Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52267

⸱

29 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Università degli Studi di Milano, 2San Raffaele Scientific Institute and Vita-Salute University, 3CEND Center of Excellence in Neurodegenerative Diseases, Università degli Studi di Milano

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Streszczenie

Pęcherzyki synaptyczne uwalniają neuroprzekaźniki w synapsach chemicznych poprzez dynamiczny cykl fuzji i odzyskiwania. Monitorowanie aktywności synaptycznej w czasie rzeczywistym i analizowanie różnych etapów egzoendocytozy na poziomie pojedynczego pęcherzyka ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji synaptycznych w zdrowiu i chorobie.

Genetycznie kodowane sondy wrażliwe na pH bezpośrednio ukierunkowane na pęcherzyki synaptyczne oraz Mikroskopia Fluorescencyjna Całkowitego Wewnętrznego Odbicia (TIRFM) zapewniają rozdzielczość czasoprzestrzenną niezbędną do śledzenia dynamiki pęcherzyków. Ulotne pole generowane przez całkowite odbicie wewnętrzne może wzbudzić jedynie fluorofory umieszczone w cienkiej warstwie (<150 nm) nad szklaną pokrywą, do której przylegają komórki, dokładnie tam, gdzie zachodzą procesy egzoendocytozy. Uzyskane obrazy o wysokim kontraście idealnie nadają się do śledzenia pęcherzyków i ilościowej analizy zdarzeń fuzji.

W tym protokole, ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y są proponowane jako cenny model do badania uwalniania neuroprzekaźników na poziomie pojedynczego pęcherzyka przez TIRFM, ze względu na ich płaską powierzchnię i obecność rozproszonych pęcherzyków. Przedstawiono metody hodowli SH-SY5Y jako komórek adherentnych i transfekcji ich synapto-pHluoryną, a także technikę wykonywania TIRFM i obrazowania. Na koniec przedstawiono strategię mającą na celu selekcję, liczenie i analizowanie zdarzeń fuzji na poziomie całych komórek i pojedynczych pęcherzyków.

Aby potwierdzić procedurę obrazowania i podejście do analizy danych, dynamika pęcherzyków znakowanych pHluoryną jest analizowana w warunkach spoczynku i stymulacji (depolaryzacji stężeń potasu). Depolaryzacja błony zwiększa częstotliwość zdarzeń fuzji i powoduje równoległe podniesienie sygnału fluorescencji netto zarejestrowanego w całej komórce. Analiza pojedynczych pęcherzyków ujawnia modyfikacje zachowania podczas fuzji (zwiększona wysokość i szerokość piku). Dane te sugerują, że depolaryzacja potasu nie tylko indukuje masowe uwalnianie neuroprzekaźników, ale także modyfikuje mechanizm fuzji pęcherzyków i recyklingu.

Z odpowiednią sondą fluorescencyjną, technika ta może być stosowana w różnych systemach komórkowych do analizowania mechanizmów konstytutywnego i stymulowanego wydzielania.

Wprowadzenie

Chemiczna transmisja synaptyczna między neuronami jest głównym mechanizmem komunikacji w układzie nerwowym. Opiera się na uwalnianiu neuroprzekaźników poprzez dynamiczny cykl fuzji pęcherzyków i pobierania w miejscu presynaptycznym. Zidentyfikowano wiele białek biorących udział w dynamice pęcherzyków; Ich konkretny wkład w to zjawisko pozostaje jednak do wyjaśnienia1.

Nasze zrozumienie jest częściowo ograniczone przez fakt, że najczęściej stosowane testy egzo/endocytozy nie zawsze są najbardziej odpowiednie. Kilka badań związanych z fuzją i dynamiką pęcherzyków opiera się na technikach elektrofizjologicznych. Technika ta zapewnia optymalną rozdzielczość czasową i doskonale nadaje się do badania początkowej fuzji pęcherzyków z błoną plazmatyczną, ale nie jest w stanie wykryć wielu podstawowych zdarzeń molekularnych, które wspierają funkcję presynaptyczną. Z drugiej strony, mikroskopia elektronowa zapewnia najdokładniejszy opis morfologiczny każdego pojedynczego kroku, ale nie można uchwycić dynamicznego aspektu zdarzenia, ponieważ próbki muszą być utrwalone, aby można je było przeanalizować.

