkową płytkę (wcześniej przetworzoną do znakowania immunologicznego Ki67 lub wybarwioną jodkiem propidyny) do systemu HCS i pozwól płytce zrównoważyć się przez 20 minut Otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów systemu HCS.
  2. Wybierz ustawienia akwizycji dla obiektywu 10X, korzystając z binowania kamery na 1 i ustawieniu wzmocnienia na 2. Znajdź płaszczyznę Z, w której znajdują się komórki, korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji i oblicz przesunięcie dla każdej interesującej nas długości fali. Na potrzeby tej analizy uchwyć obrazy dla DAPI (W1), Cy3 (W2) i FITC (W3). Wybierz maksymalny poziom intensywności, przy którym studzienki kontroli ujemnej nie wykazują sygnału do akwizycji obrazu. Upewnij się, że to ustawienie jest odpowiednie dla dołków dodatnich.
  3. Zdobądź płytę. Przechwytuj obrazy i przechowuj je w bazie danych oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów.
  4. Po uzyskaniu obrazów otwórz oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów w trybie offline i przejrzyj dane płyt z powyższych obrazów.
  5. Wybierz analizę punktacji dla wielu długości fali. Skonfiguruj minimalne i maksymalne natężenia dla każdej długości fali.
    UWAGA: Wykrycie DAPI powinno oznaczać zabarwienie wokół każdego widocznego jądra. Cy3 powinien wykrywać dodatnie komórki o immunoreaktywności Ki67 (IR) i nie powinien wykrywać IR w kontrolach ujemnych. Dla Cy3 Ki67 IR przybliżona minimalna szerokość wynosiła 7 μm, przybliżona maksymalna szerokość wynosiła 30 μm, intensywność powyżej lokalnego tła wynosiła 150 poziomów szarości, a minimalny obszar barwiony wynosił 50μm2.
  6. Przeprowadź analizę dla wszystkich pozycji. Wyeksportuj dane do wyświetlenia w arkuszu kalkulacyjnym.

5. Śledzenie komórek

  1. Otwórz program do akwizycji i analizy obrazu i kliknij "Review Plate Data [DB]...", wybierając interesującą Cię tabliczkę.
  2. Wyświetl dane jako "Czas a dobrze".
  3. Wybierz jedną z witryn z sekcji "Witryny", klikając lewym przyciskiem myszy żądaną opcję. Wybierz "Transmitowane..." w sekcji "Długości fal:". Kliknij prawym przyciskiem myszy docelowy dołek w szablonie płytki 96-dołkowej i kliknij "Załaduj obrazy".
  4. Śledź komórki, klikając "Aplikacje", a następnie "Śledź obiekty".
  5. Użyj opcji "Dynamiczna wymiana danych (DDE)", aby wybrać format eksportu danych, np. Microsoft Excel.
  6. Wybierz dane śledzenia do wyeksportowania, np. czas, który upłynął, numer obiektu, odległość, przedział czasu, prędkość, kąt bezwzględny, odległość do początku, delta x i delta y.
  7. Oznacz każdą interesującą komórkę "Ctrl + lewy przycisk myszy" w komórkach docelowych.
  8. Śledź komórki. W razie potrzeby zatrzymaj/zmień niewłaściwe śledzenie komórek za pomocą "Esc", a następnie dostosuj ustawienia.
  9. Po zakończeniu śledzenia komórek zapisz dane za pomocą "Dane dziennika".

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parametry wzrostu MSC zostały zbadane poprzez hodowlę różnych populacji MSC na różnych podłożach. Pięć różnych populacji podtypów MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs i BDNF/GDNF-GFP-MSCs) posiano na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych wstępnie pokrytych różnymi substratami, jak pokazano na rysunku 1. Po czterech dniach hodowli płytki zostały utrwalone i znakowane immunologicznie i/lub wybarwione odpowiednimi odczynnikami, a następnie zbadane za pomocą systemu HCS i analiz przeprowadzonych za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazu.

figure-results-1
Rysunek 1: Szablon płytki 96-dołkowej do projektowania eksperymentalnego. 96-dołkowe płytki pokryto różnymi podłożami, a studzienki obsiano zmodyfikowanymi komórkami macierzystymi, jak pokazano na szablonie. Na przykład w tym eksperymencie użyto tylko studzienek w rzędach B-F. Wiersze A, G i H pozostały puste. Skróty – MSCs: mezenchymalne komórki macierzyste; GFP-MSC: MSC wykazujące ekspresję białek zielonej fluorescencji; BDNF-GFP-MSC: MSC wykazujące ekspresję czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego; GDNF-GFP-MSC; MSCs pochodzące z komórek glejowych czynnika neurotroficznego wyrażającego GFP; BDNF/GDNF-GFP-MSC; MSC wykazujące ekspresję BDNF i GDNF-GFP; ECL: Entaktyna-Kolagen IV-Laminina).

