Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52281

⸱

22 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Streszczenie

Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są popularnym systemem biomimetycznym do badania zjawisk związanych z błonami. Jednak powszechnie stosowane protokoły hodowli GUV muszą zostać zmodyfikowane w celu utworzenia GUV zawierających funkcjonalne białka transbłonowe. W tym artykule opisano dwie metody odwodnienia i ponownego nawodnienia - elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem - w celu wytworzenia GUV zawierających kanał potasowy bramkowany napięciem, KvAP. W obu metodach roztwór małych pęcherzyków jednowarstwowych zawierających białko jest częściowo odwadniany w celu utworzenia stosu błon, który następnie pozostawia się do pęcznienia w buforze nawadniającym. W przypadku metody elektroformacji folia jest osadzana na elektrodach platynowych, dzięki czemu podczas ponownego nawodnienia folii można zastosować pole prądu przemiennego. Natomiast metoda pęcznienia wspomaganego żelem wykorzystuje podłoże z żelu agarozowego w celu zwiększenia nawilżenia filmu. Obie metody mogą wytwarzać GUV w niskich (np. 5 mM) i fizjologicznych (np. 100 mM) stężeniach soli. Powstałe GUV są charakteryzowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a funkcja odtworzonych kanałów jest mierzona przy użyciu konfiguracji patch-clamp inside-out. Podczas gdy pęcznienie w obecności zmiennego pola elektrycznego (elektroformacja) daje wysoką wydajność wolnych od wad GUV, metoda pęcznienia wspomaganego żelem zapewnia bardziej jednorodną dystrybucję białek i nie wymaga specjalnego sprzętu.

Wprowadzenie

Podczas badania fizycznych zasad rządzących żywymi systemami, podejścia oddolne pozwalają eksperymentatorowi kontrolować skład systemu i inne parametry, które nie są łatwo manipulowane w systemach opartych na komórkach1. W przypadku procesów opartych na błonach gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV, średnica ~ 1–100 μm) okazały się bardzo użytecznym systemem biomimetycznym2–7, ponieważ dobrze nadają się do badań mikroskopowych i mikromanipulacji8–10. Chociaż istnieje wiele różnych protokołów wytwarzania GUV, większość z nich dzieli się na dwie kategorie - podejścia oparte na emulsji11,12 i techniki oparte na ponownym uwodnieniu filmu lipidowego 13-16. W metodach opartych na emulsji wewnętrzne i zewnętrzne płatki membran GUV są składane sekwencyjnie z monowarstw lipidowych na granicy faz woda/olej. Takie podejście jest idealne do kapsułkowania rozpuszczalnych białek w GUV oraz do tworzenia GUV o asymetrycznym składzie lipidowym płatka. Jednak GUV utworzone z emulsji mogą zatrzymywać śladowe ilości rozpuszczalnika, które zmieniają właściwości mechaniczne membrany17, a podejście to nie jest szczególnie odpowiednie do rekonstytucji białek transbłonowych.

Metody rehydratacji filmu polegają na fakcie, że suszenie (odwodnienie) powoduje, że wiele mieszanin lipidowych tworzy wielopłytkowy stos błon. Jeśli ten stos zostanie następnie umieszczony w kontakcie z wodnym buforem, membrany w stosie będą się rozsuwać, gdy rozpuszczalnik przepływa między nimi, a na powierzchni stosu, poszczególne membrany mogą się oderwać, tworząc GUVs13,18 (a także istne zoo innych obiektów lipidowych). Jednak nawet w przypadku optymalnego składu buforowego i lipidowego ta klasyczna metoda "spontanicznego pęcznienia" daje stosunkowo niską wydajność wolnych od wad GUV. Jedną z powszechnie stosowanych metod zwiększania wydajności wolnych od wad GUV jest "elektroformacja", w której podczas ponownego nawodnienia filmu stosuje się pole prądu przemiennego (AC). Chociaż mechanizm pozostaje słabo poznany, "elektroformacja" może dać spektakularne plony GUV (> 90% w sprzyjających warunkach) dla o niskim stężeniu soli (< 5 mM)14,19, a nawet może pracować w fizjologicznych (~100 mM) przy użyciu pola prądu przemiennego o wyższej częstotliwości (500 Hz w porównaniu z 10 Hz) i elektrod platynowych15. Alternatywnym podejściem do zwiększenia wydajności wolnych od wad GUV jest "pęcznienie wspomagane żelem", w którym roztwór lipidowy osadza się na podłożu z żelu polimerowego, a nie na podłożach pasywnych (np. szkło, PTFE) stosowanych w klasycznym "pęcznieniu spontanicznym". Gdy powstały w ten sposób film lipidowo-żelowy jest ponownie uwodniony, GUV mogą szybko tworzyć się nawet dla fizjologicznych16,20.

