Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52266

⸱

28 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

W tym artykule

Podsumowanie

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Streszczenie

Stabilność białek wpływa na wiele aspektów biologii, a pomiar kinetyki klirensu białek może dostarczyć ważnych informacji na temat systemów biologicznych. W eksperymentach FDAP można zmierzyć klirens białek w organizmach żywych. Białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym, wyrażanym in vivo i fotokonwertowanym, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany. Dane są następnie wyposażane w odpowiedni model klirensu w celu określenia okresu półtrwania białka. Co ważne, kinetykę klirensu populacji białek w różnych przedziałach organizmu można badać oddzielnie poprzez zastosowanie masek przedziałowych. Podejście to zostało wykorzystane do określenia wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych podczas rozwoju danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy protokół eksperymentów FDAP na zarodkach danio pręgowanego. Powinno być możliwe użycie FDAP do określenia kinetyki klirensu dowolnego białka dającego się oznaczyć w dowolnym optycznie dostępnym organizmie.

Wprowadzenie

Poziomy białek w komórkach i organizmach są determinowane przez ich tempo produkcji i klirens. Okres półtrwania białka może wynosić od kilku minut do dni1-4. W wielu układach biologicznych stabilizacja lub klirens kluczowych białek ma istotny wpływ na aktywność komórkową. Modulacja wewnątrzkomórkowej stabilności białka jest wymagana do progresji cyklu komórkowego5,6, sygnalizacji rozwojowej7-9, apoptozy10 oraz prawidłowego funkcjonowania i utrzymania neuronów11,12. Stabilność białek zewnątrzkomórkowych wpływa na dystrybucję i dostępność wydzielanych białek, takich jak morfogeny13,14, w tkance.

W ciągu ostatnich kilku dekad, stabilność białek była głównie oceniana w hodowlach komórkowych za pomocą radioaktywnego znakowania impulsami lub eksperymentów z cykloheksymidem15. W takich eksperymentach z pogonią za impulsami komórki są albo przejściowo wystawione na "impuls" radioaktywnych prekursorów aminokwasów, które są włączane do nowo zsyntetyzowanych białek, lub są wystawione na działanie cykloheksymidu, który hamuje syntezę białek. Wyhodowane komórki są następnie zbierane w różnych punktach czasowych i stosuje się immunoprecypitację, po której następuje autoradiografia (w eksperymentach z radioaktywnym impulsem pościgowym) lub western blot (w eksperymentach z cykloheksymidem) w celu ilościowego określenia klirensu białka w czasie.

Konwencjonalne testy stabilności białek mają kilka wad. Po pierwsze, białka w tych testach często nie ulegają ekspresji w ich endogennym środowisku, ale raczej w kulturze tkankowej, a czasem w komórkach różnych gatunków. W przypadku białek, których stabilność jest zależna od kontekstu, podejście to jest problematyczne. Po drugie, nie jest możliwe śledzenie klirensu białek w poszczególnych komórkach lub organizmach w czasie, a dane z tych testów odzwierciedlają średnią z różnych populacji komórek w różnych punktach czasowych. Ponieważ poszczególne komórki mogły zaczynać z różnymi ilościami białka, mogły przyjąć znacznik radioaktywny lub cykloheksymid w różnym czasie lub mogą mieć różną kinetykę klirensu, takie zagregowane dane mogą być mylące. Wreszcie, w przypadku eksperymentów z cykloheksymidem, dodanie inhibitora syntezy białek może mieć niezamierzone skutki fizjologiczne, które mogą sztucznie zmienić stabilność białka16-18. Tych niedociągnięć można uniknąć, stosując Fluorescencyjny Rozpad Po Fotokonwersji (FDAP), technikę, która wykorzystuje fotokonwertowalne białka do dynamicznego pomiaru klirensu białek w organizmach żywych19-25 (patrz Dyskusja na temat ograniczeń techniki FDAP).