Pojawienie się nowych technik zapisu optycznego2,3, w połączeniu z postępem w rozwoju fluorescencyjnych sond molekularnych4-6, umożliwia wizualizację procesów egzocytarnych w żywych komórkach, dostarczając tym samym nowych poziomów informacji o strukturze i funkcji synaptycznej.

Początkowe badania wykorzystywały zależne od aktywności barwniki styrylowe (FM1–43 i pokrewne barwniki organiczne)7,8. Najnowocześniejsze techniki obrazowania wykorzystują wrażliwe na pH warianty białka zielonej fluorescencji (GFP) (pHluoryny) połączone z białkami pęcherzyków świetlnych9. Sondy te są zwykle wyłączane, gdy są obecne w pęcherzykach z powodu niskiego pH światła. Po fuzji z błoną plazmatyczną wnętrze pęcherzyka jest wystawione na działanie obojętnej przestrzeni zewnątrzkomórkowej, pH gwałtownie wzrasta, łagodzi zależne od protonów wygaszanie pHluorin i szybko pojawia się sygnał fluorescencyjny. Ponieważ zmiana pHluoryny jest szybsza niż zdarzenie fuzji, monitorując wzrost fluorescencji, można zmierzyć i przeanalizować fuzję pęcherzyków z błoną. Ponieważ cząsteczki znakowane powierzchniowo pHluoryną są endocytozyzowane, sygnał fluorescencyjny powraca następnie do poziomu podstawowego, dlatego ten sam konstrukt może być również stosowany do monitorowania recyklingu pęcherzyków9.

Podczas gdy czujnik pH oznaczony pęcherzykami zapewnia wizualizację tylko tych pęcherzyków, które naprawdę łączą się z błoną plazmatyczną, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej jest wymagane do szczegółowego opisania etapów związanych z procesami egzo/endocytarnymi. Techniką optyczną, która zapewnia niezbędną rozdzielczość czasowo-przestrzenną, jest mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej10.

Całkowite wewnętrzne odbicie występuje na styku szklanego szkiełka nakrywkowego z próbką. Gdy ścieżka światła dociera do szklanego szkiełka nakrywkowego o kącie padania większym niż kąt krytyczny, światło wzbudzenia nie jest przekazywane do próbki, ale jest całkowicie odbijane z powrotem. W tych warunkach na granicy faz tworzy się ulotna fala świetlna i rozchodzi się w ośrodku o mniejszej gęstości optycznej (próbce). Ponieważ intensywność pola ulotnego zanika wykładniczo wraz z odległością od granicy faz (przy głębokości penetracji około 100 nm), tylko fluorofory znajdujące się w najbliższej odległości od szkiełka nakrywkowego mogą być wzbudzone, podczas gdy te znajdujące się dalej od granicy nie są wzbudzone. W komórkach transfekowanych konstruktami GFP głębokość ta odpowiada białkom wyrażającym się na błonie plazmatycznej lub w zbliżających się do niej strukturach pęcherzykowych. Ponieważ fluorofory we wnętrzu komórki nie mogą być wzbudzone, fluorescencja tła jest zminimalizowana i powstaje obraz o bardzo wysokim stosunku sygnału do tła11.

