Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Podsumowanie

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Streszczenie

Stabilność białek wpływa na wiele aspektów biologii, a pomiar kinetyki klirensu białek może dostarczyć ważnych informacji na temat systemów biologicznych. W eksperymentach FDAP można zmierzyć klirens białek w organizmach żywych. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym, wyrażanym in vivo i fotokonwertowanym, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany. Dane są następnie wyposażane w odpowiedni model klirensu w celu określenia okresu półtrwania białka. Co ważne, kinetykę klirensu populacji białek w różnych przedziałach organizmu można badać oddzielnie poprzez zastosowanie masek przedziałowych. Podejście to zostało wykorzystane do określenia wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych podczas rozwoju danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy protokół eksperymentów FDAP na zarodkach danio pręgowanego. Powinno być możliwe użycie FDAP do określenia kinetyki klirensu dowolnego białka dającego się oznaczyć w dowolnym optycznie dostępnym organizmie.

Wprowadzenie

Poziomy białek w komórkach i organizmach są determinowane przez ich tempo produkcji i klirens. Okres półtrwania białka może wynosić od kilku minut do dni^1-4. W wielu układach biologicznych stabilizacja lub klirens kluczowych białek ma istotny wpływ na aktywność komórkową. Modulacja wewnątrzkomórkowej stabilności białka jest wymagana do progresji cyklu komórkowego^5,6, sygnalizacji rozwojowej^7-9, apoptozy¹⁰ oraz prawidłowego funkcjonowania i utrzymania neuronów^11,12. Stabilność białek zewnątrzkomórkowych wpływa na dystrybucję i dostępność wydzielanych białek, takich jak morfogeny^13,14, w tkance.

W ciągu ostatnich kilku dekad, stabilność białek była głównie oceniana w hodowlach komórkowych za pomocą radioaktywnego znakowania impulsami lub eksperymentów z cykloheksymidem¹⁵. W takich eksperymentach z pogonią za impulsami komórki są albo przejściowo wystawione na "impuls" radioaktywnych prekursorów aminokwasów, które są włączane do nowo zsyntetyzowanych białek, lub są wystawione na działanie cykloheksymidu, który hamuje syntezę białek. Wyhodowane komórki są następnie zbierane w różnych punktach czasowych i stosuje się immunoprecypitację, po której następuje autoradiografia (w eksperymentach z radioaktywnym impulsem pościgowym) lub western blot (w eksperymentach z cykloheksymidem) w celu ilościowego określenia klirensu białka w czasie.

Konwencjonalne testy stabilności białek mają kilka wad. Po pierwsze, białka w tych testach często nie ulegają ekspresji w ich endogennym środowisku, ale raczej w kulturze tkankowej, a czasem w komórkach różnych gatunków. W przypadku białek, których stabilność jest zależna od kontekstu, podejście to jest problematyczne. Po drugie, nie jest możliwe śledzenie klirensu białek w poszczególnych komórkach lub organizmach w czasie, a dane z tych testów odzwierciedlają średnią z różnych populacji komórek w różnych punktach czasowych. Ponieważ poszczególne komórki mogły zaczynać z różnymi ilościami białka, mogły przyjąć znacznik radioaktywny lub cykloheksymid w różnym czasie lub mogą mieć różną kinetykę klirensu, takie zagregowane dane mogą być mylące. Wreszcie, w przypadku eksperymentów z cykloheksymidem, dodanie inhibitora syntezy białek może mieć niezamierzone skutki fizjologiczne, które mogą sztucznie zmienić stabilność białka^16-18. Tych niedociągnięć można uniknąć, stosując Fluorescencyjny Rozpad Po Fotokonwersji (FDAP), technikę, która wykorzystuje fotokonwertowalne białka do dynamicznego pomiaru klirensu białek w organizmach żywych^19-25 (patrz Dyskusja na temat ograniczeń techniki FDAP).