Białka fotokonwertowalne to białka fluorescencyjne, których właściwości wzbudzenia i emisji zmieniają się po ekspozycji na określone długości fal światła26. Jednym z powszechnie stosowanych wariantów jest Dendra2, białko fotokonwertowalne "zielono-czerwone", które początkowo ma właściwości wzbudzenia i emisji podobne do białek zielonej fluorescencji, ale po ekspozycji na światło UV - "fotokonwersja" - jego właściwości wzbudzenia/emisji stają się podobne do tych z białek czerwonej fluorescencji23,27. Co ważne, nowe białko wytworzone w wyniku fotokonwersji nie będzie miało takich samych właściwości wzbudzenia/emisji jak białko fotokonwertowane, co pozwoli na rozdzielenie produkcji i klirensu podczas fotokonwersji i obserwację tylko puli białka fotokonwertowanego. Znakowanie interesujących białek za pomocą białek fotokonwertowalnych zapewnia zatem wygodny sposób znakowania pulsacyjnego białek w nienaruszonych, optycznie dostępnych organizmach żywych.

W testach FDAP (Rysunek 1A), białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczane białkiem fotokonwertowalnym i ulega ekspresji w żywym organizmie (Rysunek 1B). Białko fuzyjne ulega fototransformacji, a spadek sygnału fotokonwertowanego w czasie jest monitorowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1C). Dane są następnie dopasowywane do odpowiedniego modelu w celu określenia okresu półtrwania białka fuzyjnego (ryc. 1D).

Opisany tutaj test FDAP został zaprojektowany w celu określenia zewnątrzkomórkowego okresu półtrwania wydzielanych białek sygnałowych w zarodkach danio pręgowanego podczas wczesnej embriogenezy19. Jednak podejście to można dostosować do dowolnego przezroczystego organizmu modelowego, który toleruje obrazowanie na żywo, i można je wykorzystać do monitorowania klirensu dowolnego możliwego do znakowania białka wewnątrzkomórkowego lub zewnątrzkomórkowego. Warianty opisanej tutaj techniki przeprowadzono na hodowanych komórkach20,23 i zarodkach Drosophila22 oraz myszy21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Tworzenie fotokonwertowalnego konstruktu fuzyjnego i wstrzykiwanie do zdechorionowanych zarodków rybki danio

  1. Przygotować funkcjonalny konstrukt zawierający białko docelowe połączone z fotokonwertowalnym białkiem zielono-czerwonym (patrz Dyskusja), a następnie przeprowadzić transkrypcję in vitro w celu otrzymania mRNA z czapeczką kodującego białko fuzyjne, zgodnie z opisem u Müller et al., 201219.
  2. Użyć pronazy do usunięcia chorionów z około 30 embrionów danio pręgowanego w stadium jednej komórki. Alternatywnie można przeprowadzić dechorionację embrionów ręcznie za pomocą pęsety28.
    Uwaga: Embriony muszą zostać poddane dechorionacji przed późniejszym obrazowaniem. Jeśli jest to pożądane, embriony można injektować przez chorion i przeprowadzić dechorionację później, bezpośrednio przed obrazowaniem.
    1. Przygotować roztwór zapasowy pronazy z Streptomyces griseus o stężeniu 5 mg/ml w standardowym medium dla embrionów danio pręgowanego19. Delikatnie mieszać roztwór na kołysarce w temperaturze RT przez 10 min, aby proteaza całkowicie się rozpuściła. Rozdzielić roztwór w aliquoty po 2 ml do probówek do mikrocentryfugi i zamrozić w temperaturze -20 °C.
    2. Przenieść embriony w stadium jednej komórki do szklanej lub powlekanej agarozą plastikowej szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej ~8 ml medium dla embrionów. Dodać do szalki 2 ml rozmrożonego roztworu zapasowego pronazy i inkubować w temperaturze RT od 5 do 10 min.
    3. Unikać wystawiania embrionów na działanie powietrza lub kontaktu z plastikiem, ponieważ oba te czynniki mogą spowodować pęknięcie zdechorionowanych embrionów. Napełnić szklany zlew o pojemności 200 ml medium dla embrionów. Przenieść embriony do zlewka, przechylając szalkę Petriego podczas zanurzania jej w medium.
    4. Po opadnięciu embrionów na dno zlewka odlać większość medium dla embrionów, a następnie wlać do zlewka świeże medium. Delikatny ruch wirowy powstający podczas wlewania medium do zlewka powoduje oddzielenie osłabionych chorionów od embrionów.
    5. Powtórzyć krok 1.2.4.
  3. Przenieść zdechorionowane embriony do powlekanej agarozą szalki do injekcji29 przy użyciu szklanej pipety Pasteura z opalonym końcem. Opalenie końcówki pipety zapobiega uszkodzeniu embrionów przez ostre krawędzie szkła.
  4. Współinjektować mRNA oraz koniugat Alexa488-dekstranu o masie 3 kDa29,30 (Rycina 1B; sugerowane ilości mRNA i Alexa488-dekstranu znajdują się w sekcji Dyskusja). Injektować bezpośrednio do centrum komórki (nie do żółtka), aby zapewnić równomierny rozkład mRNA i barwnika fluorescencyjnego po rozpoczęciu podziałów.
    Uwaga: Sygnał Alexa488 zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wygenerowania masek kompartymentacyjnych w celu odróżnienia fluorescencji wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej.
  5. Przenieść injektowane embriony do dołka plastikowej płytki sześciodołkowej powleczonego 1–2% agarozą i wypełnionego medium dla embrionów. Inkubować w ciemności w temperaturze 28 °C, aż embriony osiągną późne stadium sfery31 (około 5 h po zapłodnieniu). Kontrolować embriony co 1 do 2 h pod stereomikroskopem i usuwać wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku obumarcia embrionów.