Kilka cech sprawia, że TIRFM jest techniką wybieraną do monitorowania dynamiki pęcherzyków. Doskonały kontrast i wysoki stosunek sygnału do szumu pozwalają na wykrycie bardzo niskich sygnałów pochodzących z pojedynczych pęcherzyków. Akwizycja obrazu w każdej klatce w oparciu o chip zapewnia rozdzielczość czasową niezbędną do wykrywania wysoce dynamicznych procesów. Wreszcie, minimalna ekspozycja komórek na światło w dowolnej innej płaszczyźnie próbki znacznie zmniejsza fototoksyczność i umożliwia długotrwałe nagrywanie poklatkowe12.

Analiza danych pozostaje najtrudniejszym i najważniejszym aspektem tej techniki. Najprostszym sposobem monitorowania fuzji pęcherzyków jest pomiar akumulacji reporterowych białek fluorescencyjnych na powierzchni komórki w czasie13. Wraz ze wzrostem fuzji zwiększa się również sygnał fluorescencji netto. Jednak ta metoda może zaniżać ten proces, szczególnie w dużych komórkach i w stanie spoczynku, ponieważ procesy endocytozy i fotowybielania równoważą wzrost intensywności fluorescencji spowodowany egzocytozą pęcherzyków. Alternatywną metodą jest śledzenie każdego pojedynczego zdarzenia fuzji14. Ta ostatnia metoda jest bardzo czuła i może ujawnić ważne szczegóły dotyczące mechanizmów fuzji. Wymaga to jednak ręcznego wyboru pojedynczych zdarzeń, ponieważ nie zawsze dostępne są w pełni zautomatyzowane procedury śledzenia pęcherzyków i rejestrowania fluktuacji ich sygnałów fluorescencyjnych. Obserwacja dynamiki pęcherzyków wymaga pobierania próbek komórek z dużą częstotliwością. Generuje to dużą ilość danych, które trudno przeanalizować ręcznie.