Wszystkie te metody mogą wytwarzać GUV zawierające tylko lipidy, które mogą być używane do badania zjawisk związanych z błonami, takich jak interakcje między rozpuszczalnymi białkami a błonami. Jednakże, aby włączyć białko transbłonowe do GUV, potrzebne są znaczne modyfikacje, aby zapewnić, że białko pozostaje w stanie funkcjonalnym przez cały proces rekonstytucji. Podczas gdy roztwory lipidów w rozpuszczalnikach organicznych (np. chloroform, cykloheksan) są idealne do wytwarzania filmów lipidowych, białka transbłonowe są zazwyczaj stabilne tylko wtedy, gdy ich hydrofobowa domena transbłonowa jest osadzona w dwuwarstwie lipidowej lub otoczona micelią detergentową (np. Podczas oczyszczania białek). Tak więc materiałem wyjściowym do rekonstytucji są zazwyczaj natywne błony, oczyszczone białko w roztworze detergentu lub małe pęcherzyki zawierające białko jednowarstwowe (proteo-SUV) i/lub pęcherzyki wieloblaszkowe (proteo-MLV) powstałe w wyniku usunięcia detergentu w obecności lipidów. Większość metod włączania tych białek błonowych do GUV można podzielić na trzy kategorie.

Bezpośrednie wprowadzanie: Białko trans-błonowe zawieszone w detergencie jest mieszane z wstępnie uformowanymi, tylko lipidami, łagodnie rozpuszczalnymi w detergentach GUV, a następnie detergent usuwany za pomocą biokulek21. Chociaż metoda ta jest koncepcyjnie prosta, wymaga precyzyjnej kontroli stężenia detergentu, ponieważ zbyt wysokie stężenie detergentu może rozpuścić GUV, podczas gdy zbyt niskie stężenie może spowodować rozwijanie się lub agregację białka.

GUV/Proteo-SUV Fusion: Białko w proteo-SUVs jest łączone z wstępnie uformowanymi, tylko lipidowymi GUV, a fuzja jest ułatwiona za pomocą specjalnych peptydów fuzogennych22 lub detergentu21. Zazwyczaj zakres fuzji jest ograniczony, co prowadzi do GUV o niskiej gęstości białka.

Odwodnienie/Ponowne nawodnienie: Warstwa lipidowa zawierająca białko powstaje w wyniku częściowego odwodnienia roztworu proteo-SUV (lub proteo-MLV), a następnie GUV są hodowane jak w przypadku czystego filmu lipidowego. Oczywistym wyzwaniem jest ochrona białka podczas etapu częściowego odwodnienia23, ale metoda ta została z powodzeniem zastosowana do rekonstytucji białek transbłonowych, takich jak bakteriorodopsyna, ATPaza wapnia, integryna i VDAC do GUV7,23–25.

Ten artykuł opisuje protokoły odwodnienia/ponownego nawodnienia w celu wytworzenia GUV zawierających bramkowany napięciem kanał potasowy, KvAP, z hiper-termofilnych Archeonów, Aeropyrum pernix. KvAP ma wysoki stopień homologii do eukariotycznych kanałów potasowychzależnych od napięcia 26 i znanej struktury krystalicznej27, co czyni go dobrym modelem do badania mechanizmu bramkowania napięcia. Produkcja proteo-SUV-ów została szczegółowo opisana wcześniej i nie jest częścią tego samouczka26,28,29. Co ważne, proteo-SUV KvAP nie muszą być produkowane dla każdego preparatu GUV, ponieważ mogą być przechowywane w małych (np. 10 μl) podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas (> 1 rok). Elektroformacja lub pęcznienie wspomagane żelem mogą być następnie wykorzystane do wyhodowania GUV z proteo-SUV KvAP (lub proteo-MLV).

Kluczowe kroki protokołu elektroformacji są zilustrowane na rysunku 1. Kropelki roztworu SUV zawierającego białko osadzają się na drutach platynowych (pokazanych na rysunku 2). Częściowe odwodnienie zawieszenia SUV-a prowadzi do powstania filmu lipidowo-białkowego poprzez fuzję SUV-ów. Podczas ponownego nawodnienia do elektrod przykładane jest pole prądu przemiennego, które wspomaga rozwarstwianie się warstw lipidowych i tworzenie GUV. Pole o częstotliwości 10 Hz działa dobrze przy użyciu buforu nawadniającegoo "niskiej zawartości soli" (< 5 mM), a GUV potrzebują kilku godzin, aby rosnąć. Natomiast fizjologiczne (zawierające ~100 mM soli) dobrze sprawdzają się przy polu prądu przemiennego o niższym napięciu 500 Hz, ale wymagają wydłużonego (~12 godzin) okresu pęcznienia15. Metoda ta opiera się na wcześniejszym protokole wykorzystującym slajdyITO 24, ale wykorzystuje niestandardową komorę zawierającą dwa druty platynowe, jak pokazano na rysunku 2 (zobacz dyskusję na temat szczegółów projektu i sugestii dotyczących prostszych, improwizowanych komór).

