Artykuł metodologiczny

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

DOI:

10.3791/52271

⸱

7 lipca 2015

 ,  ,  , 
1École d'optométrie, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę budowy jednorazowego "wtrysku" przy użyciu dostępnych na rynku i niedrogich części. Opracowano system sondowania, który pozwala na wstrzyknięcie leku przy jednoczesnym rejestrowaniu sygnałów elektrofizjologicznych z populacji neuronów dotkniętych chorobą. Ta metoda stanowi prostą i ekonomiczną alternatywę dla rozwiązań komercyjnych. Szklana pipeta została zmodyfikowana poprzez połączenie jej z igłą podskórną i srebrnym żarnikiem. Wstrzykiwacz jest podłączony do komercyjnej pompy mikrostrzykawkowej do podawania leku. W ten sposób uzyskuje się technikę, która zapewnia sprzężenie zwrotne farmakodynamiki w czasie rzeczywistym za pośrednictwem wielojednostkowych sygnałów zewnątrzkomórkowych pochodzących z miejsca dostarczania leku. Jako dowód słuszności koncepcji, zarejestrowaliśmy aktywność neuronalną z górnego wzgórka wywołaną przez błyski światła u szczurów, jednocześnie z dostarczaniem leków przez wstrzyknięcie. Zdolność zapisu iniekcji pozwala na funkcjonalną charakterystykę miejsca wstrzyknięcia, co sprzyja precyzyjnej kontroli nad lokalizacją podania leku. Zastosowanie tej metody wykracza również daleko poza to, co zostało tutaj zademonstrowane, ponieważ wybór substancji chemicznych ładowanych do wstrzykiwacza jest ogromny, w tym markery śledzące do eksperymentów anatomicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inaktywacja obszarów korowych i jąder podkorowych jest ważna w badaniu funkcjonalnych relacji między różnymi strukturami mózgu2-4. W najnowszej literaturze do badania roli struktur mózgu wykorzystano techniki chemiczne lub kriogeniczne związane z utratą funkcji2,5. Jeśli chodzi o mikroiniekcje farmakologiczne, małe objętości leków mogą być podawane do obszaru mózgu w kontrolowanym tempie, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ubocznych uszkodzeń otaczającej tkanki6,7. Technika ta może być stosowana do dostarczania określonych agonistów, odwrotnych agonistów lub antagonistów w celu zbadania wpływu różnych celów farmakologicznych na aktywność neuronalną. Takie efekty można również badać, mierząc zmiany w odpowiedziach neuronalnych z odległych lokalizacji, co pozwala naukowcom badać relacje między różnymi strukturami korowymi i podkorowymi.

Tutaj demonstrujemy montaż urządzenia, wtrysku, zdolnego zarówno do rejestrowania sygnałów elektrofizjologicznych, jak i dostarczania niewielkich ilości leków w miejscu docelowym. Demonstrujemy możliwości tego systemu, wstrzykując GABA, powszechny inhibitor aktywności neuronalnej, do wzgórka górnego szczura. Obszar ten jest wrażliwy na stymulację wzrokową, co pozwoliło nam na wykorzystanie wizualnie wywołanej aktywności wielojednostkowej w celu potwierdzenia lokalizacji iniekcji. Odwracalność inaktywacji oceniano na podstawie przywrócenia normalnej aktywności neuronalnej po zakończeniu wstrzyknięcia GABA.

Możliwość monitorowania aktywności wielu jednostek z miejsca wstrzyknięcia pozwala na precyzyjne dostrojenie szybkości i objętości iniekcji potrzebnych do osiągnięcia pożądanej odpowiedzi farmakodynamicznej. Dlatego zaletą tej techniki jest potencjalne ograniczenie uszkodzeń tkanek spowodowanych mikroperfuzją, ponieważ wstrzykiwane są najmniejsze efektywne objętości. Proponowany protokół zapewnia opłacalną metodę generowania jednorazowego sprzętu niezbędnego do przeprowadzania eksperymentów, w których pożądane jest dostarczanie leków i rejestrowanie lokalnej aktywności neuronalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Ochrony Zwierząt i Komisji Rewizyjnej ds. Etyki Uniwersytetu w Montrealu.