Białka fotokonwertowalne to białka fluorescencyjne, których właściwości wzbudzenia i emisji zmieniają się po ekspozycji na określone długości fal światła²⁶. Jednym z powszechnie stosowanych wariantów jest Dendra2, białko fotokonwertowalne "zielono-czerwone", które początkowo ma właściwości wzbudzenia i emisji podobne do białek zielonej fluorescencji, ale po ekspozycji na światło UV - "fotokonwersja" - jego właściwości wzbudzenia/emisji stają się podobne do tych z białek czerwonej fluorescencji^23,27. Co ważne, nowe białko wytworzone w wyniku fotokonwersji nie będzie miało takich samych właściwości wzbudzenia/emisji jak białko fotokonwertowane, co pozwoli na rozdzielenie produkcji i klirensu podczas fotokonwersji i obserwację tylko puli białka fotokonwertowanego. Znakowanie interesujących białek za pomocą białek fotokonwertowalnych zapewnia zatem wygodny sposób znakowania pulsacyjnego białek w nienaruszonych, optycznie dostępnych organizmach żywych.

W testach FDAP (Rysunek 1A), białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczane białkiem fotokonwertowalnym i ulega ekspresji w żywym organizmie (Rysunek 1B). Białko fuzyjne ulega fototransformacji, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1C). Dane są następnie dopasowywane do odpowiedniego modelu w celu określenia okresu półtrwania białka fuzyjnego (ryc. 1D).

Opisany tutaj test FDAP został zaprojektowany w celu określenia zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych w zarodkach danio pręgowanego podczas wczesnej embriogenezy¹⁹. Jednak podejście to można dostosować do dowolnego przezroczystego organizmu modelowego, który toleruje obrazowanie na żywo, i można je wykorzystać do monitorowania klirensu dowolnego możliwego do znakowania białka wewnątrzkomórkowego lub zewnątrzkomórkowego. Warianty opisanej tutaj techniki przeprowadzono na hodowanych komórkach^20,23 i zarodkach Drosophila²² oraz myszy²¹.

Protokół

1. Generowanie fotokonwertowalnego konstruktu fuzyjnego i wstrzykiwanie zdechorionowanych zarodków danio pręgowanego

1. Wygeneruj funkcjonalny konstrukt zawierający interesujące białko połączone z zielonym do czerwonego białka fotokonwertowalnym (patrz Dyskusja), a następnie użyj transkrypcji in vitro do wygenerowania ograniczonego mRNA kodującego białko fuzyjne, jak w Müller i in., 2012¹⁹.
2. Użyj pronazy, aby usunąć kosmówkę z około 30 zarodków danio pręgowanego w stadium jednokomórkowym. Alternatywnie, ręcznie dekorionować zarodki za pomocą kleszczy²⁸.
   Uwaga: Zarodki muszą zostać poddane dekorionacji w celu późniejszego obrazowania. W razie potrzeby zarodki mogą być wstrzykiwane przez kosmówkę i dekorionowane później, tuż przed obrazowaniem.
   1. Przygotować 5 mg/ml roztwór podstawowy pronazy ze Streptomyces griseus w standardowym pożywce dla zarodków danio pręgowanego¹⁹. Delikatnie kołysz roztworem w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby proteaza mogła się rozpuścić. Porcję 2 ml przelać do probówek do mikrowirówek i zamrozić w temperaturze -20 °C.
   2. Przenieść zarodki w stadium jednokomórkowym na szklaną lub pokrytą agarozą plastikową szalkę Petriego o średnicy 5 cm zawierającą ~8 ml pożywki dla zarodków. Dodać 2 ml rozmrożonego roztworu podstawowego pronazy do naczynia i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut.
   3. Unikaj wystawiania zarodków na działanie powietrza lub plastiku, ponieważ kontakt z którymkolwiek z nich spowoduje pęknięcie zarodków z dekorionacją. Napełnić szklaną zlewkę o pojemności 200 ml pożywką z zarodków. Przenieś zarodki do zlewki, przechylając szalkę Petriego, zanurzając ją jednocześnie w pożywce.
   4. Gdy zarodki osiądą na dnie zlewki, wylej większość pożywki dla zarodków, a następnie wlej świeżą pożywkę dla zarodków do zlewki. Łagodne wirowanie pożywki wlewającej się do zlewki powoduje, że zarodki tracą osłabioną kosmówkę.
   5. Powtórz krok 1.2.4.
3. Przenieść zdechorionowane zarodki do pokrytego agarozą naczynia iniekcyjnego²⁹ za pomocą szklanej pipety Pasteura z płomieniowaną końcówką. Płomienna końcówka pipety zapobiega uszkodzeniu zarodków przez postrzępione krawędzie.
4. Jednocześnie wstrzyknij mRNA i koniugat 3 kDa Alexa488-dekstran^29,30 (Figura 1B; patrz Dyskusja dla sugerowanych ilości mRNA i Alexa488-dekstranu). Wstrzyknąć bezpośrednio do środka komórki (nie do żółtka), aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mRNA i barwnika fluorescencyjnego po rozpoczęciu rozszczepienia.
   Uwaga: Sygnał Alexa488 zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wygenerowania masek komorowych w celu rozróżnienia fluorescencji wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej.
5. Przenieś wstrzyknięte zarodki do 1-2% pokrytego agarozą dołka z sześciodołkowego plastikowego naczynia wypełnionego pożywką dla zarodków. Inkubować w ciemności w temperaturze 28 °C, aż zarodki osiągną późne stadium^{kuli 31} (około 5 godzin po zapłodnieniu). Sprawdzaj zarodki co jedną do 2 godzin pod mikroskopem stereoskopowym i usuń wszelkie zanieczyszczenia powstałe przez zarodki, które obumarły.

