Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Podsumowanie

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy. Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Streszczenie

Słuchowe komórki rzęsate znajdujące się w narządzie myszy Cortiego wykrywają i przekazują informacje dźwiękowe do ośrodkowego układu nerwowego. Mechanosensoryczne komórki rzęsate są ustawione w jednym rzędzie wewnętrznych komórek rzęsatych i trzech rzędach zewnętrznych komórek rzęsatych, które rozciągają się wzdłuż osi podstawnej do wierzchołkowej ślimaka. Opisana tutaj technika hodowli eksplantatów zapewnia skuteczną metodę izolowania i utrzymywania eksplantatów ślimakowych z zarodka ucha wewnętrznego myszy. Ponadto morfologia i charakterystyka molekularna czuciowych komórek rzęsatych i nieczuciowych komórek podporowych w kulturach eksplantatów ślimaka przypomina te obserwowane in vivo i mogą być badane w wewnętrznym środowisku komórkowym. Eksplantaty ślimaka mogą służyć jako ważne narzędzia eksperymentalne do identyfikacji i charakterystyki szlaków molekularnych i genetycznych, które są zaangażowane w specyfikację komórkową i modelowanie. Chociaż transgeniczne modele myszy stanowią skuteczne podejście do badań nad ekspresją genów, znaczna liczba mutantów myszy umiera podczas rozwoju embrionalnego, utrudniając w ten sposób analizę i interpretację fenotypów rozwojowych. Narząd Cortiego od zmutowanych myszy, które umierają przed urodzeniem, można hodować, aby można było przeanalizować ich rozwój in vitro i reakcje na różne czynniki. Dodatkowo opisujemy technikę elektroporacji embrionalnych eksplantatów ślimaka ex vivo, która może być wykorzystana do obniżenia lub nadekspresji określonych genów oraz analizy ich potencjalnej funkcji endogennej i przetestowania, czy określony produkt genu jest konieczny lub wystarczający w danym kontekście, aby wpłynąć na rozwój ślimaka ssaków^1-8.

Wprowadzenie

Ssaczy organ Cortiego składa się z mozaiki wyspecjalizowanych typów komórek, w tym dwóch typów mechanosensorycznych komórek rzęsatych, a także co najmniej czterech typów niesensorycznych komórek wspomagających, co czyni go idealnym systemem modelowym do badania normalnych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, specyfikacja losu, różnicowanie i wzorcowanie. Ponadto prawidłowy rozwój tych różnych typów komórek jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania słuchu. Dlatego tak ważne jest zrozumienie czynników, zarówno molekularnych, jak i komórkowych, które regulują ich rozwój. Jednak niewielki rozmiar ślimaka myszy oraz jego niedostępność stanowią szczególne wyzwanie dla badań nad ekspresją genów. Co więcej, większość zdarzeń związanych ze specyfikacją losu komórki i wzorcami ma miejsce w okresach embrionalnych i w większości przypadków kończy się przed urodzeniem. Dlatego identyfikacja i charakterystyka zdarzeń sygnalizacyjnych w okresach embrionalnych jest niezbędna do uzyskania wglądu w molekularne podstawy morfogenezy ślimaka.

Tutaj demonstrujemy metodę hodowli nienaruszonego ślimaka in vitro z embrionalnych uszu wewnętrznych myszy. Uzasadnieniem zastosowania tej techniki jest to, że hodowane ślimaki zachowują swoje cechy molekularne i morfologiczne, zapewniając tym samym cenny model do badania potencjalnych genów kandydujących i badania mechanizmów związanych z morfogenezą ślimaka. Chociaż myszy transgeniczne mogą być wykorzystywane do badań nad ekspresją genów, system in vitro jest często potrzebny do monitorowania określonych funkcji genów. Co więcej, na podstawie transgenicznych zarodków myszy można stworzyć posiewy ślimakowe, aby badać ich rozwój in vitro i reakcję na różne rozpuszczalne czynniki i antagonistów. Chociaż w tym protokole wykorzystuje się zarodki w dniu 13 (E13), posiewy od E12 lub E14 do wczesnych postnatalnych uszu wewnętrznych mogą dać podobne wyniki.