1. Montaż pipety rejestrująco-iniekcyjnej

  1. Wyciągnąć szklaną kapilarnę o długości około 7 cm (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do pipet.
  2. Przełam końcówkę kapilary i sprawdź otwór pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że średnica wewnętrzna wynosi od 30 μm do 40 μm.
  3. Włóż srebrny drut o długości 7 cm do szklanej kapilary tak, aby około 1 cm wystawał z niestożkowego końca szklanej pipety.
  4. Zegnij nadmiar filamentu prostopadle do szklanej kapilary.
  5. Nałożyć kroplę elastycznego kleju z tworzywa sztucznego na trzon igły podskórnej o sile 30 G.
  6. Wprowadzić igłę podskórną o sile 30 G do szklanej pipety zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1.
  7. Dodaj drugą warstwę kleju, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie od połączenia szklanej pipety z igłą podskórną.
  8. Pozostaw pipetę do wyschnięcia z końcówką skierowaną do góry na około 12 godzin, aby zapewnić prawidłowe utwardzenie kleju. Końcowy wynik pokazano na rysunku 2.

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w przypadku ostrych eksperymentów i sterylizacja końcówki pipety nie jest wymagana.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Umieść szczura w pudełku anestezjologicznym.
  2. Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu przez 5 do 10 minut.
  3. Umieść zwierzę na stole stereotaktycznym z poduszką grzewczą i sondą doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C. Użyj stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie 2% izofluranem. Zabezpiecz głowę szczura za pomocą nauszników i uchwytu na zęby.
  4. Zastosuj maść okulistyczną lub krople do oczu, które zawierają 1% kropli atropiny, aby pomóc w rozszerzeniu źrenic. Aby zapobiec wysuszeniu, stosuj krople nawilżające mniej więcej co 30 minut.
  5. Ogol głowę i oczyść ją 10% powidonem-jodem.
  6. W celu znieczulenia miejscowego wstrzyknąć 0,5 ml 2% lidokainy pod skórę głowy w 2-3 miejsca, unosząc skórę do góry i wkładając końcówkę igły.
  7. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i obserwując brak ruchu. Ponadto monitoruj tętno, aby upewnić się, że mieści się w normalnych wartościach (od 300 do 400 uderzeń/min).
  8. Naciąć skórę głowy w linii prostej wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela #10, aby odsłonić zarówno szwy czołowe, jak i strzałkowe.
  9. Odsłoń punkty Lambda i Bregma, odsuwając na bok tkankę pokrywającą czaszkę za pomocą szpatułki chirurgicznej.
  10. Wypoziomuj czaszkę tak, aby pozycje Bregma i Lambda znajdowały się na tej samej płaszczyźnie.
  11. Aby ustawić punkt odniesienia, użyj urządzenia stereotaktycznego z zamontowaną szklaną rurką, aby ustawić go tuż nad Bregmą. Będzie to "zero" dla współrzędnych pomiarów przednio-tylnych i przyśrodkowo-bocznych.
  12. Ustaw interesujący Cię punkt, przesuwając montaż stereotaktyczny do wymaganych współrzędnych, zanotuj współrzędne stereotaktyczne i narysuj kwadrat wokół obszaru docelowego, który oznacza miejsce, w którym zostanie wykonana kraniotomia.
  13. Użyj wiertła chirurgicznego ze sterylizowanym wiertłem wzdłuż zaznaczonego kwadratu powoli bez nacisku, aby powoli usunąć materiał kostny. Uważaj, aby nie wiercić zbyt długo w tym samym obszarze, ponieważ spowoduje to wytwarzanie ciepła i spowodowanie zmian w korze.
  14. Gdy kość ograniczająca kraniotomię stanie się wystarczająco cienka, ostrożnie usuń część czaszki pęsetą, aby odsłonić korę.
  15. Często przepłukuj odsłoniętą korę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
    UWAGA: Usuwanie opony twardej nie jest konieczne u szczura, ponieważ końcówka iniekcji jest wystarczająco mocna, aby ją przebić.