Rysunek 3 ilustruje metodę pęcznienia wspomaganego żelem. Protokół dobrze współpracuje z o fizjologicznych stężeniach soli, jest szybki i wytwarza GUV o bardziej jednorodnym rozmieszczeniu białek. Jednak wydajność izolowanych, pozornie wolnych od wad GUV (tj. membrana GUV jest jednolita w skalach długości optycznej i nie obejmuje żadnych obiektów) jest niższa, chociaż zapewnia wystarczającą liczbę do eksperymentów z patch-clamp i mikromanipulacją. Metoda ta opierała się na protokole wykorzystującym żel agarozowy do produkcji GUV16 zawierających tylko lipidy i wymaga mniej specjalistycznego sprzętu niż metoda elektroformacji.

Opisano charakterystykę GUV za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a także procedury wykorzystujące standardowe ustawienie patch-clamp do pomiaru aktywności KvAP w wyciętych łatach membranowych "od wewnątrz-na zewnątrz".

Uprawa GUV zawierających białko może być trudniejsza niż GUV zawierających tylko lipidy. W szczególności ostateczny uzysk GUV może zależeć w dużej mierze od tego, w jaki sposób roztwór SUV jest osadzany i odwadniany w celu utworzenia stosu membranowego. Dla kogoś, kto nie ma żadnego wcześniejszego doświadczenia z GUV, pomocne może być najpierw wyhodowanie GUV zawierających tylko lipidy zgodnie z konwencjonalnym protokołem15,16, w którym film błonowy jest tworzony przez osadzanie lipidów z rozpuszczalnika organicznego. Gdy konwencjonalny protokół działa dobrze, osadzanie SUV i częściowe odwodnienie można opanować za pomocą SUV-ów zawierających tylko lipidy, które są również bardzo pomocne przy dostosowywaniu protokołu do nowego składu lipidowego. Kiedy GUV rosną niezawodnie z SUV-ów zawierających tylko lipidy, to już tylko mały krok do wytworzenia GUV zawierających białko z proteo-SUV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować 5 ml "buforu SUV" zawierającego 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) lub TRIS (pH 7,5) i 2 mM trehalozy. Przefiltrować bufor za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i podzielić na 1 ml porcji, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Dodatkowe informacje dotyczące odczynników i przyrządów znajdują się w wykazie materiałów.
  2. Przygotuj 40 ml GUV 'Growth Buffer', który wypełni wnętrze GUV podczas ponownego nawodnienia filmu. Aby uzyskać wzrost o "niskiej zawartości soli", połącz 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) lub 1 mM TRIS (pH 7,5) i ~400 mM sacharozy. Aby uzyskać wzrost "soli fizjologicznej", połącz 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) lub 5 mM TRIS (pH 7,5) i ~200 mM sacharozy.
  3. Przygotować 40 ml "buforu obserwacyjnego" do roztworu zewnętrznego w komorze doświadczalnej, łącząc 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) lub 5 mM TRIS (pH 7,5) i ~200 mM glukozy.
    UWAGA: Te są tylko przykładami. Zapoznaj się z dyskusją, aby dostosować do innych eksperymentów.
  4. Zmierz osmolarność wzrostu i obserwacji za pomocą osmometru. Dodaj granulki sacharozy lub glukozy, aby dopasować je z dokładnością do 1%, aby GUV nie uległy lizie lub zapadnięciu się po przeniesieniu z komory wzrostowej do komory obserwacyjnej.
    UWAGA: W tym zakresie stężeń dodanie 1 mM sacharozy (13,7 mg na 40 ml) lub glukozy (7,2 mg na 40 ml) zwiększa osmolarność o ~ 1 mOsm.
  5. Przefiltrować wzrostu i obserwacji za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać je w temperaturze 4 °C, aby zahamować rozwój bakterii.
  6. Rozpuścić 50 mg beta-kazeiny w 10 ml 20 mM buforu TRIS (pH 7,5) w celu wytworzenia roztworu beta-kazeiny o stężeniu 5 mg/ml potrzebnego do pasywacji powierzchni komór doświadczalnych, tak aby GUV nie przywierały, nie rozprzestrzeniały się i nie pękały. Po całkowitym rozpuszczeniu beta-kazeiny (do kilku godzin w temperaturze 4 °C) przefiltrować ją (0,2 μm) do 0,5 ml podwielokrotności, które można błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania (rozmrożone podwielokrotności przechowywane w temperaturze 4 °C można zwykle stosować przez okres do 1 tygodnia).