Prezentujemy również technikę transferu genów w hodowanych embrionalnych eksplantatach ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Po wyizolowaniu eksplantatów ślimaka, elektroporacja może być wykorzystana do ekspresji plazmidów DNA interesujących genów w poszczególnych komórkach w przewodzie ślimakowym. Technika ta służy jako uzupełniające podejście do badań z wykorzystaniem myszy transgenicznych w celu uzyskania wglądu w szlaki molekularne leżące u podstaw fenotypu komórkowego. Za pomocą tej metody transferu genów transfekowane są różne typy komórek nabłonkowych w ślimaku embrionalnym, co umożliwia analizę utraty i wzmocnienia funkcji na poziomie pojedynczej komórki. Ponadto badania elektrofizjologiczne można również przeprowadzić w hodowlach eksplantatów ślimaka⁸. Ta metoda elektroporacji in vitro jest stosunkowo prosta i nieskomplikowana, w połączeniu z minimalnym uszkodzeniem tkanki, spowodowała szybki rozwój tej techniki.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły z użyciem żywych zwierząt muszą być sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i muszą być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi metodami opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie preparacje powinny być wykonywane techniką sterylną na czystym stole z przepływem laminarnym. Podczas tej procedury należy nosić rękawiczki i maskę, jeśli to konieczne.

1. Sekcja embrionalnego ucha wewnętrznego myszy

1. Przygotowanie do narządów kultur eksplantatów Cortiego:
   1. Wysterylizuj kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, włączając światło UV na około 30 minut i zdezynfekuj powierzchnię 70% etanolem przed użyciem. Ponadto przed użyciem należy wysterylizować wszystkie narzędzia do preparacji, w tym drobne narzędzia do preparowania i naczynia pokryte powłoką Sylgard do sekcji zarodków w autoklawie lub przez namoczenie w 70% etanolu przez co najmniej 20 minut. Przed użyciem odlej 70% etanolu i pozostaw naczynia i instrumenty do wyschnięcia na powietrzu w czystej, czystej ławce z przepływem laminarnym.
   2. Przygotować sterylną mieszaninę Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)/(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (HEPES) mieszaniny, dodając 10% 10x HBSS i 0,5% HEPES i dostosować pH do około 7,2 i przefiltrować, wysterylizować końcowy roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić wszystkie sekcje w schłodzonym roztworze HBSS/HEPES, aby lepiej zachować tkankę przez cały czas trwania zabiegu.
   3. Pokryj naczynia ze szklanym dnem matrycą membrany podstawnej, dodając 5 ml zimnego (4 °C) sterylnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do 300 μl podwielokrotności matrycy błony podstawnej w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Wymieszać przez wirowanie zawartości i dodać 150 μl mieszaniny macierzy błony podstawnej i DMEM do środka każdej naczyń hodowlanej, tak aby pokryła całą kulturę dobrze obecną w środku naczynia. Przykryj naczynia i przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 45 minut przed użyciem.
   4. Wlej 4-5 ml schłodzonego HBSS do trzech sterylnych polistyrenowych szalek Petriego i pozostaw zamknięte w kapturze.
   5. Przygotować pożywkę hodowlaną w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, dodając 9 ml DMEM, 100 μl suplementów N2, 10 g/ml Cipro i 1 ml FBS.
2. Izolacja zarodków:
   UWAGA: W tej procedurze hodowli eksplantatów ślimaka od myszy zarodkowych, uszy wewnętrzne należy pobrać z 13 dni zarodkowych kości skroniowych dnia (E), przy czym dzień po zapłodnieniu uważa się dzień po zapłodnieniu za E1⁹. Protokół może być również stosowany w przypadku embrionalnych uszu wewnętrznych myszy, począwszy od E12 do E18.
   1. Poddaj eutanazji mysz w ciąży w czasie za pomocą CO₂ i uśmierc zwierzę poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub odpowiednie zatwierdzone protokoły. Przeprowadzić eutanazję z dala od okapu do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność w pomieszczeniu do hodowli tkankowych.
   2. Umieść uśpioną mysz na ręczniku papierowym brzuchem skierowanym do góry i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.
   3. Otwórz jamę brzuszną, chwytając skórę zakrzywionymi kleszczami jedną ręką, a drugą ręką przetnij naskórek i mięśnie wzdłuż linii środkowej nożyczkami. Wykonaj dwa prostopadłe nacięcia po obu stronach i ostrożnie wyciągnij macicę, podnosząc obustronne rogi macicy za pomocą kleszczy i odłącz je od spodu tkanki łącznej za pomocą nożyczek.
   4. Umieścić łańcuch embrionalny na szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny (mieszanina HBSS/HEPES) i przenieść na czystą ławkę z przepływem laminarnym.
   5. Ostrożnie usunąć zarodki z łożyska i umieścić je na jednej ze sterylnych szalek Petriego zawierających roztwór preparacyjny. Jeśli roztwór stanie się krwawy, przenieś je na nową szalkę Petriego.
      UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być klasyfikowane za pomocą przewodnika oceny stopnia zaawansowania Theilera.
   6. Odetnij zarodki, szczypiąc okolice szyi parą czystych kleszczy lub nożyczek i umieść głowy na świeżej szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny.
3. Rozwarstwienie ucha wewnętrznego:
   1. Umieść jedną główkę zarodka w sterylnym naczyniu sylgardowym zawierającym zimną sekcję
   2. rozwiązanie. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym przy powiększeniu ~1,6X, unieruchamiaj głowę zarodka, umieszczając szpilki Minutiena wokół lub bliżej okolicy oka (ryc. 1A).
   3. Używając dwóch par sterylnych kleszczy, ostrożnie usuń skórę i otwórz czaszkę po stronie grzbietowej wzdłuż linii środkowej (ryc. 1B). Na tym etapie można zidentyfikować usunięcie mózgu z jamy czaszkowej i uszu wewnętrznego znajdujących się w kościach skroniowych (ryc. 1C, D). Wyściółka naczynia krwionośnego, która zwykle znajduje się wokół ucha wewnętrznego, może być wykorzystana jako punkt orientacyjny do identyfikacji ucha wewnętrznego na tym etapie (ryc. 1D).
   4. Wypreparuj ucho wewnętrzne od kości skroniowych, umieszczając kleszcze pod tkanką i izolując ucho wewnętrzne od podstawy czaszki i przenosząc do nowego naczynia zawierającego zimny roztwór preparacyjny (ryc. 1E, F).