3. Napełnianie i montaż systemu wtryskowego

  1. Napełnij mikrostrzykawkę o pojemności 5-10 μl przez aspirację olejem mineralnym.
  2. Napełnij igłę podskórną stałą szklaną pipetą roztworem 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) i 300 μM kwasu γ-aminomasłowego (GABA) lub roztworem 2% lidokainy z 0,5% CSB 9. Rozcieńczyć wszystkie roztwory solą fizjologiczną.
    1. W przypadku obfitej ilości substancji należy napełnić ją zwykłą strzykawką i zastosować zwykłe techniki ostrożności, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    2. W przypadku droższych substancji, do napełnienia wtryskiwacza należy użyć oleju mineralnego, a następnie można wprowadzić środek chemiczny przez aspirację. Ponieważ różnica gęstości między olejem mineralnym a wodą jest stosunkowo duża, substancja ta jest dobrym kandydatem do wstrzykiwania roztworów wodnych.
      UWAGA: Można dodać barwnik, aby potwierdzić separację między obiema cieczami.
  3. Aby napełnić pipetę do wstrzykiwań, należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem przez aspirację, a następnie powoli wstrzyknąć roztwór do pipety iniekcyjnej.
  4. Zwrócić szczególną uwagę na nieszczelności w obszarach wskazanych na rysunku 1, pobierając wymaz z tych obszarów do czysta i obserwując wycieki, dalej powoli wstrzykując roztwór za pomocą strzykawki.
  5. Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml. Należy przy tym lekko naciskać na tłok, aby podciśnienie nie usunęło roztworu z pipety iniekcyjnej.
  6. Napełnić mikrostrzykawkę olejem mineralnym przez aspirację i mocno przymocować ją do napełnionej pipety iniekcyjnej, a następnie ostrożnie zetrzeć gazą nadmiar roztworu ze zmontowanej iniekcji.
  7. Sprawdzić, czy końcówka nie jest zablokowana, wstrzykując bardzo małą objętość, wystarczającą do zobaczenia małej kropli tworzącej się na końcówce szklanej pipety.
  8. Zamontuj wtryskiwacz w układzie mikropompy i upewnij się, że jest dobrze zamocowany.
  9. Ostrożnie ustaw końcówkę wtrysku na współrzędnych docelowych i opuść końcówkę na powierzchnię kory.
  10. Powoli opuścić iniekcję za pomocą aparatu stereotaktycznego do struktury docelowej (w tym przypadku wzgórka górnego) za pomocą odpowiednich współrzędnych anatomicznych.
  11. Przykryj odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.

4. Wtrysk i odwracalna dezaktywacja

  1. Ustawić pompę do mikroiniekcji tak, aby wstrzykiwała 400 do 800 nl przy 40 nl/min i nacisnąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć wstrzykiwanie. Należy pamiętać, że szybkość skoku będzie wykazywać zmniejszenie podczas wstrzykiwania.
    UWAGA: W konfiguracji eksperymentalnej aktywność neuronalna odzyskała się w ciągu godziny po zakończeniu dostarczania GABA. Każde skalibrowane urządzenie mechaniczne może być użyte do wywierania nacisku na strzykawkę do mikroiniekcji w celu przeprowadzenia wstrzyknięcia.
  2. Po uzyskaniu danych elektrofizjologicznych należy poddać się eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną Wspólnotę Etyki Zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa wtryskiwacza jest zilustrowana na rysunku 1. Srebrny drut (C) jest wprowadzany do szklanej pipety (D) z częścią drutu zagiętą i wystającą z otworu. Igła 30 G (B) jest przymocowana i uszczelniona do otworu szklanej pipety za pomocą kleju. Po napełnieniu pipety substancją do wstrzykiwań, do igły dołącza się szklaną mikrostrzykawkę (A). Ważne jest, aby w miejscu, w którym mikrostrzykawka łączy się z igłą (E) i gdzie srebrny drut wystaje ze szklanej pipety (F), było dobre uszczelnienie. Rysune...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponowany protokół został opracowany w celu rozwiązania problemów wynikających z obecnych metod odwracalnej inaktywacji. W szczególności projekt ten miał na celu udoskonalenie metod stosowanych do chemicznych mikroiniekcji substancji modulujących aktywność neuronalną, w szczególności w głębokich strukturach mózgu. Wyzwaniem technicznym wynikającym z tego typu konfiguracji jest konieczność kolokalizacji obu sond w tej samej ograniczonej przestrzeni in vivo w celu uzyskania precyzyjnych zapisów w miejscu wstrzyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez granty z CIHR (MOP231122) i NSERC (RGPIN-2014-06503). Dziękujemy Geneviève Cyr za pomoc w przygotowaniu eksperymentów i nadzorowaniu prac laboratoryjnych. MAL otrzymał stypendium od The Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa wtryskowa (UltraMicroPump III)WPI
Konsola wtryskowa (sterownik Micro4)WPI#SYS-MICRO4
Strzykawka HamiltonHamliton(80301) 701LT 10 µ LStrzykawki SYR od 5 do 10 i mu; l
używany Elastyczny klej do tworzyw sztucznychLepage393915Forma żelu jest łatwiejsza do nałożenia na trzon 30  G igła podskórna tworząca wodoodporne uszczelnienie po wyschnięciu.
Pipety szklaneWPI#TW100F-4Cienkościenne, 1  mm OD, 0,75  mm ID z używanymi pipetami z filamentem
720 Ściągacz do pipet igłowychKopf720
Srebrny drutA-M Systems, Inc.782500Gołe 0,010"
#UMP3

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
  2. Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
  3. Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
  4. Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
  5. Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
  6. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
  7. Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
  8. Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
  9. Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  10. Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
  11. Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Electrophysiological RecordingMicro injectionsInjectrode ConstructionSuperior ColliculusGABA SolutionGlass PipetteHypodermic NeedleSilver WireMicrosyringe PumpMulti unit Activity

Powiązane artykuły