2. Przygotowanie do SUV-a

  1. Przygotowanie i zamrożenie podwielokrotności proteo-SUV zgodnie z wcześniej opublikowanym szczegółowym protokołem28. Stosować KvAP znakowany fluorescencyjnie maleimidem Alexa-488, rozpuszczony do DPhPC SUV (10 mg / ml) w stosunku białka do lipidów 1:10 (masowo).
    UWAGA: KvAP typu dzikiego zawiera jedną cysteinę na monomer znajdujący się w pobliżu wewnątrzkomórkowego C-końca (aminokwas 247).
  2. Fluorescencyjne SUV-y z samymi lipidami:
    UWAGA: Z chloroformem należy obchodzić się pod wyciągiem w rękawicach nitrylowych i okularach ochronnych. Unikaj używania jakiegokolwiek tworzywa sztucznego, ponieważ chloroform może je rozpuścić. Roztwory chloroformu można przechowywać w fiolkach ze szkła oranżowego z teflonowymi nakrętkami i przenosić za pomocą szklanych strzykawek. Należy pamiętać, aby wypłukać wszystkie szklane naczynia chloroformem co najmniej 5 do 10 razy przed i po pipetowaniu lipidów.
    1. Przygotować 100 μl 10 mg/ml DPhPC SUVs zawierających 0,5% mol czerwonego fluorescencyjnego lipidu, Texas Red-DHPE, mieszając 100 μl roztworu DPhPC (10 mg/ml w chloroformie) z 8,2 μl roztworu Texas Red-DHPE (1 mg/ml w metanolu) w 1,5 ml fiolce ze szkła pomarańczowego.
    2. Wysuszyć lipidy pod strumieniem azotu w kapturze chemicznym, obracając fiolkę. Gdy film wydaje się być suchy, umieść lipidy w próżni na 3 godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika.
    3. Dodać 100 μl buforu SUV do lipidów i energicznie wirować, aż żaden lipid nie pozostanie przyklejony do ścianek fiolki, a roztwór będzie jednolicie mleczny.
    4. Sonikować roztwór lipidów, aby utworzyć SUV-y. Dostosować położenie fiolki do momentu, gdy ultradźwięki spowodują największy ruch i przepływ wewnątrz fiolki i należy uważać, aby niepotrzebnie nie podgrzać roztworu. Kontynuuj sonikację, aż roztwór stanie się przezroczysty lub, jeśli to możliwe, przezroczysty (2-5 minut w przypadku sonikacji końcówki, ~20 minut w przypadku sonikacji w kąpieli).
    5. Podwielokrotne SUV-y (np. 10 μl lub 20 μl) i zamrozić (-20 °C) do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Lipidy, zwłaszcza lipidy nienasycone, mogą łatwo się rozpadać. Roztwory lipidów należy przechowywać w temperaturze 20 °C (lub 80 °C) w atmosferze argonu i zużyć w ciągu 6 miesięcy. Produkty rozpadu lipidów można wykryć za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.