Immunoznakowanie anty-Ki67, a następnie barwienie przeciwstawne DAPI, zostało użyte do oceny, czy różne substraty wpływają na proliferację różnych populacji zmodyfikowanych MSCs (Rysunek 2A). Ekspresja antygenu Ki67 zachodzi preferencyjnie w późnych fazach G1, S,G 2 i M cyklu komórkowego i nie jest wykrywana w komórkach w fazie spoczynku (G0), a zatem jest przydatna jako marker komórkowy proliferacji15. 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) jest powszechnie stosowanym barwnikiem jądrowym i chromosomowym, który emituje niebieską fluorescencję po związaniu się z regionami AT DNA16. Całkowitą liczbę komórek w polu można określić, zliczając liczbę jąder barwionych DAPI. Jak pokazano na rysunku 2B, chociaż występowały różnice w procentowym odsetku proliferujących MSC, wszystkie substraty wspierały jednak znaczną proliferację komórek dla każdego z podtypów MSC.

figure-results-2
Rycina 2: Test proliferacji komórek Ki67. (A) Scalony, podwójnie fluorescencyjny obraz barwienia jądrowego Ki67 (czerwony) i DAPI (niebieski). Wiele MSCs było znakowanych immunologicznie przeciwciałem Ki67 (kolor czerwony). Podziałka = 50 μm. (B) Wykres słupkowy ilustrujący procentową zawartość podtypów MSC znakowanych immunologicznie Ki67 hodowanych na substratach polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL) przez 5 dni in vitro (DIV). N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje uśrednione dane zbiorcze z 8 zobrazowanych lokalizacji z 2 studni dla każdego warunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Barwienie jodkiem propidium (PI) zostało użyte do oceny, czy różne substraty wpływają na przeżycie komórek (Rysunek 3). Jodek propidyny jest powszechnie stosowanym barwnikiem jądrowym i chromosomowym o czerwonej fluorescencji. Jodek propidyny jest nieprzepuszczalny dla błony i ogólnie wykluczany z żywotnych komórek, a zatem jest przydatny do wykrywania martwych komórek w populacji. Proporcję martwych komórek w danym stanie można określić w połączeniu z ogólną etykietą jądrową, taką jak DAPI, w celu identyfikacji wszystkich komórek w polu. Odsetek komórek PI-dodatnich był niski na wszystkich badanych substratach (ryc. 3). Jako pozytywną kontrolę odczynnika PI, kilka studzienek zawierających MSC inkubowano w 70% etanolu, stanie, o którym wiadomo, że zabija większość komórek, co skutkuje wysokim odsetkiem komórek znakowanych PI, jak pokazano na rysunku 3B i 3C (kontrola pozytywna traktowana etanolem).

figure-results-3
Rycina 3: Test śmierci komórki jodku propidyny. (A) Scalony, podwójnie fluorescencyjny obraz dla barwienia jodkiem propidyny (czerwony) i DAPI (niebieski). Chociaż jądra wszystkich żywotnych komórek zostały wybarwione DAPI (na niebiesko), w MSCs nie wykryto barwienia jodkiem propidyny. (B) Praktycznie wszystkie MSCs zostały wybarwione jodkiem propidyny po ekspozycji na 70% etanol. Podziałka w A i B = 100 μm. (C) Wykres słupkowy ilustrujący procentową zawartość podtypów MSC barwionych jodkiem propydyny (PI) hodowanych na substratach polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL) przez 5 dni in vitro (DIV). Kontrola etanolu: Ten warunek służył jako kontrola pozytywna dla odczynnika do barwienia PI. Większość komórek poddanych barwieniu PI po obróbce etanolem jest martwa, a zatem dodatnio wybarwiona dla odczynnika PI. N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje uśrednione dane zbiorcze z 8 zobrazowanych lokalizacji z 2 studni dla każdego warunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zbadać możliwy wpływ różnych substratów na zachowanie zmodyfikowanych MSC, migracja komórek została przeanalizowana za pomocą cyfrowej mikroskopii poklatkowej i systemu komór światła przechodzącego/środowiska w systemie HCS (zobacz Dodatkowe wideo 1). Wiele miejsc/studzienek zostało zobrazowanych poklatkowo i wykorzystanych do obliczenia szybkości migracji komórek dla różnych subpopulacji MSC rosnących na różnych podłożach za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Ogólnie rzecz biorąc, jak pokazano na rysunku 4C, wszystkie podtypy MSC wykazywały najszybsze tempo migracji na powierzchniach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (fibronektyna, kolagen, laminina i ECL), a najwolniejsze na powierzchniach z polistyrenu niepowlekanego.

