Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Podsumowanie

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Streszczenie

Badania nad chorobami układu oddechowego zazwyczaj obejmują wykorzystanie modeli mysich jako systemów zastępczych. Istnieją jednak znaczne różnice fizjologiczne między mysim a ludzkim układem oddechowym, zwłaszcza w górnych drogach oddechowych (URT). W niektórych modelach te różnice w mysiej jamie nosowej mogą mieć znaczący wpływ na postęp choroby i jej prezentację w dolnych drogach oddechowych (LRT) podczas stosowania technik wkraplania donosowego, potencjalnie ograniczając przydatność modelu mysiego do badania tych chorób. Z tych powodów korzystne byłoby opracowanie techniki wkraplania bakterii bezpośrednio do płuc myszy w celu zbadania choroby LRT przy braku udziału URT. Nazwaliśmy tę specyficzną dla płuc technikę dostarczania intubacją za pośrednictwem intubacji (IMIT). Ta nieinwazyjna technika minimalizuje możliwość wkraplania do krwiobiegu, co może wystąpić podczas bardziej inwazyjnych tradycyjnych chirurgicznych infekcji dotchawiczych i ogranicza możliwość przypadkowego dostarczenia do przewodu pokarmowego. IMIT jest dwuetapowym procesem, w którym myszy są najpierw intubowane, z etapem pośrednim w celu zapewnienia prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy, a następnie wprowadzaniem igły do cewnika, aby pośredniczyć w bezpośrednim dostarczaniu bakterii do płuc. Takie podejście ułatwia >98% skuteczność dostarczania do płuc przy doskonałej dystrybucji odczynnika w całym płucu. W związku z tym IMIT reprezentuje nowatorskie podejście do badania choroby LRT i dostarczania terapeutycznego bezpośrednio do płuc, poprawiając możliwość wykorzystania myszy jako substytutów do badania chorób układu oddechowego u ludzi. Co więcej, dokładność i powtarzalność tego systemu dostarczania sprawia, że jest on również podatny na Standardy Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLPS), a także dostarczanie szerokiej gamy odczynników, które wymagają wysokiej wydajności dostarczania do płuc.

Wprowadzenie

Myszy były używane do modelowania licznych objawów chorób ludzkich, w tym niezliczonych chorób układu oddechowego. Zastępcze modele chorób często nie są w stanie odtworzyć wszystkich aspektów modelowanej choroby, zwykle z powodu ważnych różnic fizjologicznych lub immunologicznych w dwóch modelach gospodarza. W związku z tym celem ulepszenia systemów modelowych jest opracowanie podejść, które pozwolą surogatom na dokładniejsze odzwierciedlenie procesu chorobowego lub odpowiedzi gospodarza obserwowanej w pierwotnym systemie gospodarza. Istnieje kilka kluczowych różnic fizjologicznych między myszami a ludźmi w mechanizmie, za pomocą którego inspirują powietrze. Do różnic tych zaliczają się znaczące różnice ratiometryczne w wielkości między URT a LRT. Szacuje się, że myszy mają >100 razy większą powierzchnię URT w porównaniu z ludźmi, znormalizowaną w stosunku do całkowitej pojemności płuc^1,2. W ten sposób małżowiny nosowe myszy pozwalają na bardziej rozległe filtrowanie wdychanego powietrza, aby ułatwić znacznie większe tempo oddychania, co może mieć znaczący wpływ na badania nad zapaleniem płuc, jeśli infekcja jamy nosowej odgrywa znaczącą rolę w postępie choroby.

