Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Podsumowanie

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B. Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Streszczenie

B immunoglobuliny limfocytów ciężkiego łańcucha ciężkiego (IgH) rekombinacja przełącznika (CSR) to proces, w którym początkowo wyrażona IgM przełącza się na inne izotypy IgH, takie jak IgA, IgE i IgG. Pomiar IgH CSR in vitro jest kluczową metodą badania wielu procesów biologicznych, począwszy od rekombinacji i naprawy DNA, a skończywszy na aspektach immunologii molekularnej i komórkowej. Metody in vitro Test CSR obejmuje pomiar powierzchni Ig metodą cytometrii przepływowej na aktywowanych komórkach B. Podczas gdy pomiar podklas IgA i IgG jest prosty, pomiar IgE tą metodą jest problematyczny ze względu na rozpuszczalne wiązanie IgE z FcεRII/CD23 ulegające ekspresji na powierzchni aktywowanych limfocytów B. W tym miejscu opisujemy unikalną procedurę dokładnego pomiaru mysich komórek B wytwarzających IgE, które przeszły CSR w hodowli. Metoda opiera się na rozszczepianiu kompleksów IgE-CD23 za pośrednictwem trypsyny na powierzchni komórek, co pozwala na wykrycie komórek linii B wytwarzających IgE za pomocą barwienia cytoplazmatycznego. Procedura ta stanowi wygodne rozwiązanie do analizy cytometrii przepływowej CSR do IgE.

Wprowadzenie

Podczas rekombinacji przełącznika (CSR) klasy ciężkiego łańcucha immunoglobuliny (IgH) u myszy i ludzi, eksony IgH μ stałego regionu (Cμ) są usuwane i zastępowane przez jeden z kilku zestawów dalszych_{eksonów o}stałym regionie (CH, s) (np. Cγ, Cε i Cα), co powoduje przejście z produkcji IgM na produkcję innych klas Ig (np. IgG, IgE lub IgA). CSR występuje w obszarach przełączania (S), które są sekwencjami 1-10 kb położonymi 5' do każdego zestawu C_H^{s 1}. Enzym deaminaza cytydyny indukowana aktywacją (AID) inicjuje CSR poprzez aktywność deaminacji cytydyny.

IgE jest kluczowym mediatorem choroby alergicznej², a lepsze zrozumienie, w jaki sposób IgE jest wytwarzane i regulowane, może otworzyć drzwi do nowych podejść terapeutycznych do choroby atopowej. U myszy i ludzi IgE jest najściślej regulowanym izotypem Ig. IgE jest zwykle wykrywana na poziomach tysiące razy niższych niż inne izotypy IgH³, ale może być bardzo podwyższona w stanach chorobowych⁴. Jednak CSR do IgE nie jest w pełni zrozumiały. Aktywacja in vitro limfocytów B za pomocą IL-4 w połączeniu z anty-CD40 lub LPS indukuje CSR zarówno do IgG1, jak i IgE⁵. Aktywowane limfocyty B wyrażają receptor IgE o niskim powinowactwie FcεRII/CD23^2,6, który wiąże rozpuszczalne IgE wydzielane w hodowli po CSR. Dlatego podczas analizy za pomocą cytometrii przepływowej komórki B z IgE związanymi z receptorem barwią się podobnie jak komórki B endogennie eksprymujące IgE⁷. Chociaż wiadomo, że mysie limfocyty B wyrażają receptor IgG o niskim powinowactwie FcγRIIB1 (CD32)⁸, z naszego doświadczenia wynika, że nie wydaje się, aby przeszkadzało to w pomiarze przejścia klasy na IgG1. Jednak podczas pomiaru przełączania IgE po aktywacji limfocytów B w hodowli, niespecyficzne IgE związane powierzchniowo mogą zaciemniać analizę. W przypadku typowych metod barwienia komórki bez ekspresji IgE barwią się dodatnio na obecność IgE.

Opisana tutaj jest strategia, która została wykorzystana do przeprowadzenia testów CSR i wykrycia prawdziwych limfocytów B z ekspresją IgE od myszy ^9-11. Traktowanie aktywowanych limfocytów B trypsyną, powszechnym odczynnikiem laboratoryjnym do trawienia białka, usuwa zarówno cytofilowe, jak i związane z błoną powierzchniową IgE. Późniejsza przepuszczalność i barwienie cytoplazmatycznych IgE ujawnia zatem prawdziwe komórki wytwarzające IgE.

Protokół

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj eksperymenty były zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i zatwierdzone przez Animal Research Children's Hospital (ARCH), Boston, Massachusetts.