Propozycja tego artykułu polega na optymalizacji techniki obrazowania TIRFM do monitorowania podstawowego i stymulowanego uwalniania neuroprzekaźników w linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-5YSY oraz na opisaniu, krok po kroku, procedury opracowanej w laboratorium do analizy danych, zarówno na poziomie całych komórek, jak i pojedynczych pęcherzyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Hodowla komórkowa SH-SY5Y
    UWAGA: Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu ludzkiego nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266)15. Komórki SH-SY5Y rosną jako mieszanina pływających klastrów i komórek przylegających. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole (gęstość komórek, współczynnik podziału itp.), aby komórki rosły mocno przymocowane do szklanej osłony, co ma kluczowe znaczenie dla TIRFM.
    1. Przed rozpoczęciem, pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, należy przygotować odpowiednią objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i pożywki hodowlanej.
      1. Przygotować 50 ml PBS o stężeniu 150 mM NaCl, 24 mM buforu fosforanowego, pH 7,4. Przefiltruj roztwór.
      2. Przygotuj 50 ml pożywki komórkowej ze zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z wysokospektywną glukozą, 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 μg/ml), L-glutaminą (2 mM) i pirogronianem sodu (1 mM). Przefiltruj roztwór.
    2. Usunąć pełną pożywkę wzrostową i przemyć komórki 3 ml PBS.
    3. Inkubować komórki z 2 ml 0,05% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (na 6 cm szalki Petriego) przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i odłączyć komórki za pomocą pipety.
    4. Dezaktywować trypsynę, dodając 2 ml DMEM, i zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
    5. Usunąć supernatant, dodać 1 ml DMEM do osadu i pipetować roztwór w górę i w dół na tyle, aby rozproszyć komórki w zawiesinie pojedynczej komórki.
    6. Rozdrobnij je w stosunku 1:4 na nowej szalce Petriego o średnicy 6 cm, zawierającej 3 ml kompletnego podłoża. Utrzymywać komórki w hodowli na szalkach Petriego o średnicy 6 cm, w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2. Subkultura raz w tygodniu lub gdy pokryją 80 - 90% powierzchni.
  2. Powlekanie komórek SH-SY5Y do obrazowania
    1. W przypadku eksperymentów TIRFM umieść komórki na szklanych pokrywach. Zastosuj szklane pokrywy o grubości 0,17 ± 0,005 mm i współczynniku załamania światła 1,5255 ± 0,00015. Przed rozpoczęciem przygotuj szklane szkiełka nakrywkowe w następujący sposób:
      1. Czyste szklane pokrywy z 90% etanolem, O/N.
      2. Dokładnie opłucz je w wodzie destylowanej (trzy zmiany wody destylowanej). Suszyć szklane pokrywy w suszarce.
      3. Umieść pokrywki na szklanych szalkach Petriego i sterylizuj w piekarniku nagrzanym do 200 °C przez 3 godziny.
    2. Dzień przed transfekcją umieścić każde szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm, dodać 1 ml pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    3. Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1.3 - 1.1.5, zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć. Oblicz prawidłową objętość zawiesiny komórek, którą należy dodać do każdej szalki Petriego, aby uzyskać 3 x 105 komórek/studzienkę. Ta gęstość jest wymagana do optymalnego wzrostu komórek i wydajnej transfekcji. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N.
  3. SH-SY5Ytransfekcja polietyleniną (PEI)
    UWAGA: Do wizualizacji dynamiki pęcherzyków synaptycznych wykorzystano wektor pCB6 zawierający synapto-pHluorynę. Synapto-pHluorin została wytworzona w wyniku fuzji w ramce wrażliwego na pH wariantu białka zielonej fluorescencji (GFP)16 i białka błony pęcherzykowej synaptobrevin 2. Konstrukt ten został szeroko wykorzystany do zbadania właściwości pęcherzyków synaptycznych w neuronach9.
    1. Przed rozpoczęciem transfekcji należy przygotować 10 ml następujących roztworów. Utrzymuj roztwory maksymalnie przez 1 miesiąc.
      1. Przygotuj roztwór NaCl o stężeniu 150 mM. Dostosować do pH 5,5 za pomocą 0,01 N HCl.
      2. Przygotować roztwór PEI o stężeniu 10% polietyleneniny (PEI; 25 kDa liniowo) w 150 mM roztworze NaCl. pH roztworu wzrasta do 8,8. Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą 0,01 N HCl.
    2. Po 24 godzinach od posiewu usunąć pożywkę i odświeżyć 1,5 ml kompletnej pożywki. Utrzymać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    3. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, dodać 3 μg plazmidowego DNA do 25 μl 150 mM roztworu NaCl i 100 μl roztworu PEI na 3,5 cm szalkę Petriego.
    4. Wirować przez 10 sekund, a następnie inkubować mieszaninę DNA/PEI przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie dodać mieszaninę DNA/PEI do szalki Petriego zawierającej szkiełka nakrywkowe z komórkami i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić odczynnik na szalce Petriego.
    6. Po 4 godzinach zmienić podłoże i inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2. Wykonuj eksperymenty obrazowe 24 - 48 godzin po transfekcji.

2. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

  1. Konfiguracja obrazowania
    1. Wykonaj obrazowanie TIRF z konfiguracją opisaną na rysunku 1. Składa się z odwróconego mikroskopu z napędem silnikowym (rysunek 1, wstawka A), źródła laserowego (rysunek 1, wstawka B) i suwaka TIRF (rysunek 1, wstawka C). Osiągnij oświetlenie TIRFM dzięki wysokiej aperturze numerycznej (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100-krotny olejek, obiektyw immersyjny.
    2. Do oświetlenia TIRFM należy użyć wieloliniowego (458/488/514 nm) lasera argonowo-jonowego o mocy 100 mW. Używając światłowodu monomodowego, wprowadź liniowo spolaryzowane światło laserowe na ścieżkę wiązki za pomocą suwaka TIRF. Włóż suwak TIRF do płaszczyzny przysłony pola świetlnego na ścieżce wiązki światła odbitego.
      1. Aby uzyskać oświetlenie o szerokim polu widzenia, podłącz mikroskop do konwencjonalnej rtęciowej lampy o krótkim łuku HBO o białym świetle. Podwójny pryzmat utrzymujący polaryzację w suwaku zapewnia jednoczesne połączenie oświetlenia TIRF i światła białego.
    3. Przefiltrować światło lasera za pomocą filtra wzbudzającego (szerokość pasma 488/10 nm) zamontowanego na kole filtrowym, wprowadzonego w ścieżkę lasera. Zastosuj szybką, sterowaną programowo migawkę, aby umożliwić szybkie sterowanie oświetleniem laserowym. Do analizy pHluorin należy zamontować filtr emisyjny pasmowoprzepustowy 525/50 nm. Rejestruj obrazy cyfrowe (512 x 512 pikseli) za pomocą chłodzonej szybkiej kamery CCD za pomocą oprogramowania Image ProPlus.
  2. Uzyskiwanie oświetlenia TIRF (rysunek 2)
    1. Włącz lasery, komputer, kamerę, koło filtrów i kontrolery migawki, a następnie odczekaj 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, ponieważ lasery muszą się rozgrzać i ustabilizować.
    2. Przed obrazowaniem dokonaj odpowiedniej objętości następujących rozwiązań.
      1. Przygotować 50 ml roztworu Krebsa (KRH) w 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) (buforowanego do pH 7,4), 2 mM CaCl2 i 6 mM glukozy.
      2. Przygotować 10 ml roztworu KCl-KRH (pH 7,4) przy 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES (buforowanym do pH 7,4), 2 mM CaCl2 i 6 mM glukozy.
    3. Zdejmij szklaną pokrywę z transfekowanymi komórkami i włóż ją do odpowiedniej komory obrazowania. Zmontuj komorę i dodaj 500 μl roztworu KRH na środek szklanki.
    4. Dodaj olej na obiektyw. Umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu i umieść obiektyw pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Umieść bezpieczną pokrywę nad próbką.
    5. W trybie epifluorescencji skup się na szkiełku nakrywkowym (górna powierzchnia) i wybierz transfekowane komórki umieszczone w środku komory. Wybierz ogniwa, których sygnał fluorescencyjny może być wyraźnie zarejestrowany przy czasie ekspozycji poniżej 80 ms.
    6. Pod kontrolą oprogramowania przełącz się na podświetlenie TIRF w trybie na żywo.
    7. Aby ustawić konfigurację TIRF, sprawdź położenie wiązki wychodzącej z obiektywu na pokrywie próbki (Rysunek 2B). Gdy wiązka jest umieszczona w środku soczewki obiektywu (rysunek 2A, po lewej), w środku pokrywy próbki TIRF widoczna jest plamka (ryc. 2B, po lewej), a komórka jest obrazowana w trybie epifluorescencji (kilka płaszczyzn ostrości, wysoka fluorescencja tła; Rysunek 2C, po lewej).
    8. Aby osiągnąć kąt krytyczny, przesuń skupione miejsce w kierunku Y (do przodu lub do tyłu; Rysunek 2B, w środku) za pomocą regulacji kąta na suwaku TIRF (Rysunek 1C). Gdy wiązka zbiega się na płaszczyźnie próbki pod kątem większym niż kąt krytyczny (rysunek 2A, po prawej), plamka znika, a na środku pokrywy próbki widoczna jest prosta, cienka, skupiona linia (rysunek 2B, po prawej).
    9. Aby dostroić kąt TIRF, należy użyć próbki ogniwa (rysunek 2C). Obejrzyj obraz fluorescencji na filmie, na tym etapie obraz podobny do epifluorescencji jest nadal widoczny. Delikatnie przesuwaj, aż zostanie osiągnięty warunek TIRF: tylko jedna płaszczyzna optyczna komórki jest zogniskowana (tj. błona plazmatyczna styka się ze szkiełkiem nakrywkowym), co daje płaski obraz o wysokim kontraście (rysunek 2C, po prawej).
  3. Obrazowanie próbki
    1. Ustaw jednokanałowy eksperyment poklatkowy. Aby zminimalizować fotowybielanie, uchwyć obraz przy użyciu krótkiego czasu naświetlania i wysokiego wzmocnienia. Odpowiednie czasy naświetlania wynoszą od 40 do 80 ms. Rejestruj obrazy z częstotliwością próbkowania 1 - 2 Hz. Kinetyka pęcherzyków może być lepiej doceniana przy próbkowaniu przy wyższej częstotliwości (10 Hz). Regularny czas obserwacji to zwykle 2 min.
    2. Dodaj 500 μl roztworu KRH i nagraj komórki w trybie TIRFM. To jest stan spoczynku. Oszczędzaj czas na sekwencyjnych obrazach.
    3. Ustaw ostrość na tej samej komórce i nagrywaj w tych samych warunkach spoczynku (moc lasera, czas, ekspozycja, numer klatki). Po pięciu klatkach dodać 500 μl roztworu KCl-KRH i przechowywać KCl w komorze. To jest stan stymulowany; Zaoszczędź czas na sekwencyjnych obrazach.