Zastosowano kilka różnych podejść do wszczepiania bakterii do płuc myszy w celu zbadania chorób układu oddechowego podobnych do ludzkich. Najczęstszym z tych podejść jest inokulacja donosowa, w której płynną zawiesinę nakłada się na jedno lub oba nozdrza myszy. Chociaż jest to stosunkowo proste, zastrzeżenia, takie jak objętość wkraplania i rodzaj zastosowanego znieczulenia, mogą wpływać na skuteczność wkraplania do LRT poprzez inokulację donosową^3-5. W szczególności Miller i wsp. wykazały, że donosowe wkroplenie Francisella tularensis w objętości mniejszej niż 50 μl nie spowodowało wkroplenia bakterii do LRT⁶. Ponadto zaobserwowali lepsze wkraplanie LRT podczas stosowania wziewnego izofluranu w przeciwieństwie do wstrzykiwanej ketaminy/ksylazyny do znieczulenia. Jednak nasze doświadczenia z inokulacją donosową Yersinia pestis wskazują, że można osiągnąć bardziej konsekwentną inokulację przy użyciu ketaminy/ksylazyny w porównaniu z izofluranem (MBL, dane niepublikowane). Różnice te można przypisać zastosowanemu patogenowi lub różnicom w procedurach laboratoryjnych, ale co ważne, podkreślają potencjalną zmienność tej techniki. Co więcej, płuca pobrane wkrótce po wkropleniu donosowym pokazują, że stosunkowo niewielki odsetek początkowego inokulum bakteryjnego dociera do płuc (w przypadku Y. pestis tylko 10% zostało odzyskanych 1 godzinę po wkropleniu⁷), co sugeruje, że duża liczba bakterii może zostać zatrzymana w URT (lub połknięta do przewodu pokarmowego). W niektórych modelach chorobowych to znaczne odkładanie się bakterii na błonie śluzowej URT może zaburzyć nasze rozumienie postępu choroby, jeśli organizm jest zdolny do kolonizacji mysiej jamy nosowej w sposób niezgodny z chorobą człowieka. Na przykład, stosując obrazowanie in vivo, zaobserwowano, że Burkholderia pseudomallei, która nie kolonizuje ludzkiego URT, powoduje przytłaczającą oportunistyczną infekcję mysiej jamy nosowej, gdy jest dostarczana metodą wkraplania donosowego⁸.

Inne metody wszczepiania bakterii do płuc myszy również zostały wykorzystane w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Jednak w porównaniu z wkraplaniem donosowym, metody te zwykle wymagają większej wiedzy technicznej i/lub drogiego sprzętu, nie eliminując przy tym możliwości inicjacji infekcji w wielu miejscach (np. aerozol [URT i LRT]; przezustne [przewód pokarmowy i LRT]; oraz chirurgiczne dotchawicze [LRT i krwiobieg]). Biorąc pod uwagę potencjalne powikłania, które mogą być związane z wtórnymi miejscami infekcji, staraliśmy się opracować podejście dotchawicze, które omija URT i dostarcza patogen bezpośrednio do płuc znieczulonych myszy, ale także ogranicza niezamierzone inokulację do krwiobiegu lub przewodu pokarmowego. W tym celu opracowano intubację dotchawiczą (IMIT) jako procedurę niechirurgiczną, która gwarantuje wkroplenie inokulum LRT poprzez włączenie etapu pośredniego w celu sprawdzenia prawidłowego umieszczenia cewnika przed wkropleniem. Metoda ta jest opisana przy użyciu wkraplania barwnika w celu wizualnego zademonstrowania szerokiego rozmieszczenia inokulum w płucach oraz wkraplania P. aeruginosa w celu wykazania wysoce skutecznego dostarczania (>98% inokulum) tej metody do płuc. Co ważne, chociaż pierwotnie opracowany do dostarczania bakterii, IMIT oferuje również skuteczne narzędzie do: i) wkraplania różnych cząsteczek do badania innych modeli chorób układu oddechowego, ii) dostarczania terapeutycznego specyficznego dla płuc oraz iii) podstawowych badań funkcji płuc, w tym celowanego dostarczania siRNA do płuc.

Protokół

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Louisville (protokół # 13-056) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (protokół # 13-064).

1. Przygotowanie barwnika

1. Rozcieńczyć 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue w PBS i wysterylizować filtrem za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μM.