2. Generacja narządów kultur eksplantatów Cortiego

UWAGA: Na tym etapie rozwoju, tkanka jest chrzęstna i może być łatwo wypreparowana za pomocą kleszczy.

1. Ustaw ucho wewnętrzne tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry (ryc. 2A) i ustabilizuj ucho wewnętrzne, delikatnie wkładając ostry koniec szpilek Minutiena przez przedsionkową część ucha wewnętrznego (ryc. 2B).
2. Za pomocą ultracienkich kleszczyków rozetnij leżącą nad nim chrząstkę, wykonując nacięcie za pomocą jednego końca kleszczy w pobliżu owalnego okienka i ostrożnie usuń chrząstkę ze ślimaka (ryc. 2C).
   UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że kleszcze nie są włożone zbyt głęboko w chrząstkę, ponieważ leżąca nad nią chrząstka jest czasami zrośnięta z przewodem ślimakowym, w takim przypadku pomocne jest użycie zamkniętych kleszczy w celu uwolnienia chrząstki z leżącego poniżej przewodu ślimakowego poprzez skrobanie pod powierzchnią chrząstki. Na tym etapie rozwoju spirala ślimakowa ma tylko trzy czwarte długości obrotu.
3. Następnie odsłoń nabłonek czuciowy, umieszczając kleszcze w preferowanym obszarze przewodu ślimakowego, u podstawy lub na samym wierzchołku, i delikatnie wyciągając dach ślimaka (ryc. 2D).
   UWAGA: Dach ślimaka musi zostać całkowicie usunięty, ponieważ może on zamaskować nabłonek czuciowy, utrudniając analizę.
   UWAGA: Tę procedurę należy wykonać delikatnie, ponieważ łatwo jest rozerwać nabłonek czuciowy.
4. W ostatnim kroku ostrożnie usuń leżącą pod spodem tkankę łączną z odsłoniętego nabłonka czuciowego, tak aby podstawa eksplantatu ślimaka była jednolicie płaska.
5. Odizoluj wypreparowany ślimak od przedsionkowej części ucha wewnętrznego za pomocą kleszczy. Można to zrobić przed lub po kroku 2.4 (Rysunek 2E).
6. Przenieś wypreparowany nabłonek czuciowy ślimaka do studzienki pokrytej matrycą błony podstawnej za pomocą sterylnej szpilki o średnicy 1,5 mm (ryc. 2F).
7. Ustawić eksplant ślimakowy tak, aby powierzchnia światła nabłonka była skierowana do góry i odessać roztwór macierzy błony podstawnej-DMEM, aby ostrożnie spłaszczyć tkankę i zastąpić ją 150 μl świeżej pożywki hodowlanej, delikatnie dodając do naczynia. Należy zadbać o to, aby każdy eksplant dobrze przylegał do szkiełka nakrywkowego ze szkła powlekanego i nie unosił się w pożywce hodowlanej. Upewnij się, że końcówka kleszczy jest skierowana do góry podczas mocowania do szklanki, aby uniknąć uszkodzenia eksplantatu ślimakowego.
8. Delikatnie przenieść szalkę hodowlaną do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 150 mm i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez żądany okres czasu, zwykle 3-6 dni in vitro (DIV). Po 1 DIV zbadaj kultury pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że eksplant ślimaka dobrze przylega do naczynia hodowlanego.