3. Analiza obrazu i przetwarzanie danych

UWAGA: Do analizy obrazów, w laboratorium opracowano makra bazujące na istniejących funkcjach oprogramowania do analizy obrazów; podobne makra są dostępne online (URL podany w Tabeli Materiałów i Wyposażenia).

  1. Kwantyfikacja intensywności fluorescencji
    1. Użyj makro "Sekwencja intensywności fluorescencji" do ilościowego określania intensywności fluorescencji w obszarze zainteresowania (ROI) obrazu w trakcie trwania filmu.
    2. Otwórz obrazy sekwencyjne w czasie. Przejdź do menu makr i wybierz "Intensywność fluorescencji sekwencji". W oknie 'Analiza' pojawia się "wybierz ROI".
    3. Wybierz jedno z narzędzi wyboru w menu, aby utworzyć ROI. Umieść 3 ROI w obszarach błony komórkowej bez plam (ROI w tle). Wykorzystaj ten "zwrot z inwestycji w tle" do oceny fotowybielania i ustawienia progu dla analizy zdarzeń fuzji (Rysunek 3A).
  2. Korekcja fotobielenia i określenie progu (rysunek 3B)
    1. Aby ocenić fotowybielanie, otwórz wiersze intensywności fluorescencji "tła ROI" (ryc. 3Ba). Znormalizuj wartości intensywności fluorescencji w każdej klatce do początkowej wartości intensywności (F0) (F/F0) (Rysunek 3Bb). Uśrednij wartości.
    2. Wyróżnij średnią danych i utwórz wykres liniowy, korzystając z opcji menu wykresu.
    3. Z menu analizy danych wybierz "linia trendu", aby otworzyć okno dialogowe analizy wykresu. Wybierz typ regresji. Ustaw regresję "wykładniczą". Następnie wybierz "wyświetl równanie na wykresie". W oknie wykresu pojawia się równanie wykładnicze, a wartości parametrów są automatycznie przypisywane (Rysunek 3Bc).
    4. Zastosuj korekcję wykładniczą do wartości intensywności w każdej klatce w następujący sposób:
      Fn (poprawiony) = Fn / exp(-n * a)
      Fn = eksperymentalna intensywność fluorescencji mierzona w ramce n; n = liczba klatek; a = współczynnik bielenia (stała wyrażająca tempo utraty intensywności w wyniku fotowybielania;Rysunek 3Bd).
    5. Aby ustawić próg, otwórz znormalizowany i skorygowany "ROI w tle", oblicz średni sygnał fluorescencji i jego odchylenie standardowe (SD). Średnia wartość plus 3 SD reprezentuje próg (rysunek 3Be). Użyj tego progu do analizy danych.
  3. Wybór zdarzeń fuzji za pomocą procedury półautomatycznej
    1. Otwórz obrazy sekwencyjne w czasie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Zastosuj filtr Gaussa do aktywnej sekwencji obrazów.
    2. Analizuj obrazy za pomocą narzędzia "zliczaj obiekty" lub makra, które pozwala wybrać obiekt, którego piksele mają średnią intensywność fluorescencji w zdefiniowanym zakresie. Ustaw zakres intensywności ręcznie, korzystając z funkcji progu (przejdź do menu paska, ustaw miarę → próg, aby podświetlić obszar zainteresowania). Odpowiedni próg to 30% powyżej lokalnego fluorescencyjnego sygnału tła.
    3. Zastosuj makro "Filtruj obiekty", aby wybrać tylko obiekty spełniające następujące kryteria:
      1. Zastosuj opcję zakresów (min i maksimum włącznie) dla aspektu. Proporcje zgłaszają stosunek między osią główną a osią pomocniczą elipsy odpowiadającej obiektowi. Aspekt jest zawsze ≥1. Odpowiednie wartości to min = 1, max = 3.
      2. Zastosuj zakresy średnicy. Średnica określa średnią długość średnic mierzonych w odstępach dwóch stopni, łączących dwa punkty konturu i przechodzących przez środek ciężkości obiektu. Ustaw zakres w pikselach (lub w μm, jeśli używasz skalibrowanego systemu).