2. Montowanie zarodków danio pręgowanego do fotokonwersji i obrazowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym

  1. Za pomocą stereomikroskopu zidentyfikować od jednego do pięciu zdrowych embrionów, a następnie użyć szklanej pipety Pasteura z wypaloną końcówką, aby przenieść je z naczynia.
  2. Delikatnie wprowadzić embriony do probówki do mikrocentryfugi zawierającej ~1 ml roztopionej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x pożywce dla embrionów Danieau (patrz Lista Materiałów) (Rysunek 2A).
    Uwaga: Temperatura agarozy powinna wynosić od 40 do 42 °C; wyższe temperatury mogą uszkodzić embriony.
  3. Wciągnąć embriony z powrotem do pipety wraz z niewielką ilością agarozy. Delikatnie nanieść agarozę i embriony na szkiełko nakrywkę naczynia z szklanym dnem (Rysunek 2B). Należy upewnić się, że grubość szkiełka nakrywkowego jest kompatybilna z obiektywem mikroskopu konfokalnego.
    1. W razie potrzeby można ponownie użyć szklanej pipety. Aby oczyścić pipetę z pozostałości agarozy i zapobiec zapchaniu, należy szybko kilkukrotnie pobrać i wypuścić pożywkę dla embrionów. W tym celu obok stereomikroskopu należy ustawić probówkę 15 ml wypełnioną ~5 ml pożywki dla embrionów.
  4. Użyć metalowej sondy, aby ustawić embriony tak, by biegun zwierzęcy (blastoderm) był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego. Należy pracować szybko, ponieważ agaroza krzepnie w ciągu 20–30 s. Za pomocą stereomikroskopu monitorować położenie embrionów i w razie potrzeby korygować je aż do stężenia agarozy.
  5. Powtarzać kroki 2.1–2.4 aż do zamontowania pożądanej liczby embrionów.
    Uwaga: W typowym eksperymencie na szkiełku nakrywkowym zmieści się bez problemu cztery krople agarozy, z których każda zawiera cztery lub pięć embrionów. Podczas jednego idealnego eksperymentu można zobrazować około 16 embrionów (Rysunek 2C).
  6. Po zastygnięciu agarozy wypełnić naczynie z szklanym dnem 1x pożywką dla embrionów Danieau.

3. Fotokonwersja i pomiar spadku sygnału po fotokonwersji

Do rozmiaru i współczynnika załamania światła zarodków zebrafish odpowiedni będzie obiektyw wodny 25X lub 40X. Najlepiej zastosować olej immersyjny o współczynniku załamania światła takim samym jak woda, zamiast samej wody, ponieważ woda odparowałaby w ciągu pięciogodzinnego eksperymentu. Należy upewnić się, że olej immersyjny jest przeznaczony do stosowania z obiektywem wodnym (a nie olejowym).