3. Wzrost GUV przez elektroformację

  1. Przygotuj komorę galwanizacji.
    1. Jeśli komora nie została wyczyszczona, zdejmij okna, zetrzyj całe szczeliwo i tłuszcz, wyjmij druty, a następnie spłucz i wyszoruj komorę chusteczką na przemian używając wody i etanolu (≥70%).
    2. Dobrze przetrzyj druty, zanurz druty i komorę w acetonie i poddaj sonikacji przez 5 minut. Przetrzyj wszystko ponownie chusteczką za pomocą acetonu. Umieść komorę w etanolu i poddaj sonizacji przez 5 minut.
    3. Zmontuj komorę, wkładając przewody przez otwory, a następnie obróć i wytrzyj przewody, aby upewnić się, że są czyste. Umieść komorę w wodzie destylowanej, sonikuj przez 5 minut i osusz komorę strumieniem azotu lub powietrza.
  2. Przygotować 30 μl zawiesiny SUV o stężeniu 3 mg/ml w buforze do SUV-ów. Aby utworzyć GUV zawierające białko, połącz 8 μl proteo-SUV (DPhPC 10 mg/ml KvAP 1:10), 2 μl fluorescencyjnych SUV (10 mg/ml DPhPC, 0,5% mol. TexasRed-DHPE) i 20 μl buforu SUV w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać końcowy stosunek białka do lipidów (masa) 1:12,5 i 0,1 mol% TexasRed-DHPE. Energicznie wymieszaj roztwór.
    1. Alternatywnie, aby przećwiczyć protokół z SUV-ami zawierającymi tylko lipidy, po prostu połącz 10 μl fluorescencyjnych SUV-ów (10 mg/ml DPhPC i 0,5% mol% TexasRed-DHPE) z 20 μl buforu SUV.
  3. Zdeponuj rozwiązanie SUV.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 2 μl lub szklanej strzykawki o pojemności 5 μl nanieść małe (<0,2 μl) kropelki roztworu SUV na przewody. Potrzeba około 1 μl roztworu, aby uformować serię kropel wzdłuż 1 cm drutu. Upewnij się, że krople są wystarczająco małe i oddalone od siebie na tyle daleko, aby się nie stykały ani nie łączyły.
    2. Pozostaw zdeponowane SUV-y do wyschnięcia na ~30 minut na świeżym powietrzu. Gdy wszystkie krople opadną, obróć drut, aby osady lipidów były łatwiejsze do zaobserwowania pod mikroskopem.
      UWAGA: Jeśli SUV-y nie wyschną wystarczająco, mogą po prostu zmyć druty po dodaniu bufora wzrostu, a zbyt duże suszenie może uszkodzić białko. Ponieważ wilgotność powietrza wpływa na szybkość suszenia, czas suszenia i/lub wilgotność powietrza można regulować w celu uzyskania optymalnych rezultatów30. Warstwa lipidowa na drutach powinna być widoczna pod mikroskopem.
  4. Zmontuj komorę.
    1. Uszczelnij dno komory: Za pomocą strzykawki nałóż smar próżniowy na dno komory wokół trzech dołków i delikatnie dociśnij do niego szkiełko nakrywkowe o wymiarach 40 mm x 22 mm, aby uszczelnić dno komory tak, aby przylegało bez szczeliny. Uszczelnij boki komory (w miejscu, w którym wychodzą przewody) pastą uszczelniającą. Nałóż smar próżniowy na wierzch komory, obrysowując trzy dołki.
    2. Powoli dodawaj bufor wzrostu, aż każda studzienka zostanie wypełniona do góry. Unikaj gwałtownego ruchu roztworu w studzienkach, ponieważ może to spowodować zerwanie filmu lipidowego z elektrod.
    3. Zamknij komorę, delikatnie dociskając suwak górnej pokrywy do smaru, uważając, aby nie przesunąć dolnego szkiełka nakrywkowego. Użyj chusteczki, aby usunąć wszelkie krople buforu z krawędzi górnego szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Jest to dobry moment na zbadanie komory pod mikroskopem, aby potwierdzić, że film lipidowy pozostał na przewodach.
  5. Podłącz generator sygnału do przewodów za pomocą dwóch zacisków krokodylkowych. Ustaw częstotliwość (10 Hz/500 Hz sinusoida dla buforu o niskiej/wysokiej soli) i użyj multimetru do pomiaru i dostosowania napięcia na przewodach do 0,7/0,35 V średniej kwadratowej (Vrms) dla buforu o niskiej/wysokiej soli. Przykryj komorę folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem. Pozostaw GUV do wzrostu na 2 do 3 godzin w przypadku buforu o niskiej zawartości soli i 12 godzin lub O/N w przypadku buforu o wysokiej zawartości soli.
  6. Odłącz komorę od generatora i ostrożnie umieść ją na odwróconym mikroskopie, aby ocenić wzrost GUV. Stosowanie powolnych, jednostajnych ruchów lub przepływu płynu w studniach może przedwcześnie oderwać GUV od przewodów.
    UWAGA: GUV na krawędziach drutu są zwykle widoczne w kontraście fazowym (obiektyw o dużej odległości roboczej 40X), podczas gdy GUV w dowolnym miejscu na dolnej połowie przewodów można zobaczyć z epifluorescencją. Jeśli nie widać żadnych GUV, spróbuj obrócić przewody, aby spojrzeć na górną powierzchnię. GUV mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w komorze wzrostowej przez kilka dni.

