Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52270

⸱

22 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ophthalmology, University Eye Hospital Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Dzięki temu badaniu wprowadzamy standaryzowany model stresu dla izolowanej superkrwistej siatkówki bydlęcej do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych. Oceniano wpływ hipoksji (czysty N2) lub stresu glutaminianu (250 μM glutaminianu) na funkcję siatkówki reprezentowaną przez amplitudy załamków a i b.

Streszczenie

Neuroprotekcja była silnym obszarem badań w badaniach okulistycznych w ostatnich dziesięcioleciach i wpływa na choroby takie jak jaskra, niedrożność naczyń siatkówki, odwarstwienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Celem tego badania było wprowadzenie ustandaryzowanego modelu stresu do przyszłych przedklinicznych testów terapeutycznych.

Siatkówki bydlęce zostały przygotowane i perfundowane roztworem wzorcowym nasyconym tlenem, a następnie zarejestrowano ERG. Po zarejestrowaniu stabilnych fal b przez 45 minut wywierano hipoksję (czysty N2) lub stres glutaminianu (250 μm glutaminianu). Aby zbadać wpływ na samą funkcję fotoreceptorów, dodano 1 mM asparaginian w celu uzyskania fal A. Odzyskiwanie ERG monitorowano przez 75 minut.

Dla niedotlenienia zauważono spadek amplitudy fali a o 87,0% (p <0,01) po czasie ekspozycji wynoszącym 45 minut (spadek o 36,5% po zakończeniu wymywania p = 0,03). Dodatkowo odnotowano początkowy spadek amplitudy załamka b o 87,23%, który osiągnął istotność statystyczną (p <0,01, spadek o 25,5% pod koniec wymłukiwania, p = 0,03).

Dla glutaminianu 250 μm, początkowa redukcja amplitudy fali a o 7,8% (p >0,05), a następnie redukcja o 1,9% (p >0,05). Odnotowano zmniejszenie amplitudy załamka b o 83,7% (p <0,01); Po wypłukaniu trwającym 75 minut redukcja wyniosła 2,3% (p = 0,62). W niniejszym badaniu przedstawiono standaryzowany model stresu, który może być przydatny do identyfikacji możliwych efektów neuroprotekcyjnych w przyszłości.

Wprowadzenie

Neuroprotekcja była ważnym obszarem badań w badaniach okulistycznych w ostatnich dziesięcioleciach. Siatkówka jest bardzo wrażliwą siecią neuronalną, która w znacznym stopniu zależy od natlenienia i jest pod silnym wpływem metabolizmu otaczających ją komórek. Główne patologie oczu związane z uszkodzeniem komórek nerwowych to niedrożność naczyń siatkówki, jaskra i odwarstwienie siatkówki.

Niedrożność tętnicy siatkówki, jako przykład dla niedrożności naczyniowej siatkówki, prowadzi do nagłej utraty wzroku z powodu niedotlenienia wewnętrznej siatkówki1. Często wiąże się z ogólnymi patologiami naczyniowymi2 i prowadzi do trwałej utraty wzroku1, przy czym tylko 8% pacjentów znacznie odzyskuje ostrość wzroku1. Chociaż fibrynoliza tętnic została zasugerowana jako opcja leczenia, korzyści nie można było wykazać w randomizowanym badaniu klinicznym3.

Jaskra i odwarstwienie siatkówki mają wzrost stężenia glutaminianu4-6. Glutaminian w warunkach fizjologicznych występuje jako przekaźnik pobudzający w całym ośrodkowym układzie nerwowym i wewnętrznej siatkówce7,8. Podwyższony poziom glutaminianu stwierdzono nie tylko w jaskrze i odwarstwieniu siatkówki5,6, ale także w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej9. Wzrost glutaminianu może prowadzić do ekscytotoksyczności, a tym samym do uszkodzenia komórek nerwowych10. W większości przypadków odwarstwienia siatkówki, a w niektórych przypadkach proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej, konieczna jest operacja siatkówki (pars plana vitrectomia). Podczas manipulacji mechanicznej witrektomii pars plana jasne światło światłowodu lub naprężenie ścinające wywierane przez duże natężenia przepływu roztworów irygacyjnych podczas długich operacji wywierają dodatkowe obciążenie na siatkówkę11,12.

Wszystkie wymienione choroby mają wspólną cechę, że patologia jest zlokalizowana wyłącznie w siatkówce i stawiają społeczność okulistyczną przed wyzwaniem znalezienia sposobów ochrony siatkówki jako systemu neurosensorycznego.