1. Przygotowanie odczynników

1. 1,000x IL-4 Stock: Rozcieńczyć cytokinę IL-4 do 20 μg/ml w_H2Olub 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dozować 200 μl podwielokrotności do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. 1,000x anty-CD40: Uzyskać od producenta w stężeniu 1,0 mg/ml, przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Pożywka do stymulacji limfocytów B: Do 425 ml pożywki RPMI-1640 dodać 75 ml świeżo rozmrożonej płodowej surowicy cielęcej (FCS), 10 ml 1,0 M buforu HEPES, 5 ml bulionu L-glutaminy, 5 ml bulionu penicylina: Streptomycyna, 5 ml minimalnej ilości niezbędnych pożywki dla aminokwasów endogennych (MEM-NEAA) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu. Utrzymuj podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Dodać IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) bezpośrednio przed użyciem tylko do wymaganej objętości podłoża.
4. 2% bufor FCS-FACS: Dodaj 10 ml FCS do 490 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. 2x roztwór trypsyny-EDTA: Rozcieńczyć 5 ml 10x roztworu podstawowego trypsyna-EDTA (5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA na litr) w 20 ml 1x PBS. Przechowywać trypsynę-EDTA w 2 porcjach roboczych w temperaturze 4 °C. Przed użyciem pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
6. Surowica cielęca płodu: Rozmrożony FCS należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Umieścić na lodzie 15 minut przed zabiegiem barwienia cytoplazmatycznego.
7. Formalina buforowana obojętnie: Przygotuj 10% roztwór formaliny (3,7% paraformaldehydu). Formalina jest toksyczna, dlatego należy obchodzić się z nią pod laboratoryjnym wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej. Przechowuj formalinę w temperaturze pokojowej w szafie do przechowywania chemikaliów.
8. Metanol: Przechowuj metanol bezwzględny (100%) w temperaturze -20 °C, aż komórki będą gotowe do przepuszczalności. Należy pamiętać, że metanol jest łatwopalny i powinien być przechowywany w odpowiedniej zamrażarce.

2. Oczyszczanie i aktywacja komórek B

1. Ze świeżo pobranej śledziony myszy przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie przeciskając narząd przez sitko o wielkości 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. W stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zebrać komórki w 10 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
2. Zdekantować supernatant i zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przez 5 min. Zneutralizować 13,5 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 min.
3. (Opcjonalnie) Oddziel magnetycznie komórki B za pomocą kulek znakowanych anty-CD45R(B220), postępując zgodnie z protokołem oczyszczania MACS zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Stymulować oczyszczone limfocyty B w stężeniu 1,0 x 10⁶ komórek/ml w podgrzanej pożywce do stymulacji komórek B zawierającej IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1,0 μg/ml) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Rozpocząć od 8 ml kultury podzielonej na 2 dołki 6-dołkowej płytki hodowlanej (po 4 ml każda).
5. Sprawdzaj hodowlę codziennie, aby utrzymać ją na poziomie 1,0 x 10⁶ komórek/ml. Dostosuj stężenie, dzieląc się na inne dołki i rozcieńczając kulturę pożywką stymulacyjną komórek B zawierającą świeżą IL-4 i anty-CD40.

3. Trypsynizacja, fiksacja i przepuszczalność

1. Trypsynizacja
   1. Zebrać maksymalnie 1,0 x 10⁷ hodowanych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant.
   2. Przemyć 10 ml PBS w celu usunięcia pozostałości białka z pożywki komórkowej. Powtórzyć etap wirowania i zdekantować supernatant.
   3. Zawiesić osad komórkowy w objętości pozostałej po dekantacji (około 100 μl).
   4. Ostrożnie dodaj do komórek 800 μl 0,1% (2x) trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej. Dozuj powoli pod kątem 45° wzdłuż boku stożkowej tuby.
   5. Zamknij probówkę i delikatnie wymieszaj, przechylając probówkę tak, aby płyn płynął wzdłuż rurki 5-6 razy. W roztworze może tworzyć się żylasty, biały osad. Ogranicz czas trypsynizacji do mniej niż minuty.
   6. Ugasić reakcję trypsynizacji 1 ml zimnego FCS. Natychmiast rozcieńczyć FCS, dodając 10 ml zimnego PBS.
   7. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, następnie zdekantować supernatant i ponownie umieścić probówki w lodzie.
2. Utrwalenie
   1. Ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości po dekantacji. W razie potrzeby zwiększyć objętość do 100 μl zimnym PBS.
   2. W dygestorium dodać 800 μl 10% neutralnego buforowanego roztworu formaliny do komórek i pipetować w górę iw dół. Rurka ogrzeje się po dodaniu formaliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
3. Przepuszczalność
   1. Ustaw stołowy mikser wirowy z delikatną prędkością potrząsania.
   2. Pobrać 9 ml zimnego (-20 °C) metanolu do pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
   3. Przytrzymaj probówkę zawierającą komórki nad mieszalnikiem wirowym i delikatnie zacznij potrząsać komórkami.
   4. Dodaj zimny metanol do probówki, aby spadał kroplami na komórki, podczas gdy rurka nadal się trzęsie, tak aby metanol stale się mieszał. Po pierwszych 2 ml metanolu prędkość dozowania można zwiększyć do wolnego strumienia.
   5. Pozostaw rurkę na lodzie na 30 minut, aby zakończyć przepuszczalność. Alternatywnie ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.