4. Wzrost GUV przez pęcznienie wspomagane żelem

  1. Przygotować 10 ml 1% roztworu agarozy, mieszając 100 mg agarozy z 10 ml czystej wody. Podgrzej go, aż się zagotuje, umieszczając go w kuchence mikrofalowej o mocy 480 W na ~20 sekund. Mieszaj, aby upewnić się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby ponownie podgrzać.
  2. Wyczyść plazmowo (plazma powietrzna) szkiełko nakrywkowe przez 1 minutę, aby roztwór agarozy ładnie się na nim rozprowadził. Szkiełka nakrywkowe należy zużyć w ciągu najbliższych 15 minut, ponieważ efekt czyszczenia plazmowego szybko mija.
  3. Nałóż 200 μl ciepłego roztworu agarozy na każde szkiełko o wymiarach 22 x 22mm2, tak aby roztwór zwilżył całą powierzchnię. Przechyl szkiełko w pionie i dotknij dolną krawędzią chusteczki, aby usunąć nadmiar płynu i pozostawić na szkiełku tylko cienką, gładką warstwę agarozy.
  4. Umieść szkiełko na płycie grzejnej lub piekarniku w temperaturze 60 °C i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut. Film agarozowy jest ledwo widoczny gołym okiem. Po ostygnięciu szkiełek do temperatury pokojowej należy je natychmiast zużyć lub przechowywać do tygodnia w zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C.
  5. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą na standardowej szalce Petriego o średnicy 3,5 cm.
  6. Przygotować roztwór SUV jak w sekcji 3.2 i delikatnie nałożyć ~15 μl roztworu SUV (3 mg/ml lipidów) w ~30 bardzo małych kroplach na powierzchnię agarozy. Uważaj, aby nie zniekształcić zbytnio warstwy agarozy.
  7. Umieść szkiełko pod delikatnym strumieniem azotu na około 10–15 minut i śledź wzrokowo parowanie buforu, gdy kropelki wysychają.
  8. Jak tylko SUV-y wyschną, dodaj bufor wzrostu, aby pokryć powierzchnię zjeżdżalni. Na małą szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm użyj ~1 ml buforu.
  9. Pozwól, aby pęcznienie postępowało przez ~ 30 minut, a następnie zbadaj wzrost GUV w komorze za pomocą odwróconego mikroskopu z kontrastem fazowym lub kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC).
    UWAGA: Obserwacja epifluorescencji jest trudna ze względu na silne tło fluoroforów w żelu i autofluorescencję agarozy.

5. Zbieranie i obserwacja GUV

  1. Pasywować komorę obserwacyjną (np. małą szalkę Petriego lub szklane szkiełko nakrywkowe), aby GUV nie przywierały, nie rozprzestrzeniały się i nie pękały na dnie komory. Przykryj dno komory roztworem beta-kazeiny, inkubuj przez 5 minut, wypłucz roztwór kazeiny czystą wodą, osusz strumieniem powietrza lub azotu, a na koniec dodaj bufor obserwacyjny (np. głębokość ~5 mm dla małej szalki Petriego).
  2. Zbierz GUV. Odetnij końcówkę końcówki do pipet o pojemności 100 μl tak, aby otwór był większy (średnica ~2 mm) i powoli zasysaj, ponieważ naprężenia ścinające podczas pipetowania mogą łatwo zniszczyć GUV.
    1. W przypadku galwanicznie formowanych GUV otwórz komorę wzrostu, delikatnie wyjmując górne szkiełko nakrywkowe. Umieść końcówkę pipety bezpośrednio nad każdym drutem i zassaj ~50 μl, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż drutu, aby odłączyć GUVs.
      UWAGA: Pomocne może być obrócenie drutu w celu zebrania GUV po "drugiej stronie" drutu.
    2. W przypadku GUV "wspomaganego żelem" najpierw kilkakrotnie postukaj w bok szalki Petriego, aby pomóc GUV oderwać się od powierzchni szkiełka nakrywkowego. Umieść końcówkę pipety tuż nad szkiełkiem nakrywkowym i zassaj 50 μl, jednocześnie pociągając końcówkę z powrotem po powierzchni. Zebrane GUV należy przenieść bezpośrednio do komory obserwacyjnej lub przechowywać w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  3. Umieść komorę obserwacyjną na odwróconym mikroskopie, dodaj GUV do komory obserwacyjnej i poczekaj kilka minut, aż GUV osiądą na dnie komory.
  4. Zbadaj komorę za pomocą kontrastu fazowego lub DIC, aby szybko zlokalizować gładkich, sferycznych ("wolnych od wad") "kandydatów na GUV". Zbadaj każdego "kandydata na GUV" w epifluorescencji, aby wykluczyć jakiekolwiek zawierające mniejsze liposomy zagnieżdżone w środku. Na koniec sprawdź, czy intensywność fluorescencji lipidów jest jednolita i zgodna z pojedynczą błoną (tj. jednopłytkową).
    UWAGA: W niektórych pęcherzykach dwupłytkowych (lub wielopłytkowych) błony są zbyt blisko siebie, aby można je było rozwiązać, więc wydają się jednopłytkowe na obrazach kontrastu fazowego lub DIC. Jednak obiekty te można odróżnić od rzeczywistych jednopłytkowych GUV po ich fluorescencji lipidowej, która jest dwa razy (lub więcej) jaśniejsza.