  1. Nanieś dużą kroplę olejku imersyjnego na obiektyw, aby upewnić się, że film olejowy między obiektywem a szkiełkiem podstawowym nie zostanie przerwany podczas przemieszczania stolika do różnych pozycji zarodków w trakcie obrazowania. Stabilnie umieść naczynko z szklanym dnem na stoliku, aby nie przesunęło się ono podczas ruchu stolika. Jeśli to możliwe, użyj podgrzewanego stolika ustawionego na 28 °C, co jest temperaturą optymalną dla rozwoju zebrafish.
  2. Zdefiniuj pozycję każdego zarodka w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Dostosuj głębokość z dla każdego zarodka, starając się celować mniej więcej w tę samą płaszczyznę w każdym z nich.
    Uwaga: Głębokość około 30 μm od bieguna zwierzęcego jest odpowiednia, ponieważ na tym poziomie można uniknąć warstwy otaczającej zarodek, maksymalizując obszar obrazowania i minimalizując rozproszenie światła. Pojedynczy przekrój optyczny o grubości ~3.3 μm dostarcza wystarczających danych; nie ma potrzeby pozyskiwania stosu z (z-stack) (patrz Sekcja 5).
  3. Podczas eksperymentu zbierz dwa sygnały: sygnał „zielony” z koniugatu Alexa488-dextran — który zostanie wykorzystany podczas analizy danych do wyizolowania fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej — oraz sygnał „czerwony” z białka fuzyjnego po jego fotokonwersji.
    1. Wzbudź Alexa488 za pomocą lasera 488 nm i zbierz emitowaną fluorescencję w zakresie od ~500 do 540 nm. Uwaga: Po fotokonwersji wiele białek fotokonwertowalnych z zielonego na czerwony (np. Dendra2) może być wzbudzanych laserem 543 nm i emitować fluorescencję w zakresie od ~550 do 650 nm. Dostosuj parametry w zależności od użytego białka fotokonwertowalnego.
  4. Pozyskaj obrazy „przed fotokonwersją” i skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu konfokalnego tak, aby obrazowało każdą z wcześniej zdefiniowanych pozycji (z kroku 3.2) przy odpowiednich warunkach obrazowania co 10 lub 20 min w ciągu pięciogodzinnego przebiegu czasowego (patrz Sekcja 5 i Dyskusja).
  5. Aby przeprowadzić fotokonwersję białka fuzyjnego, przełącz na obiektyw 10X i wystaw grupy zarodków na światło UV z lampy łukowej rtęciowej z filtrem wzbudzenia ~300–400 nm przy 100% mocy przez 2 min. Przesuwaj ostrość wzdłuż osi z, aby zapewnić jednorodną fotokonwersję (patrz Sekcja 5). Upewnij się, że olejek imersyjny nie skapie na obiektyw 10x podczas fotokonwersji.
    Uwaga: Przesuwanie ostrości podczas fotokonwersji można zautomatyzować, aby uniknąć zmienności między operatorami.
  6. Bezzwłocznie po fotokonwersji przełącz z powrotem na obiektyw 25X lub 40X. Upewnij się, że wcześniej zdefiniowane pozycje z kroku 3.2 są nadal dokładne. Jeśli naczynko przesunęło się podczas fotokonwersji, ponownie zdefiniuj pozycje zarodków.
    1. Uruchom program stworzony w kroku 3.4 i kontynuuj obrazowanie przez 5 h. Odnotuj czas, który upłynął między fotokonwersją a rozpoczęciem obrazowania dla każdego zarodka.
  7. Okazjonalnie sprawdzaj przebieg eksperymentu. Monitoruj poziom pożywki Danieau i uzupełniaj ją w razie potrzeby. Zrestartuj oprogramowanie, jeśli ulegnie zawieszeniu.
  8. Aby wyznaczyć wartości fluorescencji tła, które zostaną wykorzystane podczas analizy danych do oszacowania asymptoty modelu wykładniczo malejącego, włącz do eksperymentu kilka zarodków, które zostały wstrzyknięte Alexa488-dextranem, ale nie mRNA. Aby wyznaczyć szum przyrządu, który również zostanie wykorzystany w późniejszej analizie danych, wykonaj obraz w nieobecności próbki.