      3. Zdefiniuj optymalny zakres we wstępnych eksperymentach: wybierz ręcznie interesujące Cię miejsca, a następnie zmierz ich średnicę za pomocą funkcji profilu wykresu.
    4. Wybierz "obiekty wyświetlane": wybrane obiekty zostaną wyświetlone jako nałożone na obraz TIRFM (Rysunek 4B).
    5. Uwzględnij w analizie tylko te miejsca, które wykazują krótki (od jednej do trzech klatek) przejściowy wzrost intensywności fluorescencji, po którym bezpośrednio następuje wyraźna utrata sygnału (plamki przejściowe). Zastosuj zaznaczenie kołowe, aby utworzyć ROI o średnicy około jednej plamki promieniowo wokół wybranego pęcherzyka/plamek (eksperymentalne ROI). Wykonaj ten krok ręcznie.
    6. Po wybraniu ROI oblicz średnią intensywność fluorescencji każdego ROI w trakcie trwania filmu.
  4. Analiza danych (Rysunek 3C-D)
    1. Eksport przebiegu czasowego zmian fluorescencji mierzonych w każdym "eksperymentalnym ROI" do arkusza kalkulacyjnego; (Rysunek 3Da). Znormalizuj wartość intensywności w każdej klatce do początkowej intensywności fluorescencji (F/F0) (rysunek 3 dB).
    2. Zastosuj korekcję wykładniczą do wartości intensywności w każdej klatce, jak podano w kroku 3.2.4 (Rysunek 3Dc).
    3. Aby obliczyć całkowitą liczbę zdarzeń fuzji (liczba pików), czas zachodzenia każdej fuzji (szerokość piku) i amplitudę piku fluorescencyjnego (wysokość piku i AUC), zastosuj funkcje logiczne za pomocą arkusza kalkulacyjnego lub pakietów matematycznych. Przykład analizy zdarzeń fuzji przy użyciu wzorów logicznych przedstawiono na rysunkach 3Dd i 3De.
    4. Załóżmy wzrost intensywności fluorescencji przekraczający próg (średnia intensywność fluorescencji tła ± 3SD) jako fuzję pęcherzyków do błony plazmatycznej, a wynikowy pik jako zdarzenie fuzji.
    5. Oblicz szerokość piku jako różnicę między ostatnią a pierwszą wartością x każdego piku. Pomnóż tę wartość przez 1 / (częstotliwość próbkowania). Rozważ tę wartość jako czas fuzji i adhezji pęcherzyków na błonie plazmatycznej przed ponownym zakwaszeniem pęcherzyków i recyklingiem (ryc. 3Dd).
    6. Oblicz AUC całej komórki jako sumę wartości powyżej progu. Rozważ tę wartość jako zmianę fluorescencyjną netto w czasie rejestracji spowodowaną spontaniczną (spoczynkową) lub wywołaną (stymulowaną) aktywnością synaptyczną.
    7. Oblicz wysokość piku jako różnicę między maksymalną wartością y każdego piku a progiem. Tę wartość należy traktować jako wskazującą na typ fuzji (fuzja pojedyncza vs. jednoczesna/sekwencyjna lub fuzja przejściowa vs. pełna fuzja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane procedury obrazowania TIRF oraz analizy danych zostały opracowane w celu badania dynamiki pęcherzyków w układach komórkowych. Technikę tę można wykorzystać do określenia wpływu cząsteczek sygnalizacyjnych i leków na zdarzenia fuzji oraz dynamikę pęcherzyków neuroprzekaźników17. Z wykorzystaniem białek błony plazmatycznej znakowanych GFP, analiza TIRFM była stosowana do charakteryzacji konstytutywnego transportu znakowanych GFP transporterów glutaminianu w komórkach glejowych i nabłonkowych18,19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół obrazowania i analizy dynamiki pęcherzyków w komórkach wydzielających, przy użyciu fluorescencyjnych wektorów kodowanych przez cDNA i TIRFM. Kluczowymi elementami udanego obrazowania za pomocą TIRFM są wybór modelu komórkowego i transfekcja komórek z genetycznie zakodowanymi optycznymi wskaźnikami uwalniania pęcherzyków i recyklingu.