6. Łatki zaciskające GUV

  1. Pipety krosowe o średnicy końcówki 1–2 μm należy wykonać ze standardowego borokrzemianowego szkła kapilarnego, korzystając z programu zalecanego dla ściągacza do pipet.
    UWAGA: Specjalne zabiegi, takie jak polerowanie ogniowe, nie są konieczne, a pipety mogą być używane przez kilka dni po wyciągnięciu, jeśli są przechowywane w zamkniętym pudełku.
  2. Pasywować komorę przez inkubację z roztworem beta-kazeiny (5 mg/ml), aby upewnić się, że GUV nie przylegają, nie rozprzestrzeniają się i nie pękają na powierzchni komory. Spłucz kazeinę po 5 minutach.
  3. Włóż elektrodę uziemiającą, napełnij komorę buforem obserwacyjnym, przenieś 10 μl zawiesiny GUV zgodnie z opisem w krokach 5.2 i 5.3 i odczekaj kilka minut, aż GUV osiądą.
  4. Napełnij świeżą pipetę łatową roztworem (buforem obserwacyjnym lub innym roztworem izoosmotycznym) i zamontuj ją na patch-clamp amplifier headstage.
  5. Przeszukać komorę w celu zlokalizowania "wolnego od wad" GUV, jak opisano w sekcji 5.4, i sprawdzić, czy zawiera białko fluorescencyjne.
  6. Zastosuj stałe nadciśnienie (> 100 Pa lub około 1 cm H2O w manometrze), aby utrzymać wnętrze pipety z plastrem w czystości, a następnie włóż pipetę z plastrem do komory. Umieść pipetę z plastrem w polu view, zastosuj impulsy testowe w celu zmierzenia/skompensowania przesunięcia napięcia i rezystancji pipety, a następnie sprawdź pipetę w świetle fluorescencyjnym, aby potwierdzić, że końcówka jest czysta.
  7. Zbliżyć pipetę z plastrem do GUV i w razie potrzeby jednocześnie zmniejszyć nadciśnienie, aby przepływ na zewnątrz z pipety plastrowej nie powodował, że GUV "uciekał". Gdy pipeta z plastrem znajdzie się blisko pipety z plastrem, zastosuj podciśnienie (do 5 cm H2O), aby przyciągnąć GUV do pipety z plastrem. Monitoruj opór, gdy "język" membrany GUV wchodzi do pipety z plastrem i tworzy się gigaseal.
  8. Jeśli gigaseal nie utworzył się, wyjmij pipetę z plastrem z komory i wróć do kroku 6.4. Jeśli plaster z membraną utworzył gigaseal, ale GUV pozostaje przymocowany do pipety, należy wyciąć plaster, odrywając go od GUV, rozsadzając GUV o dno komory lub na krótko wyjmując pipetę z roztworu.
  9. Gdy łatka membrany wywrócona na lewą stronę została wycięta z GUV, a gigaseal jest stabilny, wyłącz impulsy testowe i zastosuj protokół napięcia, taki jak ten pokazany na rysunku 13.
    UWAGA: Rysunek 13 jest zgodny ze standardową konwencją elektrofizjologiczną dla łaty wywróconej na lewą stronę, w której prąd płynący do elektrody łatkowej jest "dodatni", a V =kąpiel V –pipeta V. Trzymanie łaty na ujemnym potencjale (np. V = -100 mV) przez ~30 sekund umieszcza KvAP w stanie spoczynku, podczas gdy kroki (od 100 ms do 5 sekund) do bardziej dodatnich potencjałów (np. V = 100 mV) mogą następnie wprowadzić go w przewodzące (tj. otwarte) stany aktywne.
  10. Po zakończeniu pomiarów na łacie membranowej należy przerwać łatkę za pomocą impulsu impulsowego lub impulsu ciśnienia i sprawdzić, czy przesunięcie napięcia elektrody łatki nie uległo przesunięciu. Wyjąć pipetę z plastrem z komory i powrócić do kroku 6.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzrost GUV można szybko ocenić, badając komorę wzrostową pod mikroskopem. W przypadku elektroformowania GUV mają tendencję do wzrostu w grupach wzdłuż drucików platynowych, co przedstawiono na Rysunku 4. Podczas pęcznienia wspomaganego żelem GUV pojawiają się jako struktury sferyczne, które szybko rosną i łączą się ze sobą (Rysunek 5).