4. Analiza danych przy użyciu PyFDAP

  1. Wizualnie sprawdź zestawy danych z przebiegu czasowego dla każdego embrionu. Odrzuć zestawy danych z embrionów, które obumarły podczas obrazowania, uległy znacznemu przesunięciu, wykazują bardzo niski poziom sygnału po fotokonwersji lub zawierają obszary komórek, które wyglądają nietypowo i przestały się poruszać oraz dzielić (co jest typowe dla embrionów uszkodzonych lub chorych).
    Uwaga: Sporadycznie w jednym lub dwóch obrazach w przeciwnym razie użytecznego zestawu danych mogą pojawić się pęcherzyki w oleju imersyjnym lub inne artefakty. Odnotuj obrazy zawierające artefakty; zostaną one odrzucone na późniejszym etapie, a pozostałe punkty czasowe z takiego zestawu danych nadal mogą zostać poddane analizie.
  2. Do analizy danych FDAP wykorzystaj pakiet oprogramowania PyFDAP oparty na języku Python. PyFDAP oblicza okresy półtrwania poprzez wyznaczenie średniej intensywności czerwonej fluorescencji wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej na każdym obrazie oraz dopasowanie danych do funkcji wykładniczo malejącej56 (Ryc. 3).
    1. Pobierz PyFDAP (patrz Lista materiałów).
    2. Użyj PyFDAP, aby oddzielić wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy sygnał po fotokonwersji (Ryc. 3A,B). Wykorzystaj sygnał Alexa488, który jest ściśle wewnątrzkomórkowy, do stworzenia maski wewnątrzkomórkowej. Nałóż tę maskę na odpowiadający jej obraz w kanale czerwonym, aby zapobiec uwzględnieniu pikseli wewnątrzkomórkowych podczas obliczania średniej intensywności zewnątrzkomórkowej. Aby zmierzyć średnią intensywność wewnątrzkomórkową, odwróć maskę.
    3. W programie PyFDAP wyświetl obrazy z nałożonymi maskami wygenerowane w kroku 4.2.2. Wizualnie sprawdź te obrazy i odrzuć zestawy danych, w których maski nie odróżniają precyzyjnie przestrzeni wewnątrzkomórkowej od zewnątrzkomórkowej (powinno to zdarzać się rzadko; należy zauważyć, że błony komórkowe są zawarte w obrazach, w których zamaskowano przestrzeń zewnątrzkomórkową, ale można je usunąć poprzez zmianę algorytmu progowania lub wprowadzenie maski błony (np. za pomocą membrane-CFP)). Odrzuć również pojedyncze obrazy zawierające artefakty (np. pęcherzyki w oleju imersyjnym) zidentyfikowane w kroku 4.1.
    4. Użyj PyFDAP do obliczenia średnich intensywności fluorescencji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej dla każdego obrazu. PyFDAP oblicza te średnie poprzez zsumowanie intensywności pikseli znajdujących się poza maską i podzielenie wyniku przez całkowitą liczbę zsumowanych pikseli.
    5. Dopasuj dane fluorescencji (Ryc. 3C) do następującej funkcji wykładniczej:
      Równanie zaniku wykładniczego c(t)=c₀e⁻ᵏᵗ+y₀; badanie kinetyczne; wzór matematyczny.
      gdzie t to czas po fotokonwersji, c(t) to intensywność dla danej wartości t, c0 to intensywność przy t = 0, k to stała szybkości oczyszczania, a y0 to asymptota, do której dąży funkcja wraz ze spadkiem fluorescencji (Ryc. 1D). Wartość y0 może zostać ograniczona na podstawie pomiarów z kroku 3.819.
    6. Użyj PyFDAP do obliczenia zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych okresów półtrwania białka (τ) na podstawie stałych szybkości oczyszczania (k) przy użyciu następującego związku:
      Wzór na obliczanie okresu półtrwania, τ = ln(2)/k, równanie fizyczne, koncepcja rozpadu promieniotwórczego.