9. Po inkubacji in vitro przez żądany okres czasu, kultury są przetwarzane do immunohistochemii.
   UWAGA: Kultury eksplantatów są zwykle inkubowane przez 6 DIV, co jest równoważne stadium rozwojowemu P0. Po inkubacji in vitro kultury można przetworzyć do dalszych zastosowań, takich jak immunohistochemia (Figura 3B), RT-PCR, hybrydyzacja in situ i / lub western blot.

3. Transfer genów za pośrednictwem elektroporacji

1. Przygotowanie do elektroporacji:
   1. Wysterylizuj jedno szklane naczynie o średnicy 100 mm pokryte Sylgardem przez autoklawowanie lub moczenie w 70% etanolu przez około 20 minut i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w czystej ławce przed użyciem.
   2. Przygotuj DNA z wybranego wektora ekspresyjnego przy użyciu odpowiednich zestawów do przygotowania maxi lub midi. Wektory ekspresji używane w tym protokole to pIRES2-Atoh1.EGFP i pCLIG-NeuroD1.EGFP. Końcowe stężenie DNA powinno wynosić co najmniej 1 μg/μl w sterylnej wodzie wolnej od DNA/RNAzy.
2. Elektroporacja DNA w embrionalnych eksplantatach ślimaka:
   1. Dodać 10 μl plazmidowego roztworu DNA do świeżego naczynia pokrytego powłoką Sylgarda o średnicy 100 mm i przenieść całkowicie wypreparowany eksplant ślimakowy (uzyskany z kroku 2.5) do roztworu DNA.
   2. Powierzchnią świetlną nabłonka skierowaną do góry lekko przechyl ślimak tak, aby był prostopadły do płaszczyzny naczynia.
   3. Umieść łopatki elektrod po obu stronach ślimaka z ujemną łopatką (katodą) w kierunku nabłonka czuciowego i dodatnią łopatką (anodą) znajdującą się w sąsiedztwie podstawy ślimaka.
      UWAGA: Ponieważ DNA jest naładowane ujemnie, migruje z elektrody ujemnej do dodatniej oraz poprzez umieszczenie końca katody sondy w sąsiedztwie nabłonka czuciowego; DNA będzie w większości przechodzić przez powierzchnię nabłonka czuciowego.
   4. Za pomocą elektroporatora dostarczyć od 9 do 10 impulsów o napięciu 24 mV, czasie trwania impulsu 30 ms, za pomocą przełącznika nożnego na elektroportorze, a następnie dodać 100 μl ciepłej pożywki hodowlanej do elektroporowanego ślimaka.
   5. Powtórzyć kroki 3.2.1-4 dla wszystkich eksplantatów ślimaka i dla DNA wszystkich genów będących przedmiotem zainteresowania, a następnie przenieść ślimaki poddane elektroporacji do naczynia pokrytego matrycą błony podstawnej w celu posiewu (krok 2.7). Hoduj wszystkie elektroporowane ślimaki w inkubatorze z wilgotnością 37 °C i 5% CO₂ przez żądany okres czasu, który następnie zostanie przetworzony do immunocytochemii.
      UWAGA: Ślimak z całego miotu myszy CD1 (około 8-12 młodych) można wyizolować, poddać mikrosekcji, elektroporacji i posiać w ciągu <4 godzin.