Elektroretinogram (ERG) jest standardową metodą oceny funkcji fotoreceptorów in vivo (fala a) i funkcji wewnętrznej siatkówki (fala b). ERG jest mierzony za pomocą srebrnych elektrod wprowadzanych do rogówki, a oczy są stymulowane przez rosnący poziom światła w celu wykrycia wad w pręcikach lub czopkach lub w wewnętrznej siatkówce. Różne defekty siatkówki można wykryć na podstawie zmian amplitudy (siły odpowiedzi) lub opóźnienia (interwału czasu do odpowiedzi) ERG. Różne protokoły ERG i metody pomiaru (wzorzec-ERG, wieloogniskowy-ERG lub ERG jasnego pola) pozwalają na dalsze różnicowanie defektów. Technika izolowanej siatkówki została wprowadzona niedawno, co umożliwia ocenę wpływu na siatkówkę bez zakłóceń spowodowanych np. ogólnymi reakcjami badanego zwierzęcia13,14.

Celem tego badania było oszacowanie i wprowadzenie zdefiniowanego i ustandaryzowanego modelu stresu dla niedotlenienia i stresu glutaminianu na superpołączonej izolowanej siatkówce. W związku z tym mamy nadzieję, że uda nam się położyć podwaliny pod przyszłe badania nad neuroprotekcyjnym działaniem niektórych środków lub roztworów do irygacji wewnątrzgałkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie oczu bydlęcych

  1. Oczy bydlęce należy uzyskać bezpośrednio po uboju zwierzęcia.
  2. Transportować chronione oczy w "roztworze sierpowym", specjalnym podłożu zawierającym 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH2PO4, 13,5 mM Na2HPO4 i 5 mM glukozy w temperaturze pokojowej.
  3. Wykonaj przygotowanie siatkówki w ciemnych, dostosowanych warunkach przy słabym czerwonym świetle.
  4. Usuń przednią część oka. Wykonać nacięcie równikowe ok. 4 mm za rąbkiem. Następnie usuń rogówkę, tęczówkę, ciało rzęskowe i soczewkę w jednym kawałku. Utrzymuj siatkówki w roztworze sierpowym.
  5. Mechanicznie poluzuj przyczepy ciała szklistego do powierzchni siatkówki i wyjmij ciało szkliste z otwartej muszli ocznej.
  6. Następnie podzielić oko na cztery ćwiartki i wyciąć okrągłe obszary o średnicy ok. 7 mm za pomocą trepanacji.
  7. Delikatnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego i umieść ją na urządzeniu nagrywającym w pudełku chronionym przed światłem. Urządzenie rejestrujące składa się z plastikowego uchwytu z siatką pośrodku; Umieść siatkówkę na siatce, a następnie przymocuj plastikowym pierścieniem bezpośrednio do elektrod.
    UWAGA: Plastikowy konserwator posiada dwa kanały, które umożliwiają stały przepływ medium.

2. Zapis elektroretinogramu (ERG)

  1. W celu zarejestrowania elektroretinogramu należy użyć dwóch elektrod srebro/chlorek srebra po obu stronach siatkówki i wykonać perfuzję siatkówki ze stałą prędkością perfuzji ok. 1 ml/min i stałą temperaturą 37 °C. Należy użyć "roztworu sierpowatego" nasyconego tlenem.
  2. Przed rozpoczęciem pomiaru należy dostosować ciemną siatkówkę (chronić ją przed światłem podczas wszystkich pomiarów) i stosować odstępy między bodźcami wynoszące pięć minut. Użyj pojedynczej białej lampy ksenonowej 1 Hz do stymulacji o intensywności ustawionej na 6,3 mlx na powierzchni siatkówki.
  3. Używaj skalibrowanych filtrów o neutralnej gęstości i bodźca świetlnego 10 μs kontrolowanego przez timer, aby uzyskać optymalne odpowiedzi.
  4. Aby zmierzyć i przetworzyć dane, przefiltruj ERG i wzmocnij go (filtr górnoprzepustowy 100 Hz, filtr wycinający 50 Hz, 100 000 x amplifikacja) za pomocą wzmacniacza Grass RPS312RM. Spróbuj odfiltrować ewentualne przeszkadzające częstotliwości, które mogą zakłócać sygnał. Aby przetworzyć dane, użyj analogowo-cyfrowej karty akwizycji danych na komputerze stacjonarnym (kompatybilnej z komputerem PC).
  5. Po okresie adaptacji do ciemności przy stałej perfuzji zmierz amplitudy sygnału elektrycznego, aż do zarejestrowania stabilnych amplitud fali b.
    UWAGA: Amplitudy uważa się za stabilne, jeśli pięć pojedynczych pomiarów osiąga wartość średnią i odchyla się o mniej niż 10%. Dobry przykład pojedynczych pomiarów znajduje się na rysunku 1.
  6. Aby rozpocząć badanie, zastąp czysty tlen czystym azotem (liczba pojedynczych eksperymentów, n = 5) w celu zbadania niedotlenienia lub glutaminianem 250 μm (n = 5).
  7. Rejestruj reakcje elektryczne co 5 minut przez 45 minut.
  8. Po okresie testowym perfunduj siatkówki standardowym medium nasyconym tlenem przez 75 minut i obserwuj zmiany amplitudy fali b. To jest faza wypłukiwania. Zmierz amplitudę fali b od doliny fali a do szczytu fali b.
  9. Aby zbadać wpływ niedotlenienia lub glutaminianu na potencjał fotoreceptora w warunkach skotopowych, należy stłumić załamek b, dodając 1 mM do pożywki.
  10. Po zarejestrowaniu stabilnego potencjału fotoreceptora przez 30 minut, należy przeprowadzić procedurę jak poprzednio, wystawiając siatkówki na 45 minut na działanie różnych roztworów irygacyjnych z 1 mM asparaginianu. Użyj tego samego okresu wymywania (krok 2.8), jak wspomniano wcześniej.