5. Eksperymenty kontrolne w celu oceny fotoblaknięcia, niezamierzonej fotokonwersji oraz jednorodności fotokonwersji

  1. Ocena fotowybielania
    Uwaga: Fotowybielanie może powodować artefaktowy spadek intensywności fluorescencji, który odzwierciedla właściwości wybielania białka fluorescencyjnego oprócz usuwania badanego białka.
    1. Aby ocenić ewentualne fotowybielanie, przeprowadź jeden zestaw eksperymentów FDAP z 10 min interwałami między obrazowaniem a drugi zestaw z 20 min interwałami między obrazowaniem (Rycyna 4). Przeanalizuj dane z obu zestawów eksperymentów za pomocą PyFDAP zgodnie z opisem w sekcji 4.
    2. Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów z interwałami 10 i 20 min. Dłuższe okresy półtrwania w eksperymentach z interwałami 20 min wskazują na istotne fotowybielanie. Jeśli okresy półtrwania w obu eksperymentach są identyczne, fotowybielanie nie stanowi istotnego problemu.
    3. Alternatywnie można ocenić fotowybielanie poprzez wykonanie serii około 30 obrazów bezpośrednio po fotokonwersji. Znaczny spadek intensywności fluorescencji wskazuje na istotne fotowybielanie.
    4. Jeśli wykryto fotowybielanie, należy zastosować mniejszą moc lasera, skrócić czas obrazowania lub rozważyć użycie bardziej fotostabilnego białka fotokonwersyjnego32.
  2. Ocena niezamierzonej fotokonwersji.
    Uwaga: Dendra2 może ulec fotokonwersji pod wpływem naświetlania 488 nm27. Podczas wzbudzania Alexa488 laserem 488 nm, zgodnie z opisem w kroku 3.3.1, możliwa jest niezamierzona fotokonwersja, a w konsekwencji artefaktowy wzrost pozornego okresu półtrwania badanego białka. Jednak my oraz inni autorzy33 stwierdziliśmy, że naświetlanie 488 nm jest nieefektywną metodą fotokonwersji w embrionach danio-pręgowanego.
    1. Aby wykryć niezamierzoną fotokonwersję, przeprowadź eksperyment kontrolny opisany w kroku 5.1.1. Porównaj okresy półtrwania z eksperymentów z interwałami 10 i 20 min. Krótsze okresy półtrwania w eksperymentach z interwałami 20 min wskazują na istotną niezamierzoną fotokonwersję. Jeśli okresy półtrwania w obu eksperymentach są identyczne, niezamierzona fotokonwersja nie stanowi istotnego problemu.
    2. Jeśli wykryto niezamierzoną fotokonwersję, należy zastosować mniejszą moc lasera 488 nm i krótsze czasy obrazowania, aby uniknąć niezamierzonej fotokonwersji białka Dendra2.
  3. Ocena jednorodności fotokonwersji.
    Uwaga: Jeśli fotokonwersja jest przesunięta w stronę bieguna zwierzęcego embrionu, spadek fluorescencji będzie zależny od dyfuzji białka lub przemieszczania się komórek do głębszych płaszczyzn (Rycina 5A).
    1. Aby określić, czy fotokonwersja jest jednorodna, wyeksponuj wydzielane białko fotokonwersyjne (dla eksperymentów z zewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi) lub cytoplazmatyczne białko fotokonwersyjne (dla eksperymentów z wewnątrzkomórkowymi białkami fuzyjnymi). Przeprowadź fotokonwersję w zwykły sposób, a następnie co 20 min przez 80 min wykonuj stos Z (z-stack) obejmujący większość blastodermy.
    2. Jeśli fotokonwersja jest przesunięta w stronę bieguna zwierzęcego, intensywność fluorescencji w głębszych płaszczyznach będzie z czasem rosnąć z powodu dyfuzji lub przemieszczania się komórek (Rycina 5B). Jeśli wykryto niejednorodną fotokonwersję, podczas fotokonwersji należy ustawić ostrość głębiej w embrionach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metodę FDAP wykorzystano do wyznaczenia okresów półtrwania białek sygnalizacyjnych pozakomórkowych w embrionach ryb zebrafish19. Jedno z tych białek, Squint, indukuje ekspresję genów mezendodermalnych podczas embriogenezy34. Squint-Dendra2 aktywuje ekspresję genów mezendodermalnych na poziomach zbliżonych do nieoznaczonego białka Squint, co wykazano w testach qRT-PCR oraz hybrydyzacji in situ19. Do embrionów wstrzyknięto jednocześnie dekstran Alexa488 oraz mRNA kodujące Squint-De...