2. Przygotowanie kultury Pseudomonas aeruginosa

1. 15 godzin przed wkropleniem zaszczepić 3 ml kultury bulionowej pojedynczą kolonią bakteryjną.
2. Hoduj kulturę przez 15 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (200 obr./min).
3. Odwirować 1 ml kultury w 1,5 ml probówce do mikrofuge 12 000 x g przez 30 sekund.
4. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
5. Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny bakteryjnej w stosunku 1:10 w PBS i zmierzyć OD₆₀₀ rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej w celu określenia stężenia bakterii.
6. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w PBS do pożądanego stężenia inokulum bakteryjnego, używając objętości 50 μl do inokulacji IMIT.

3. Wkraplanie IMIT

1. Umieść grupę myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia izofluranem i znieczulenie za pomocą 2-3% mieszaniny izofluranu i tlenu.
2. Na początkowym początku sedacji należy oczyścić mysz, trzymając ją w pozycji pionowej, i podać 10 μl 2% roztworu lidokainy za pomocą igły do tylnej części gardła i pozwolić, aby roztwór spłynął do nagłośni. Wróć mysz do komory anestezjologicznej.
   1. Odczekaj co najmniej 5 minut, aby lidokaina mogła w pełni zadziałać jako środek znieczulający miejscowo.
3. Gdy myszy osiągną pożądany poziom uspokojenia (częstość oddechów ~60 uderzeń na minutę), zmniejsz izofluran do 2%, aby utrzymać uspokojenie.
4. Wstępnie załaduj barwnik lub inokulum bakteryjne do gazoszczelnej, precyzyjnej strzykawki o pojemności 250 μl z igłą igłą o długości 22 G.
   1. Najpierw pobrać 150 μl powietrza, odmierzonego za pomocą teflonowego tłoka strzykawki. Następnie pobrać 50 μl inokulum, przesuwając teflonowy tłok od oznaczenia 150 μl do oznaczenia 200 μl na korpusie strzykawki.
      UWAGA: Gdy próbka zostanie wyrzucona do zaintubowanej myszy, najpierw zostanie dostarczona zawiesina o objętości 50 μl, a następnie poduszka powietrzna o pojemności 150 μl, która rozprowadzi inokulum po całym płucu.
5. Wyjmij jedną mysz z komory indukcyjnej i połóż się na wznak na platformie intubacyjnej. Przymocuj mysz do platformy, zaczepiając jej siekacze za pomocą O-ringu przymocowanego do paska na rzep i mocując rzep do platformy. Podnieś mysz do kąta nachylenia 45°.
6. Za pomocą aplikatora z mikro bawełny cofnij język ruchem toczącym, używając dominującej ręki.
7. W przypadku ręki niedominującej użyj otoskopu operacyjnego dopasowanego do wziernika intubacyjnego, aby zarówno utrzymać retrakcję języka, jak i uwidocznić głośnię.
8. Ręką dominującą użyj przewodu prowadzącego przewleczonego przez cewnik 20 G, aby zaintubować mysz, osadzając cewnik na głębokość 10 mm w tchawicy myszy (cewnik jest wyposażony w silikonową osłonę z odsłoniętym cewnikiem o średnicy 10 mm). Usuń otoskop/wziernik.
9. Upewnij się, że mysz została prawidłowo zaintubowana, zabezpieczając cewnik ręką niedominującą, jednocześnie krótko podłączając przezroczystą rurkę Luer o długości 1/16" zawierającą kolorowy barwnik.
   UWAGA: Barwnik będzie szybko migrował tam iz powrotem w odpowiedzi na oddychanie.
10. Nie należy wykonywać kolejnych kroków, jeśli w tym momencie nie ustalono potwierdzenia intubacji. Jeśli próba intubacji nie powiodła się, zresetuj cewnik i przewód doprowadzający na jedną dodatkową próbę intubacji.
    UWAGA: Niewskazane jest podejmowanie więcej niż dwóch prób intubacji myszy podczas jednej sesji bez spowodowania urazu myszy.
11. Kontynuuj zabezpieczanie cewnika ręką niedominującą, jednocześnie wkładając precyzyjną strzykawkę/igłę zawierającą płynną zawiesinę/poduszkę powietrzną.
12. Dozuj płyn/powietrze bezpośrednio do płuc jednym ruchem płynu i natychmiast wyjmij igłę/cewnik z myszy.
13. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej dojść do siebie po znieczuleniu.