2. Montaż zarodków danio pręgowanego do fotokonwersji i obrazowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym

1. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zidentyfikować od jednego do pięciu zdrowych zarodków i użyj szklanej pipety Pasteura z płomieniowaną końcówką, aby usunąć je z naczynia.
2. Delikatnie wyrzuć zarodki do probówki mikrowirówkowej zawierającej ~1 ml stopionej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x pożywce dla zarodków Danieau (patrz Lista materiałów) (Rysunek 2A).
   Uwaga: Agaroza powinna mieć temperaturę od 40 do 42 °C; Wyższe temperatury mogą uszkodzić zarodki.
3. Wciągnij zarodki z powrotem do pipety wraz z odrobiną agarozy. Delikatnie wyrzuć agarozę i zarodki na szkło nakrywkowe naczynia ze szklanym dnem (ryc. 2B). Upewnij się, że grubość szkła nakrywkowego jest zgodna z obiektywem w mikroskopie konfokalnym.
   1. W razie potrzeby ponownie użyj szklanej pipety. Aby usunąć resztki agarozy z pipety i zapobiec jej zatkaniu, należy szybko pipetować podłoże zarodkowe w górę iw dół. W tym celu umieścić probówkę o pojemności 15 ml wypełnioną ~5 ml pożywki zarodkowej obok mikroskopu stereoskopowego.
4. Użyj metalowej sondy, aby ustawić zarodki tak, aby słup zwierzęcy (blastoderma) był skierowany w stronę szkła nakrywkowego. Pracuj szybko, ponieważ agaroza zestala się w ciągu 20–30 sekund. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby monitorować położenie zarodków i w razie potrzeby dostosuj, aż agaroza stwardnieje.
5. Powtarzaj kroki 2.1–2.4, aż do zamontowania żądanej liczby zarodków.
   Uwaga: W typowym eksperymencie cztery krople agarozy zawierające cztery lub pięć zarodków każdy z łatwością zmieszczą się na szkle nakrywkowym. Podczas jednego idealnego eksperymentu można zobrazować około 16 zarodków (ryc. 2C).
6. Gdy agaroza zastygnie, napełnij naczynie ze szklanym dnem 1x pożywką dla zarodków Danieau.

3. Fotokonwersja i pomiar spadku sygnału fotokonwertowanego

Cel wodny 25X lub 40X jest odpowiedni dla wielkości i współczynnika załamania światła zarodków danio pręgowanego. Najlepiej jest używać olejku immersyjnego o takim samym współczynniku załamania światła jak woda, a nie rzeczywistej wody, ponieważ woda wyparuje w trakcie pięciogodzinnego eksperymentu. Upewnij się, że olejek immersyjny jest przeznaczony do użytku z obiektywem opartym na wodzie (nie na oleju).