TIRFM idealnie nadaje się do wzrostu komórek przylegających do szklanej pokrywy i wystarczająco płaskich, aby umożliwić stabilną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Università degli Studi di Milano za wsparcie dla Eliany Di Cairano (stypendium podoktoranckie) i Stefanii Moretti (stypendium doktoranckie). Prace te były wspierane przez Uniwersytecki Program Badawczy PUR dla C.P.

Chcielibyśmy podziękować Prof. Jeremy'emu M. Henleyowi, School of Biochemistry, University of Bristol, Wielka Brytania, za konstrukt pHluorin oraz dr Dotti Francesco za pomoc w analizie danych, oraz Silvii Marsicano za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Axio Observer Z1figure-materials-1 Zeiss491912-9850-000mikroskop odwrócony
Multiline Argon Laser Lasos 77figure-materials-2 Lasos00000-1312-752wieloliniowy (458/488/514 nm) laser argonowy 100 mW
Laser TIRF sliderfigure-materials-3 Zeiss423681-9901-000
Obiektyw 100Xfigure-materials-4 Zeiss421190-9900-000immersyjny olejowy, NA 1.45 Alpha-Plan
Kamera CCD RetigaSRV Fast 1394figure-materials-5 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutterfigure-materials-6 Sutter Instrument Company
Oprogramowanie
Image ProPlus 6.3 Softwarefigure-materials-7 Media Cyberneticswybór punktów, wybór ROI, wyznaczanie intensywności fluorescencji
Excelfigure-materials-8 Microsoftkorekcja fotoblaknięcia, analizy całej komórki i pojedynczych pęcherzyków
GraphPad Prism 4.00figure-materials-9 GraphPad Software, Inc.analiza statystyczna

Bibliografia

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758(2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjna z ca kowitym wewn trznym odbiciemtransfekcja Synapto pHluorinanaliza fuzji p cherzyk wkwantyfikacja intensywno ci fluorescencjiledzenie pojedynczych p cherzyk wstymulacja depolaryzacj potasow
Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.