4. Charakterystyka dostawy IMT

1. Po wkropleniu IMIT należy poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO₂ w odpowiednim czasie po zaszczepieniu.
2. Zabezpiecz uśpioną mysz na desce sekcyjnej i namocz klatkę piersiową i brzuch 70% EtOH za pomocą butelki ze spryskiwaczem.
3. W przypadku oceny rozmieszczenia czynnika obrazującego w płucach, należy usunąć płuca zwierzęcia za pomocą sterylnej techniki i wyświetlić płuca zgodnie z potrzebami obrazowania.
   UWAGA: Płuca mogą być przygotowane do dodatkowych technik barwienia histologicznego poprzez odpowiednie utrwalenie lub krioprezerwację.
4. W przypadku oceny obciążenia bakteryjnego zakażoną tkanką płucną należy usunąć płuca zwierzęcia za pomocą sterylnej techniki. Umieść płuca w sterylnej, wstępnie zważonej torbie na próbki o pojemności 1 uncji. Zważyć i zanotować masę worka na próbkę + płuc.
   1. Dodać 1 ml sterylnego 1x PBS do każdej torebki na próbkę + chusteczki. Ponownie zamknąć worek na próbki.
   2. Homogenizować tkanki, delikatnie tocząc pipetę serologiczną o pojemności 25 ml po worku na próbkę + tkanka.
   3. Wytwarzać seryjne rozcieńczenia homogenatu płucnego w sterylnym PBS i płytce na płytce agarowej (LB lub odpowiednio do badanej grupy bakterii):
      1. Przeprowadzić sześciokrotne seryjne rozcieńczenie na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie wielokanałowo rozszczepić próbki na płytce agarowej.
   4. Inkubować płytki agarowe przez noc w temperaturze 37 °C i wyliczyć jednostki tworzące kolonie następnego dnia.

Wyniki

Aby zwizualizować rozkład podanego materiału za pomocą metody IMIT, do płuc znieczurzonej myszy wprowadzono 50 µl 0,1% barwnika Coomassie Brilliant Blue. Mysz została natychmiast uśmiercona, a płuca usunięto podczas sterylnej nekropsji. Rycina 1 pokazuje, że barwnik został dostarczony do wszystkich płatów płuc.

Aby określić liczbę bakterii dostarczonych do płuc za pomocą metody IMIT, trzem grupom myszy (n = 3) podano wlewem trzy różne stężenia P. aeruginosa (1.21 x 10⁸, 1.21x10⁷ oraz 1.21 x 10⁶ jednostek tworzących kolonie [CFU] w 50 µl). Bezpośrednio po wykonaniu wlewu IMIT myszy poddano eutanazji, wyjęto płuca, a następnie policzono bakterie i porównano ich liczbę z dawką inokulum (Rycina 2). Dostarczenie inokulum tą metodą jest wysoce efektywne, przy czym z płuc zwierząt po wlewie odzyskano >98% inokulum. Ponadto wlew IMIT był wysoce powtarzalny, niezależnie od stężenia inokulum (R² = 0.9951).

Rysunek 1: Instylacja IMIT rozprowadza inokulum w całych płucach. Płuca myszy, którym winstylowano 50 µl 0,1% Coomassie Brilliant Blue, wykazują rozmieszczenie niebieskiego barwnika we wszystkich płatach.

Rysunek 2: Instylacja bakterii do płuc metodą IMIT. Myszy poddano instylacji P. aeruginosa, a liczbę bakterii wprowadzonych do płuc (Log₁₀ CFU – odzyskane) porównano z szacowanym inokulum (Log₁₀ CFU – podane). Każde koło reprezentuje CFU/płuco poszczególnej myszy (n = 3 dla każdej dawki bakterii).