1. Umieść dużą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie, aby upewnić się, że film olejowy między obiektywem a szkłem nakrywkowym nie pęknie, gdy stolik przesuwa się do różnych pozycji zarodka podczas obrazowania. Bezpiecznie umieść naczynie ze szklanym dnem na scenie, aby naczynie nie przesuwało się, gdy stage się porusza. Jeśli to możliwe, należy użyć podgrzewanego etapu w temperaturze 28 °C, która jest optymalna dla rozwoju danio pręgowanego.
2. Określ pozycję każdego zarodka w pakiecie oprogramowania mikroskopu konfokalnego. Dostosuj głębokość z dla każdego zarodka i spróbuj celować mniej więcej w tę samą płaszczyznę w każdym zarodku.
   Uwaga: Około 30 μm od słupa zwierzęcego to dobra głębokość, ponieważ na tej głębokości można uniknąć warstwy otaczającej zarodek, obszar obrazowania jest zmaksymalizowany, a rozpraszanie światła jest minimalne. Pojedyncza warstwa optyczna o grubości ~3,3 μm zapewnia wystarczającą ilość danych; nie ma potrzeby nabywania stosu Z (patrz sekcja 5).
3. Podczas eksperymentu zbierz dwa sygnały: "zielony" sygnał z koniugatu Alexa488-dekstran - który zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wyizolowania fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej - oraz "czerwony" sygnał z białka fuzyjnego po jego fotokonwersji.
   1. Wzbudz Alexa488 za pomocą lasera o długości fali 488 nm i zbierz emitowaną fluorescencję o długości fali od ~500 do 540 nm. Uwaga: Po fotokonwersji wiele białek fotokonwertowalnych z zielonego na czerwone (np. Dendra2) może być wzbudzanych laserem o długości fali 543 nm i emitować fluorescencję o długości fali od ~550 do 650 nm. W razie potrzeby dostosować w oparciu o użyte białko fotokonwertowalne.
4. Zdobądź obrazy "przed fotokonwersją" i skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu konfokalnego tak, aby obrazowało każdą z wcześniej zdefiniowanych pozycji (od kroku 3.2) z odpowiednimi warunkami obrazowania co 10 lub 20 minut przez pięciogodzinny kurs czasowy (patrz rozdział 5 i omówienie).
5. Aby fotokonwertować białko fuzyjne, przełącz się na obiektyw 10X i wystaw grupy zarodków na działanie światła UV z lampy rtęciowej z filtrem wzbudzenia ~300–400 nm przy 100% mocy przez 2 minuty. Przesuń ostrość wzdłuż osi z, aby zapewnić równomierną fotokonwersję (patrz sekcja 5). Upewnij się, że olejek immersyjny nie kapie na obiektyw 10x podczas fotokonwersji.
   Uwaga: Przesunięcie ostrości podczas fotokonwersji może być zautomatyzowane w celu uniknięcia zmienności wśród eksperymentatorów.
6. Przełącz się z powrotem na obiektyw 25X lub 40X natychmiast po konwersji zdjęć. Upewnij się, że poprzednio zdefiniowane pozycje z kroku 3.2 są nadal dokładne. Jeśli szalka przesunęła się podczas fotokonwersji, ponownie określ pozycje zarodków.
   1. Uruchom program utworzony w kroku 3.4 i pozwól na kontynuowanie obrazowania przez 5 godzin. Zwróć uwagę na czas, jaki upłynął między fotokonwersją a rozpoczęciem obrazowania dla każdego zarodka.
7. Od czasu do czasu sprawdzaj eksperyment. Monitoruj poziom pożywki Danieau i dodaj więcej, jeśli to konieczne. Uruchom ponownie oprogramowanie, jeśli utknęło w martwym punkcie.
8. W celu określenia wartości fluorescencji tła, które zostaną wykorzystane podczas analizy danych do oszacowania asymptoty wykładniczo malejącego modelu, należy uwzględnić w eksperymencie niektóre zarodki, którym wstrzyknięto Alexa488-dekstran, ale nie mRNA. Aby określić szum instrumentu, który zostanie również wykorzystany podczas późniejszej analizy danych, należy uzyskać obraz przy braku próbki.