4. Barwienie fluorescencyjne dla przełączania klas IgG1 i IgE

1. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut i zdekantować roztwór metanolu. Biały osad może osadzać się z komórkami.
2. Dodać 10 ml o temperaturze pokojowej 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w celu przepłukania komórek. Powtórz raz. Uwaga: Mycie granulatu PBS w temperaturze pokojowej rozpuszcza dodatkowy osad, który może powstać po kroku 4.1.
3. Wykonać dodatkowe płukanie 10 ml 2% buforu FCS-FACS.
4. Rozprowadzić próbki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i umieścić płytkę na lodzie.
5. Wybarwić w 60 μl 2% buforu FCS-FACS na studzienkę następującymi rozcieńczeniami przeciwciał: Anti-IgM RPE/Cy7, 1:200, Anti-IgG1 PE, 1:600, Anti-IgE FITC, 1:100, Anti-CD45R(B220) PerCP-Cy5.5, 1:200
6. Po 5 minutach barwienia przemyć płytkę 150 μl 2% buforu FCS-FACS i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.
7. Zawiesić ponownie w 400 μl 2% buforu FCS-FACS i pipetować przez sitko z komórek nylonowych o średnicy 40 μm do probówki FACS o pojemności 5 ml.

5. Użyj następującej strategii bramkowania:

1. Wyizoluj komórki CD45R (B220) dodatnie z populacji limfocytów blastingowych znajdujących się na powierzchni FSC / SSC (ryc. 1).
2. Z komórek B220 dodatnich użyj wykresu IgE i IgG1, aby ujawnić odpowiednie populacje.

Wyniki

Procedurę tę z powodzeniem zastosowano do badania CSR do IgE w komórkach B myszy. Aby wykazać skuteczność pomiaru CSR, stymulowano komórki B śledziony myszy przeciwciałem anty-CD40 oraz IL-4, zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹. Po pięciu dniach stymulacji komórki zebrano, poddano obróbce zgodnie z powyższym protokołem i wybarwiono przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko IgM, IgG1, IgE oraz B220 (CD45R). Po bramkowaniu limfocytów blastycznych (Rysunek 1) wyraźna populacja komórek IgE+ nie może...

Dyskusja

Stymulacja mysich komórek B śledziony w hodowli za pomocą anty-CD40 i IL-4 będzie symulować interakcje T pomocniczego typu 2 (T_H2), zachęcając do zmiany klasy na IgG1 i IgE⁵. Limfocyty B mogą być aktywowane do CSR w kontekście całkowitych splenocytów¹² lub jako oczyszczone komórki B śledziony¹¹. Jak zauważono w protokole (krok 2.3), wzbogacanie limfocytów B jest opcjonalne i zależy od uznania eksperymentatora, aby określić, czy byłoby to korzystne. Wykorzystuje się tutaj dodatn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciw myszym IgE FITC	BD Pharmingen	553415	klon R35-72
Szczur Przeciw myszom IgG1 PE	BD Pharmingen 550083		klon A85-1
Metanol	BDH	BDH1135-4LP	Utrzymuj w temperaturze -20 ° C
Filtr siatkowy Falcon Cell 40 & mikro; m Nylon	Corning	352340
Filtr siatkowy Falcon Cell 70 i mikro; m Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	klon RA3-6B2
anty-mysz/szczur CD40	eBioscience	16-0402-85	klon HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
Mikrokulki MACS CD45R (B220)	Miltenyi Biotec	130-049-501
Kolumna oczyszczająca MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Rozpuszcza się w wodzie lub 0,1%
roztworze formaliny BSA, neutralnie buforowany, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Roztwór trypsyny-EDTA (10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g trypsyny, 2,0 g EDTA• 4 Na litr 0,9% NaCl
Penicylina-Streptomycyna	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10 000 U Penicylina; 10 mg / ml Streptomycyna (100x)
L-glutamina 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-merkaptoetanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Bufor do lizy czerwonych krwinek	Sigma Aldrich	R7757
Szczurzy anty-mysi IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	klon 1B4B1
HyClone Płodowa surowica cielęca	Thermo	SH30910.03
Pożywka			do stymulacji komórek B Pożywka do stymulacji komórek B składa się z RPMI z płodową surowicą cielęcą (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamina,  1x Penicylina-Streptomycyna (penicylina: 100 U/ml, Streptomycyna: 100 &mikro; g/ml), beta-merkaptoetanol (7 &mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) i anty-CD40 (1 &mikro; g/ml)