Dyskusja

Wkraplanie IMIT oferuje kluczowe ulepszenia istniejących modeli chorób układu oddechowego w zakresie zdolności do powtarzalnego wkraplania odczynników bezpośrednio do płuc. Jest to szybkie podejście, które idealnie nadaje się dla zespołu dwóch badaczy, z których jeden zarządza logistyką znieczulenia i klatki, a drugi wykonuje technikę IMIT. Duże badania można przeprowadzać za pomocą IMIT ze średnim zaangażowaniem czasowym wynoszącym 2 - 3 minuty na mysz. Ponieważ podejście to wykorzystuje izofluran jako środek znieczulający, myszy szybko wracają do zdrowia po znieczuleniu, skracając czas hodowli zwierząt poprzez powrót do zdrowia.

Najtrudniejszym technicznie aspektem metody IMIT jest początkowy etap intubacji myszy. Osoby uczące się wykonywania IMIT są w stanie skupić się na tym pierwszym etapie zakładania cewnika i upewnieniu się, że intubacja została osiągnięta poprzez wizualne potwierdzenie ruchu barwnika. Zaletą tego podejścia jest to, że wkroplenie specyficzne dla płuc jest gwarantowane dzięki zastosowaniu potwierdzenia intubacji, co zwiększa pewność siebie zarówno nowego badacza, jak i eksperta próbującego zaintubować trudne zwierzę. Kluczowymi elementami optymalizacji prawdopodobieństwa udanej intubacji są: i) osiągnięcie głębokiej sedacji, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu pracy, ii) prawidłowe umieszczenie wzierników w jamie ustnej, aby umożliwić dobrą wizualizację nagłośni, iii) dobre umiejscowienie wzierników na głębokości, tak aby język pozostał cofnięty przez cały czas trwania zabiegu, oraz iv) wykorzystanie platformy uchylnej do podparcia rąk badacza, aby zabieg był prowadzony zrelaksowany i ze stałym podejściem.

Jedno z ograniczeń procedury IMIT jest związane z częstotliwością zakraplania IMIT. Ze względu na potencjalny uraz związany z pominiętą intubacją, nie zaleca się przeprowadzania więcej niż dwóch prób intubacji podczas jednej sesji (do dwóch nieudanych prób). IMIT ma doskonały potencjał pod względem zdolności do stosowania do dostarczania leków do płuc mysich, jednak schematy terapeutyczne, które wykorzystują bardzo częste dostarczanie odczynnika do płuc, mogą nie być odpowiednie dla IMIT. Możliwe, że IMIT może być używany codziennie do dostarczania odczynników do płuc myszy bez powodowania znacznego urazu, ale tylko wtedy, gdy jest przeprowadzany przez wysoko wykwalifikowanego badacza, ponieważ uważa się, że większość urazów związanych z intubacją jest związana z pominiętą intubacją. Taki IMIT o wysokiej częstotliwości powinien być omówiony z lokalnymi lekarzami weterynarii i IACUC.

Dodatkowym potencjalnym ograniczeniem IMIT jest rozmiar myszy, która jest intubowana. Opisana powyżej procedura IMIT została opracowana na myszach o masie około 17 - 22 g, przy czym stwierdzono, że cewnik 20 G ma odpowiedni rozmiar dla tchawicy myszy w tym zakresie wielkości. Większe cewniki są z powodzeniem stosowane u starszych myszy; początkowy rozwój IMIT wykorzystywał cewnik 18 G u myszy BALB/c o masie >20 g. Co ważne, jeśli stosowane są cewniki o alternatywnych rozmiarach, należy zaopatrzyć się w igły, które pasują do światła cewnika i są przycinane do długości wystającej zaledwie 1 mm poza końcówkę cewnika. Intubacja myszy mniejszych niż 17 g może być możliwa, ale nie jest zalecana ze względu na wymaganą wiedzę specjalistyczną i wymagałaby użycia mniejszych cewników i wzierników niż opisane powyżej.