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powodzenie eksperymentu FDAP zależy od wytworzenia funkcjonalnego fotokonwertowalnego białka fuzyjnego. Znakowanie białka może wpływać na jego aktywność biologiczną i/lub właściwości biofizyczne, w tym na jego lokalizację, rozpuszczalność i stabilność36-41. Przygotuj się na przetestowanie aktywności kilku różnych konstruktów fuzyjnych, aby znaleźć taki, który jest aktywny. Odkryliśmy, że zmiana położenia białka fotokonwertowalnego w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania lub użycie dłuższych ł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jeffreyowi Farrellowi, Jamesowi Gagnonowi i Jennifer Bergmann za komentarze do manuskryptu. KWR był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program podczas opracowywania testu FDAP. Praca ta była wspierana przez granty z NIH dla AFS oraz przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (Emmy Noether Program), Towarzystwa Maxa Plancka i Human Frontier Science Program (Nagroda za rozwój kariery) dla PM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PyFDAP (do pobrania z następującej strony internetowej: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)Zainstaluj i obsługuj zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie internetowej PyFDAP; PyFDAP jest kompatybilny z systemami operacyjnymi Linux, Mac i Windows.
mMessage mMachine Sp6 Zestaw do transkrypcjiLife TechnologiesAM1340Do generowania zakrytego mRNA do wstrzykiwań do zarodków
Koniugat Alexa488-dekstranu, 3 kDaLife TechnologiesD34682Jednoczesne wstrzykiwanie z mRNA w celu stworzenia masek wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych
6-dołkowe plastikowe naczynieBD FalconInkubuj zarodki w studzienkach pokrytych agarozą, aż będą gotowe do montażu
Pożywka dla zarodków250 mg/L Sól oceaniczna instant, 1  mg/L błękitu metylenowego w wodzie z odwróconej osmozy dostosowanej do pH 7 z NaHCO3
Proteaza z Streptomyces griseusSigmaP5147Przygotować zapas 5 mg/ml i użyć w 1  mg/ml do dechorionacji zarodków w stadium jednokomórkowym
Szklana szalkaDo dechorionacji zarodków
Szklana zlewka200 ml Do dechorionacji zarodków Aparatura
mikroiniekcjiDo wstrzykiwania mRNA i barwnika do zarodków w stadium jednokomórkowym
Mikroskop stereoskopowyDo wstrzykiwania i montowania zarodków
1x pożywkaRozcieńczyć agarozę o niskiej temperaturze topnienia i przeprowadzić obrazowanie w tym podłożu; receptura: 0,2 mm przefiltrowany roztwór 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,3 mM CaCl2, 5  mM HEPES pH 7,2
UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520-100Do montowania zarodków; stosować w stężeniu 1% w pożywce Danieau: dodać 200 mg do 20 ml pożywki Danieau, mikrofalować aż do rozpuszczenia, a następnie podwielokrotność 1  ml do probówek do mikrowirówek; Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C, ponownie stopiony w temperaturze 70  ° C i schłodzony do 40– 42 &stopnie; C gdy jest gotowy do użycia
Szklana pipeta PasteuraKimble Chase (przez Fishera)63A53WTDo montażu zarodków; podpal końcówkę, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków przez postrzępione krawędzie
Metalowa sondaDo pozycjonowania zarodków podczas montażu
Naczynia ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-CUżyj odpowiedniej grubości szkła nakrywkowego dla swojego celu; podany tutaj numer części dotyczy szkła nakrywkowego nr 1.5
Probówka 15 ml wypełniona ~5 ml pożywką zarodkowąBD FalconDo płukania resztek agarozy z pipety Pasteura
Odwrócony laserowy skaningowy mikroskopLampa rtęciowa, 488  Wymagany jest laser nm, laser 543 nm i odpowiednie zestawy filtrów
EtapAby utrzymać zarodki w optymalnej temperaturze 28 & stopni; C podczas eksperymentu
Oprogramowanie konfokalne zdolne do obrazowaniaMusi być w stanie zdefiniować wiele pozycji i automatycznie je obrazować w określonych odstępach czasu 
wodny 25X lub 40XObiektyw do obrazowania
ObiektywObiektyw do fotokonwersji
Olejekimmersyjny Olejek immersyjny o tym samym współczynniku załamania światła co woda
Petriego o średnicy 5 cm do Danieau konfokalny podgrzewany poklatkowego Obiektyw powietrzny 10X

Bibliografia

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429(2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598(2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708(2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test fotokonwersjiusuwanie wewn trzkom rkoweusuwanie zewn trzkom rkowemikroskopia konfokalnaznakowanie bia kami fluorescencyjnymipomiar okresu p trwaniaanaliza przedzia owa
Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.