figure-results-4
Rysunek 4: Śledzenie i migracja komórek. MSC śledzone za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Nałożone obrazy światła przechodzącego i obrazy fluorescencyjne z (A) początku obrazowania poklatkowego i (B) po 29 godzinach później po zakończeniu sesji obrazowania poklatkowego (patrz film uzupełniający 1). Ścieżki migracji komórek są oznaczone kolorowymi liniami. Podziałka skali: 50 μm. (C) Wykres słupkowy ilustrujący średnie tempo migracji (wyrażone w μm/h) dla podtypów MSC hodowanych na substratach polistyrenu (PS), poli-L-lizyny (PLL), fibronektyny, kolagenu typu I, lamininy lub entaktyny-kolagenu IV-lamininy (ECL) przez 2 dni in vitro (DIV). N = jeden eksperyment. Każdy słupek reprezentuje średnią z co najmniej 10 zobrazowanych komórek z 2 dołków dla każdego warunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Razem wzięte, te wyniki dostarczają wstępnych dowodów, że te subpopulacje genetycznie modyfikowanych MSCs wykazują podobne właściwości wzrostu. Wyniki te dostarczają przekonujących dowodów na to, że modyfikacje genetyczne tych MSC za pośrednictwem lentiwirusa nie wywołały dramatycznego, wykrywalnego szkodliwego wpływu na parametry wzrostu badane za pomocą tej platformy przesiewowej.

Dodatkowe wideo 1. Cyfrowy film poklatkowy ze śledzenia MSC za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazu. Przedstawiono ścieżki migracji dla dwóch MSC [oznaczone jako 1 (zielona linia śledzenia) i 2 (niebieska linia śledzenia)]. Film nagrany w ciągu 29 godzin. Zdjęcia były wykonywane co 5 minut. Obrazy fluorescencyjne MSC wykazujących ekspresję GFP wykorzystano do obrazowania poklatkowego podczas przygotowywania filmu. Pasek kalibracyjny = 50 μm. Ten typ analizy jest przydatny do badania zachowań komórek, w tym migracji komórek i podziału komórek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są atrakcyjnym typem komórek do opracowania eksperymentalnej strategii łączącej terapię komórkową i opartą na dostarczaniu genów. MSCs są multipotencjalne, zdolne do różnicowania się w komórki linii mezodermalnej i wykazują znaczną plastyczność, różnicując się/transróżnicując w linie neuronalne i glejowe z odpowiednimi paradygmatami indukcji17,18. Co więcej, MSCs zostały przeszczepione i udowodniono ich skuteczność w badaniach przedklinicznych w przypadku wielu zaburzeń, w tym schorzeń neurodegeneracyjnych19. Skuteczność terapeutyczna MSCs jest dobrze znana ze względu na ich korzystne działanie przeciwproliferacyjne, przeciwzapalne i przeciwapoptotyczne20. Wiadomo również, że MSCs wytwarzają i wydzielają różne czynniki neurotroficzne i wzrostowe, co prawdopodobnie przyczynia się do cech neuroprotekcyjnych związanych z naiwnymi MSCs po przeszczepieniu w miejscach urazu lub choroby21. Co ważne, MSCs mogą być genetycznie modyfikowane w celu trwałego dostarczania czynników neurotroficznych do połączonych zastosowań opartych na terapii komórkowej i genowej i były stosowane w wielu zwierzęcych modelach urazów lub chorób OUN11,19,22.