Oprócz P. aeruginosa użyliśmy IMIT do dostarczania kilku patogenów układu oddechowego, w tym B. pseudomallei⁹ i Klebsiella pneumoniae¹⁰. Model IMIT poczynił ważne postępy w naszych badaniach nad chorobą układu oddechowego B. pseudomallei , identyfikując, że inokulacja donosowa powoduje wczesną, związaną z URT zachorowalność myszy, a nie punkt końcowy choroby ogólnoustrojowej obserwowany w chorobie u ludzi⁹. B. pseudomallei jest wybranym czynnikiem poziomu 1 o wpływie na obronę biologiczną i w związku z tym opracowywane są modele chorób układu oddechowego dla ekspozycji na aerozole, które modelują potencjalną drogę wejścia związaną z obroną biologiczną dla uzbrojonych patogenów. Ponieważ obecne modele aerozolowe powodują zakażenie zarówno URT, jak i LRT, te same potencjalne fenotypy wczesnej zachorowalności, które zidentyfikowaliśmy dla donosowego modelu choroby układu oddechowego B. pseudomallei , mogą mieć zastosowanie do modelu aerozolowego. Przyszłą adaptacją modelu IMIT może być dostarczanie aerozolu za pośrednictwem intubacji (IMAD), w którym myszy są intubowane w celu dostarczenia aerozolu docelowego tylko do płuc. Obecnie dostępne są respiratory mechaniczne do podtrzymywania znieczulenia izofluranem, które można dostosować do dostarczania prowokacji patogenami w aerozolu, a nie na bazie płynu.

IMIT został początkowo opracowany jako podejście do optymalizacji dostarczania bakterii do płuc, ale ma również zastosowanie do dostarczania innych odczynników do płuc myszy. Jak omówiono powyżej, donosowe dostarczanie związków do myszy powoduje niską wydajność, wysoce zmienne dostarczanie odczynników do docelowego narządu płuc. Donosowe podawanie odczynników do obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) do płuca myszy przyniosło 40% skuteczność dostarczania¹¹, podczas gdy wykazaliśmy, że IMIT stanowi doskonałą alternatywę dla innych metod dostarczania do płuc dzięki skuteczności dostarczania >98% i dystrybucji wielopłatowej. Ta poprawa w zakresie celowanego dostarczania do płuc może potencjalnie zwiększyć powtarzalność dostarczania terapeutycznego w leczeniu chorób płuc. IMIT może w podobny sposób przynieść korzyści w badaniach: i) wpływu środowiskowych czynników drażniących płuca, ii) badań fenotypowych raka płuc, iii) specyficznego dla płuc knock-downu siRNA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gryzoń, uchylny stojak roboczy	Hallowell EMC	000A3467	Podstawa powinna być odłączona podczas pracy w głowicy
otoskopu operacyjnego	Bateria Welch Allyn	21700
Otoskop 3,5 V Li	Welch Allyn	71900
Wziernik do intubacji myszy krótki, autoklawowalny	Hallowell EMC	200A3589S Pętle
siekacze	Hallowell EMC	210A3490A Bawełniany
aplikator z cienką końcówką	Puritan	871-PC DBL	Służy do cofania języka
Cewnik dożylny, 20 G	Exel Int	26741	Opcjonalnie: załóż silikonową tuleję z odsłoniętą powierzchnią cewnika 10 mm
Gazoszczelna strzykawka, 250 ul	Hamilton	81120	Służy do dostarczania płynnego inokulum za pomocą IMIT
igła, 22 G	Hamilton	91022	Przyciąć na długość, aby wystawać 1 mm z cewnika 20 G
Drut doprowadzający (drut światłowodowy, 0,5 mm)	TheFiberOpticStore.com	FOF .50	Cięte na długość 6": używany jako drut doprowadzający do intubacji
Strzykawka tuberkulinowa, 1 ml	Becton Dickinson	309659	Montaż z przewodem światłowodowym jako przewodem doprowadzającym
Brilliant Blue R (Coomassie)	Rurka Sigma	B0149
Tygon, 1/16"	Saint Gobain	ALC00002
Mężczyzna Luer 1/16" zadzior	Cole Parmer	45503-22
Żeński Luer 1/16" zadzior	Cole Parmer	45500-00
Lidokaina, USP	Spectrum	LI102	pH lidokainy do roztworu przy 2% (w/v) pH7.0
Worek na próbki, 1 uncja	Whirl-Pak	B01067
U-bottom 96-dołkowa płytka, sterylna	Greiner	650161

BSC