3. Analiza danych

  1. Aby statystycznie ocenić dane, należy zapewnić rozkład normalny dla wszystkich danych, np. za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa15.
  2. Obliczyć zmniejszenie amplitud fal a i b w procentach po fazie ekspozycji w porównaniu z ostatnim pomiarem przed ekspozycją. Porównaj zmniejszenie amplitudy ERG po 45 minutach – na koniec okresu ekspozycji – z ERG zmierzonym przed zastosowaniem.
  3. Porównaj zafalowanie a i b na końcu fazy wymywania z odpowiednią amplitudą przed ekspozycją, aby zbadać możliwe odzysk.
  4. Do analizy statystycznej należy użyć oprogramowania JMP statistical software lub SPSS software. Obliczaj dane przez cały czas jako średnią ± odchylenie standardowe. Oszacować istotność za pomocą odpowiedniego testu statystycznego.
    UWAGA: Testy te mogą się różnić w zależności od zakresu eksperymentu. W tym ustawieniu użyj sparowanego testu t Studenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po 1 hr perfuzji preparatów siatkówki standardowym roztworem nasyconym tlenem (Ryc. 1A i B) amplitudy ERG wykazywały stabilizację oraz mniejszą zmienność amplitud pomiędzy pojedynczymi pomiarami. pH, ciśnienie osmotyczne, temperatura oraz pO2 (z wyjątkiem testów hipoksji) pozostawały stałe dla wszystkich prób.

Aby wyizolować sygnał fotoreceptorów z sygnału wewnętrznej warstwy siatkówki, do standardowego roztworu dodano 1 mM aspartanu w celu stłumienia fali b (Rycina...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu stwierdzono istotny wpływ na amplitudę załamka b po 45 minutach niedotlenienia. Redukcja ta była nadal znacząca po fazie wypłukiwania. Podobny wpływ na potencjał fotoreceptorów można zaobserwować.

Wyniki są poparte innymi opublikowanymi danymi16 i dają nam możliwość zbadania możliwych efektów neuroprotekcyjnych po niedotlenieniu.

Po 45-minutowej ekspozycji 250 μM glutaminianu stwierdziliśmy statystycznie istotny wpływ tylko na amplitudę fali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten artykuł jest dedykowany mojej ukochanej żonie Maren i naszemu małemu Karlowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
120 mM NaCl Merck Pharma, Niemcy1 064 041 000
2 mM KCl,   Merck Pharma, Niemcy1 050 010 250
0,1 mM MgCl2, Merck Pharma, Niemcy58 330 250
0,15 mM CaCl2Merck Pharma, Niemcy111 TA106282
1,5 mM NaH2PO4/13,5 mM Na2HPO4   Merck Pharma, Niemcy1 065 860 500
5 mM glukozyMerck Pharma, Niemcy40 741 000

Bibliografia

  1. Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
  2. Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
  3. Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
  4. Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
  5. Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
  6. Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
  7. Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
  8. Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
  9. Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
  10. Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
  11. Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
  12. Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
  13. Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
  15. Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
  16. Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
  17. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
  18. Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
  19. Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
  20. Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
  21. Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
  22. Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
  23. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stres glutaminianowymodel hipoksjiizolowana siatkówkarejestracja elektroretinogramupreparat siatkówki bydlęcejamplituda fali Aamplituda fali Btestowanie czynników neuroprotekcyjnychanaliza regeneracji ERGprotokół adaptacji do ciemności
Glutaminian i niedotlenienie jako model stresu dla izolowanej perfundowanej siatkówki kręgowców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.