4. Analiza danych za pomocą PyFDAP

1. Sprawdź wzrokowo zestawy danych przebiegu czasu z każdego zarodka. Odrzuć zestawy danych z zarodków, które zmarły podczas obrazowania, które uległy znacznemu przesunięciu, które mają bardzo niski poziom sygnału fotokonwertowanego lub które zawierają obszary komórek, które wyglądają nietypowo i przestały się poruszać i dzielić (typowe dla uszkodzonych lub chorych zarodków).
   Uwaga: Czasami bąbelki w olejku immersyjnym lub inne artefakty pojawiają się na jednym lub dwóch obrazach w zestawie danych, który w inny sposób nadaje się do użytku. Zwróć uwagę na wszystkie obrazy zawierające artefakty; Zostaną one później odrzucone, a pozostałe punkty czasowe z takiego zestawu danych nadal mogą być analizowane.
2. Użyj pakietu oprogramowania PyFDAP opartego na języku Python, aby przeanalizować dane FDAP. PyFDAP oblicza okresy półtrwania, określając średnią wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową intensywność czerwonej fluorescencji na każdym obrazie i dopasowując dane do wykładniczo malejącej funkcji⁵⁶ (Rysunek 3).
   1. Pobierz PyFDAP (patrz Lista materiałów).
   2. Użyj PyFDAP do oddzielenia wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego sygnału fotokonwertowanego (Figura 3A,B). Użyj sygnału Alexa488, który jest ściśle wewnątrzkomórkowy, aby stworzyć maskę wewnątrzkomórkową. Zastosuj tę maskę do odpowiedniego obrazu kanału czerwonego, aby zapobiec uwzględnianiu pikseli wewnątrzkomórkowych przy obliczaniu średniej intensywności zewnątrzkomórkowej. Aby zmierzyć średnią intensywność wewnątrzkomórkową, odwróć maskę.
   3. W programie PyFDAP wyświetl zamaskowane obrazy wygenerowane w kroku 4.2.2. Przyjrzyj się wzrokowo tym obrazom i odrzuć zestawy danych, w których maski nie odróżniają dokładnie przestrzeni wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej (powinno to być rzadkie; należy zauważyć, że błony komórkowe są zawarte w obrazach, na których przestrzeń zewnątrzkomórkowa została zamaskowana, ale można je usunąć, zmieniając algorytm progowania lub wprowadzając maskę błonową (np. za pomocą membrany-CFP)). Odrzuć również wszelkie pojedyncze obrazy zawierające artefakty (np. pęcherzyki w olejku immersyjnym) zidentyfikowane w kroku 4.1.
   4. Użyj PyFDAP, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej dla każdego obrazu. PyFDAP oblicza te średnie, sumując intensywności pikseli, które znajdują się poza maską i dzieląc je przez całkowitą liczbę zsumowanych pikseli.
   5. Dopasuj dane fluorescencji (rysunek 3C) do następującej funkcji wykładniczej:
      
      gdzie t to czas po fotokonwersji, c(t) to natężenie przy danej wartości t, c₀ to intensywność przy t = 0, k to stała szybkość klirensu, a y₀ to asymptota, do której funkcja zbliża się wraz ze spadkiem fluorescencji (rysunek 1D). Y₀ można ograniczyć na podstawie pomiarów w kroku 3.8¹⁹.
   6. Użyj PyFDAP, aby obliczyć okres półtrwania białek zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych (τ) na podstawie stałych szybkości klirensu (k) przy użyciu następującej zależności:
      