GUV wolne od defektów są łatwiejsze do zidentyfikowania i oceny po przeniesieniu do komory obserwacyjnej. Pomiary kalibracyjne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Systemy modeli biomimetycznych są ważnym narzędziem do badania właściwości i interakcji białek i błon. W porównaniu z innymi systemami odtworzonymi do użytku, takimi jak BLM lub wspierane membrany lipidowe, systemy oparte na GUV oferują kilka możliwości, w tym znaczną kontrolę składu membrany, naprężenia i geometrii, a także są naprawdę bezolejowe. Jednak włączenie białek transbłonowych, takich jak KvAP, do GUV wymaga znacznych adaptacji konwencjonalnych protokołów dla GUV zawierających tylko lipidy. Przedstawiony tutaj ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Susanne Fenz za dyskusję na temat możliwości rekonstytucji białek przez pęcznienie agarozy, Feng Ching Tsai za obecne i byłe pomiary oraz obecnym i byłym członkom grupy Bassereau za wsparcie i pomoc. Projekt został sfinansowany przez Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), przez Komisję Europejską (NoE SoftComp), przez Université Pierre et Marie Curie (grant z FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. był wspierany przez Institut Curie International PhD Fellowship, S.A., przez stypendium Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T., przez stypendium Marie Curie Incoming International Fellowship od Komisji Europejskiej oraz stypendium z Université Pierre et Marie Curie. Opłaty za publikację zostały pokryte przez Labex "CelTisPhyBio" (ANR-11-LABX0038).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DPhPC (1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)Avanti Polar Lipids 850356P
Jajko PC L-&alfa;-fosfatydylocholina (jajko, kurczak) Lipidy Avanti Polar 840051P
Kwas L-&alfa-fosfatydowy jaja PA (jajo, kurczak)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (Δ 9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids 850375P
Cholesterol (wełna owcza, >98%) Lipidy Avanti Polar 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPznakowany lipidem
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 Znakowany lipid
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetonVWR20066.296AnalaR Normapur
EtanolVWR20821.330AnalaR Normapur
Kimwipe Kimtech7552
Strzykawki Hamilton Hamilton Bonaduz AGróżnorodne
Bursztynowe fiolki i kubki teflonoweSigmaSU860083 i SU860076
ParafilmVWR291-1214
Probówka do mikrowirówekEppendorfdiverse
AgarozaEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SacharozaSigma84097-1kg
Glukoza SigmaG8270-1kg
TrehalozaSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OsmometrWescorVapro
pH-metrInstrumenty SchottLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; mSartorius steimMinisart 16532
Generator funkcyjnyTTiTG315
Druty platynoweGoodfellowLS41307499,99+%, d = 0,5 mm
PolitetrafluoroetylenGoodfellow
Dow Corning "smar wysokopróżniowy"VWR1597418
pasta uszczelniającaVitrex medical A/S, DaniaREF 140014Sigillum Wax
Prowadnice pokrywy 22 x 40 mm Nr 1.5VWR631-0136
Prowadnice 22 x 22 mm Nr 1.5VWR 631-0125
Myjka plazmowaHarrickPDC-32G, ustawianie "wysokich"
szalek PetriegoFalcon BDREF 3530013,5 cm x 1 cm
Instrumenty AxonMulticlamp700B
Karta DAQNational InstrumentsPCI-6221
LabviewWersja National Instruments 8.6
Pipety szklane borokrzemian OD 1  mm ID 0,58  mmAparat HarvardGC100-15
Uchwyt elektrodyWarner Instruments Q45W-T10P
MikromanipulatorSutter MP-285
Ściągacz do pipetSutter P-2000 
KameraProSilica GC1380
Mikroskop ZeissZeissAxiovert 135
ObiektywZeiss40X duża odległość robocza, Kontrast fazowy
Obiektyw Plan-Apochromat NA 1.3Zeiss
GFP (dla Alexa-488)HoribaXF100-3
Zestaw filtrów Cy3 (dla TexasRed)HoribaXF101-2
beta-kazeinaSigma C6905-1G
Mikroskop konfokalnyNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 głowica konfokalna
ObiektywNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworksdo przetwarzania obrazu i analizy bieżących śladów
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym Zestaw filtrów 100X

Bibliografia

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605(2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102(2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102(2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529(2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a(2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstytucja KvAPmetoda elektroformowaniapęcznienie wspomagane żelemmikroskopia fluorescencyjnalipidowo-białkowa warstwa filmudehydratacja-rehydratacjainkorporacja białek błonowych
Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.