Przy opracowywaniu połączonej strategii opartej na terapii komórkowej i genowej ważne jest, aby stan zdrowia komórek został dokładnie oceniony przed ich szerokim zastosowaniem do zastosowań in vitro, a zwłaszcza in vivo . W ramach dowodu słuszności koncepcji zbadaliśmy wiele populacji zmodyfikowanych i kontrolnych linii MSC w celu zbadania konsekwencji modyfikacji genetycznych na zdrowie i sprawność komórek przy użyciu podejścia opartego na badaniach przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS). Ogólnie rzecz biorąc, HCS odnosi się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych opartych na obrazach komórkowych14. To podejście przesiewowe pozwala na ilościową ocenę fenotypów komórkowych na wielu poziomach rozdzielczości przestrzennej (od komórki do subkomórki) i czasowej (od milisekund do dni) w różnych warunkach eksperymentalnych. Korzystając z tego podejścia, uzyskaliśmy dostęp do możliwych różnic w preferencjach substratów w odniesieniu do następujących parametrów: proliferacja komórek, ekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP), śmierć komórki oraz ruchliwość/migracja komórek. Eksperymenty zaprojektowano w formacie 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Na jednej płytce rutynowo badaliśmy możliwe różnice związane z substratem w odniesieniu do każdego parametru dla różnych populacji MSC komórek transdukowanych lentiwirusem i porównaliśmy zmodyfikowane MSCs z oryginalnymi, nietransdukowanymi MSC. Umożliwiło to bezpośrednie porównanie wyników dla różnych podtypów MSC z zestawem testów in vitro , takich jak proliferacja komórek przy użyciu znakowania immunologicznego Ki67, test żywotności żywych/martwych komórek przy użyciu barwienia jodkiem propidyny oraz zachowanie komórek poprzez wykonanie poklatkowego obrazowania cyfrowego. Jako rozszerzenie tego HCS można również przeprowadzić test ELISA na kondycjonowanych próbkach pożywek pobranych z poszczególnych studzienek w celu ilościowego określenia wydzielania czynników neurotroficznych. Kondycjonowane pożywki z różnych podtypów MSC mogą być również stosowane w testach biologicznych in vitro w celu określenia aktywności biologicznej wydzielanych czynników11,23. Ten typ platformy HCS może być również wykorzystywany do pomiarów in vitro wzrostu neurytów z pierwotnych kultur neuronalnych i linii nerwowych komórek macierzystych24. Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wykazały, że subpopulacje genetycznie zmodyfikowanych MSCs wykazywały podobne zachowania w porównaniu z niezmodyfikowanymi MSCs. Wpływ różnych substratów hodowlanych na wzrost komórek i migrację komórek nie różnił się dramatycznie między podtypami MSC, a także substratami hodowlanymi. W związku z tym testowane substraty macierzy zewnątrzkomórkowej nie wydawały się odgrywać kluczowej roli w modulowaniu tych aspektów zachowania komórek dla tych różnych zmodyfikowanych MSC.

Badanie to demonstruje wykorzystanie systemu HCS do analizy różnych aspektów zachowania komórek. Nierzadko jednak można spotkać się z ograniczeniami związanymi z analizą obrazu. Czasami, podczas analizy obrazów fluorescencyjnych, nieco trudno było określić prawidłową wartość progową, powyżej której komórki znakowane immunologicznie lub barwione byłyby liczone jako pozytywnie znakowane/barwione. Tak więc, aby zminimalizować subiektywny błąd systematyczny, określenie wartości progowych zależało od porównania z kontrolami (kontrole ujemne do obrazowania fluorescencyjnego przeprowadzano równolegle podczas całego przetwarzania przez pominięcie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych). Kolejne ograniczenie napotkano podczas analizy migracji komórek za pomocą cyfrowego obrazowania poklatkowego. W niektórych przypadkach oprogramowanie do obrazowania nie było w stanie odróżnić losowych ruchów Browna komórki od komórek migrujących na bardzo niewielką odległość. Dodatkowe ograniczenia były widoczne w sytuacjach, w których oprogramowanie analityczne nie było w stanie rozróżnić obecności wielu komórek w bardzo bliskiej odległości od siebie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, konieczne było ręczne wybieranie komórek podczas analizy, a nie w pełni zautomatyzowana analiza. Gęstość posiewu komórek może również powodować zniekształcanie danych migracji komórek między populacjami komórek, które wykazują większą preferencję do wzrostu w skupiskach w porównaniu z komórkami, które rosną w izolacji od siebie. Tego typu różnice są po części prawdopodobnie odzwierciedleniem preferencji komórka-substrat w porównaniu z preferencjami komórka-komórka.

Wykorzystanie systemu HCS do pozyskiwania obrazów i przeprowadzania analizy danych zapewnia skuteczny i szybki sposób oceny wielu parametrów komórek. Ponadto rutynowo rejestrowano cyfrowe filmy poklatkowe dla 30 różnych warunków (6 podłoży i 5 różnych podtypów MSC) przez okresy od godzin do dni (48 godzin) podczas korzystania z komory środowiskowej. Dane te wykorzystano następnie do obliczenia i określenia różnic w szybkościach migracji komórek w różnych liniach komórkowych na różnych cząsteczkach ECM.