5. Eksperymenty kontrolne oceniające fotowybielanie, niezamierzoną fotokonwersję i jednorodność fotokonwersji

1. Ocena fotowybielania
   Uwaga: Fotowybielanie może powodować sztuczny spadek intensywności fluorescencji, który oprócz klirensu białka fluorescencyjnego odzwierciedla właściwości wybielające białka fluorescencyjnego.
   1. Aby ocenić możliwe fotowybielanie, należy wykonać jeden zestaw eksperymentów FDAP z 10-minutowymi odstępami między obrazowaniami, a drugi zestaw z 20-minutowymi odstępami między obrazowaniem (ryc. 4). Przeanalizuj dane z obu zestawów eksperymentów przy użyciu PyFDAP zgodnie z opisem w sekcji 4.
   2. Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów w odstępach 10 i 20 minut. Dłuższe okresy półtrwania z eksperymentów w odstępach 20 minut wskazują na znaczne fotowybielanie. Jeśli okresy półtrwania z obu eksperymentów są identyczne, fotowybielanie nie jest istotnym problemem.
   3. Alternatywnie, oceń fotowybielanie, uzyskując serię ~30 obrazów natychmiast po fotokonwersji. Znaczny spadek intensywności fluorescencji wskazuje na znaczne fotowybielanie.
   4. Jeśli zostanie wykryte fotowybielanie, użyj mniejszej mocy lasera, skróć czas obrazowania lub rozważ użycie bardziej fotostabilnego białka fotokonwertowalnego³².
2. Ocena niezamierzonej fotokonwersji.
   Uwaga: Dendra2 może być fotokonwertowany przy użyciu oświetlenia 488 nm²⁷. Podczas wzbudzania Alexa488 za pomocą lasera 488 nm, jak opisano w kroku 3.3.1, możliwa jest niezamierzona fotokonwersja, a tym samym sztuczne wydłużenie pozornego okresu półtrwania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak my^{i inni} odkryliśmy, że oświetlenie 488 nm jest nieefektywną metodą fotokonwersji w zarodkach danio pręgowanego.
   1. Użyj eksperymentu kontrolnego opisanego w kroku 5.1.1, aby wykryć niezamierzoną fotokonwersję. Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów w odstępach 10 i 20 minut. Krótsze okresy półtrwania z 20-minutowych eksperymentów interwałowych wskazują na znaczną niezamierzoną fotokonwersję. Jeśli okresy półtrwania z obu eksperymentów są identyczne, niezamierzona fotokonwersja nie jest istotnym problemem.
   2. W przypadku wykrycia niezamierzonej fotokonwersji należy użyć lasera o niższej mocy 488 nm i krótszych czasów obrazowania, aby uniknąć niezamierzonej fotokonwersji Dendra2.
3. Ocena jednorodności fotokonwersji.
   Uwaga: Jeśli fotokonwersja jest odchylona w kierunku zwierzęcego bieguna zarodka, na spadek fluorescencji będzie miała wpływ dyfuzja białek lub ruch komórek w głębszych płaszczyznach (ryc. 5A).
   1. Aby określić, czy fotokonwersja jest jednorodna, należy wyrazić wydzielane białko fotokonwertowalne (do eksperymentów z zewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi) lub cytoplazmatyczne białko fotokonwertowalne (do eksperymentów z wewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi). Fotokonwertuj jak zwykle, a następnie zdobądź stos z obejmujący większość blastodermy co 20 minut przez 80 minut.
   2. Jeśli fotokonwersja jest odchylona w kierunku bieguna zwierzęcego, intensywność fluorescencji w głębszych płaszczyznach wzrośnie z czasem z powodu dyfuzji lub ruchu komórek (ryc. 5B). Jeśli zostanie wykryta niejednorodna fotokonwersja, podczas fotokonwersji skup się głębiej w zarodkach.

Wyniki

FDAP został użyty do określenia okresu półtrwania białek sygnalizacji zewnątrzkomórkowej w zarodkach danio pręgowanego¹⁹. Jedno z tych białek, Squint, indukuje ekspresję genów mezendodermalnych podczas embriogenezy³⁴. Squint-Dendra2 aktywuje ekspresję genów mezendodermalnych na poziomach podobnych do nieoznakowanego Squint, jak wykazano za pomocą qRT-PCR i testów hybrydyzacji in situ ¹⁹. Zarodki zostały wstrzyknięte jednocześnie z Alexa488-dekstranem i mRNA kodującym Squint-Dendr...