4. Analiza kultur eksplantatów ślimaka

UWAGA: Kultury są zazwyczaj inkubowane dla 6 DIV, co jest równoznaczne z etapem rozwojowym, P0. Po inkubacji in vitro kultury są utrwalane i przetwarzane do immunocytochemii.

1. Po upływie pożądanej długości inkubacji należy usunąć pożywkę hodowlaną i szybko przepłukać eksplant ślimaka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować w 4% paraformaldehydzie (przygotowanym w PBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
2. Umyj utrwalacz, dodając PBS i płucz w PBS trzy razy przez 15 minut.
3. Przepuszczalność za pomocą PBS-T (PBS + 0,5% Tween) przez 30 minut przed zablokowaniem PBS-T zawierającym 10% koziej surowicy.
4. Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w PBS-T z 1% surowicą kozią przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Umyj ślimak trzy razy w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T po 15 minut przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexą.
6. Ponieważ eksplant ślimakowy jest hodowany na szklanym szkiełku nakrywkowym, można się z nim obchodzić indywidualnie, izolując szkiełko nakrywkowe od naczynia i montując go na szkiełku. Można to osiągnąć, mocząc naczynie hodowlane w rozpuszczalniku OS30 przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Za pomocą sterylnej żyletki odczep szkiełko nakrywkowe od naczynia i zamontuj na szkiełku podstawowym i zobrazuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

Opisujemy metodę izolowania ślimaka od embrionalnych uszu wewnętrznych i mikropreparacji w celu odsłonięcia nabłonka czuciowego. Po wypreparowaniu można go posiać i wyhodować jako nienaruszony przewód ślimakowy (ryc. 3) i przeanalizować za pomocą immunohistochemii. Hodowane eksplantaty ślimaka stanowią użyteczny test do badania wpływu różnych rozpuszczalnych czynników i leków farmakologicznych na rozwój ślimaka. Po przeprowadzeniu sekcji eksplantatów ślimaka można zastosować technikę elektroporacji do bł...

Dyskusja

Wszystkie komórki w błoniastym błędniku ucha wewnętrznego myszy, w tym neurony czuciowe, nieczuciowe i spiralne neurony zwojowe, pochodzą z otocysty pochodzącej z placodalnie położonej w sąsiedztwie tyłomózgowia ektodermy, około E8^10-14. W E11 brzuszny obszar otocysty rozciąga się, tworząc przewód ślimakowy, a wraz z postępem rozwoju grupa komórek nabłonkowych w ślimaku, a także w innych regionach otocysty, zostaje określona jako łaty prosensoryczne, które następnie dadzą początek różnym typom mechanosensorycz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże	Gibco	12430-054
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10082
Suplement N-2 (100x)	Gibco	17502-048
Chlorowodorek cyprofloksacyny	Cellgro	61-277-RF
Naczynie szklane 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Naczynie szklane 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Szpilki Minutien	Fine Science Tools	26002-15
Kleszcze Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10
Generator impulsów	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Naczynia hodowlane ze szklanym dnem	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrix	BD Biosciences	356237
Naczynie hodowlane, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Naczynia do hodowli tkankowych	Greiner Bio-one	639160
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Probówki stożkowe, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Miozyna 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Miozyna 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200