W tym raporcie zwróciliśmy uwagę na wdrożenie platformy przesiewowej o wysokiej zawartości w celu oceny stanu zdrowia i funkcji komórek. Ten rodzaj analizy jest przydatny do opracowywania racjonalnych strategii projektowania typów komórek, a także substratów polimerowych w celu ułatwienia ukierunkowanego wzrostu komórek i regeneracji neuronów. Jest to niezbędny krok w kierunku zastosowania dostarczania czynników terapeutycznych za pomocą komórek macierzystych przed szeroko zakrojonymi badaniami przedklinicznymi in vivo z wykorzystaniem strategii przeszczepu komórek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłaty za publikację tego artykułu wideo zostały pokryte przez Molecular Devices, LLC.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundusze na te badania zostały zapewnione przez US Army Medical Research and Materiel Command (nr konta grantowego W81XWH-11-1-0700) oraz Stem Cell Research Fund. PAB i EMP były laureatami Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweGreiner Bio One655090Płytki 96-dołkowe wybrane do użycia w
albuminie surowicy bydlęcej ImageXpress (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)A9647
Przeciwciało anty-Ki67 królikaAbcam (Cambridge, MA)Ab16667rozcieńczenie 1:200
Kolagen typu ISigma-Aldrich (St. Louis, MO)C7661Kolagen z ogona
DAPIInvitrogen (Carlsbad, Kalifornia)D3571
Osioł anty-królik Cy3Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) 711-165-152Rozcieńczenie 1:500
ECL(Entaktyna-Kolagen-Laminina)Milipore/Chemicon (Temecula, CA)08-110
Surowica bydlęca płodu (FBS)Hyklon (Logan, UT)SH30071.03
Surowica koniHyclon (Logan, UT)SH3007403
Sklep chemiczny etanolu(Ames, IA)12003510100%, 200 proof
FibronektynaFisher Scientific (Hampton, NH)CB-40008
Iscove' s Zmodyfikowany Hyklon Dulbeccos Medium (IMDM)(Logan, UT)SH30396.03
KH2PO4Fisher Scientific (Hampton, NH)P285Dla bufora PO4
K2HPO4Fisher Scientific (Hampton, NH)P288Dla buforu PO4
L-glutaminyGibco/Invitrogen (Grand Island, NY)25030-081
Laminine (mysz)Trevigen (Gaithersburg, MD)3400-010-01
Mysie MSCs dorosłych myszy C57BL/6Tulane Cent do terapii genowej (Nowy Orlean, LA)Izolowany ze szpiku kostnego
Genetycznie modyfikowane MSC (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)Komórki te uzyskano z naszego poprzedniego badania: Ye i in. (w przygotowaniu)
Normalna surowica osła (NDS)Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) 017-000-121
Paraformaldehyd (PFA)Fisher Scientific (Hampton, NH)O40424% PFA w 0,1 M buforze PO4
Penicylina-StreptomycynaSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P0781
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4417
Poli-L-lizynaSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4707
Jodek propidyny (PI)Invitrogen (Carlsbad, CA)P1304MP
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)X100
Trypsyna 0,05% (EDTA 1x)Invitrogen (Carlsbad, CA)25300-054
Zmodyfikowany Ilbecco's MediumInvitrogen (Carlsbad, Kalifornia)12440– 046
FBS z kwalifikacją Hybridoma(Logan, UT)SH30396.03
Hyklon surowicy koni(Logan, UT)SH3007403
Urządzenia ImageXpress MicroMolecular (Sunnyvale, Kalifornia)System badań przesiewowychImageXpress micro
MetaXpress 4.0(Sunnyvale, Kalifornia)MetaXpress 4.0Akwizycja i analiza obrazu oprogramowanie
szczuraHyclon o wysokiej zawartościUrządzenia molekularne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
  2. Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
  3. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
  4. Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
  5. Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
  6. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
  7. Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
  8. Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
  9. Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
  10. Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
  11. Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
  12. Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
  13. Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
  14. Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
  15. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
  16. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
  17. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
  18. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
  19. Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
  20. Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
  21. Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
  22. Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
  23. Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
  24. Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzysteprzesiewanie wysokoprzepustowewektory lentiwirusaneurotroficzny czynnik pochodzenia m zgowegoneurotroficzny czynnik pochodzenia z kom rek glejowychobrazowanie time lapsebarwienie jodkiem propidynyimmunoznakowanie Ki67test proliferacji kom rekanaliza migracji kom rek

Powiązane artykuły