Dyskusja

Powodzenie eksperymentu FDAP zależy od wytworzenia funkcjonalnego fotokonwertowalnego białka fuzyjnego. Znakowanie białka może wpływać na jego aktywność biologiczną i/lub właściwości biofizyczne, w tym na jego lokalizację, rozpuszczalność i stabilność^36-41. Przygotuj się na przetestowanie aktywności kilku różnych konstruktów fuzyjnych, aby znaleźć taki, który jest aktywny. Odkryliśmy, że zmiana położenia białka fotokonwertowalnego w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania lub użycie dłuższych ł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PyFDAP (do pobrania z następującej strony internetowej: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Zainstaluj i obsługuj zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie internetowej PyFDAP; PyFDAP jest kompatybilny z systemami operacyjnymi Linux, Mac i Windows.
mMessage mMachine Sp6 Zestaw do transkrypcji	Life Technologies	AM1340	Do generowania zakrytego mRNA do wstrzykiwań do zarodków
Koniugat Alexa488-dekstranu, 3 kDa	Life Technologies	D34682	Jednoczesne wstrzykiwanie z mRNA w celu stworzenia masek wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych
6-dołkowe plastikowe naczynie	BD Falcon		Inkubuj zarodki w studzienkach pokrytych agarozą, aż będą gotowe do montażu
Pożywka dla zarodków			250 mg/L Sól oceaniczna instant, 1  mg/L błękitu metylenowego w wodzie z odwróconej osmozy dostosowanej do pH 7 z NaHCO3
Proteaza z Streptomyces griseus	Sigma	P5147	Przygotować zapas 5 mg/ml i użyć w 1  mg/ml do dechorionacji zarodków w stadium jednokomórkowym
Szklana szalka			Do dechorionacji zarodków
Szklana zlewka			200 ml Do dechorionacji zarodków Aparatura
		mikroiniekcji	Do wstrzykiwania mRNA i barwnika do zarodków w stadium jednokomórkowym
Mikroskop stereoskopowy			Do wstrzykiwania i montowania zarodków
1x pożywka			Rozcieńczyć agarozę o niskiej temperaturze topnienia i przeprowadzić obrazowanie w tym podłożu; receptura: 0,2 mm przefiltrowany roztwór 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,3 mM CaCl2, 5  mM HEPES pH 7,2
UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520-100	Do montowania zarodków; stosować w stężeniu 1% w pożywce Danieau: dodać 200 mg do 20 ml pożywki Danieau, mikrofalować aż do rozpuszczenia, a następnie podwielokrotność 1  ml do probówek do mikrowirówek; Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C, ponownie stopiony w temperaturze 70  ° C i schłodzony do 40– 42 &stopnie; C gdy jest gotowy do użycia
Szklana pipeta Pasteura	Kimble Chase (przez Fishera)	63A53WT	Do montażu zarodków; podpal końcówkę, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków przez postrzępione krawędzie
Metalowa sonda			Do pozycjonowania zarodków podczas montażu
Naczynia ze szklanym dnem	MatTek	P35G-1.5-14-C	Użyj odpowiedniej grubości szkła nakrywkowego dla swojego celu; podany tutaj numer części dotyczy szkła nakrywkowego nr 1.5
Probówka 15 ml wypełniona ~5 ml pożywką zarodkową	BD Falcon		Do płukania resztek agarozy z pipety Pasteura
Odwrócony laserowy skaningowy mikroskop			Lampa rtęciowa, 488  Wymagany jest laser nm, laser 543 nm i odpowiednie zestawy filtrów
Etap			Aby utrzymać zarodki w optymalnej temperaturze 28 & stopni; C podczas eksperymentu
Oprogramowanie konfokalne zdolne do obrazowania			Musi być w stanie zdefiniować wiele pozycji i automatycznie je obrazować w określonych odstępach czasu
		wodny 25X lub 40X	Obiektyw do obrazowania
Obiektyw			Obiektyw do fotokonwersji
Olejek			immersyjny Olejek immersyjny o tym samym współczynniku załamania światła co woda