Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Streszczenie

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Podejście to jest szczególnie skuteczne w mapowaniu wysoce powtarzalnych sekwencji do regionów heterochromatycznych, w których podejścia obliczeniowe napotykają na zaporowe wyzwania. Tutaj opisujemy uproszczony protokół dla DNA ISH, który omija płukanie formamidu, które jest standardowym krokiem w innych protokołach DNA ISH. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem hybrydyzacji z krótkimi jednoniciowymi sondami DNA, które przenoszą barwniki fluorescencyjne, które skutecznie oznaczają powtarzające się sekwencje DNA w heterochromatycznych regionach chromosomowych w wielu różnych typach tkanek owadów. Aplikacje mogą być jednak rozszerzone o większe sondy i wizualizację pojedynczych kopii (niepowtarzalnych) sekwencji DNA. Demonstrujemy tę metodę, mapując kilka różnych powtarzających się sekwencji do zgniecionych chromosomów z komórek nerwowych Drosophila melanogaster i spermatocytów Nasonia vitripennis. Pokazujemy wzorce hybrydyzacji zarówno dla małych, komercyjnie zsyntetyzowanych sond, jak i dla większej sondy dla porównania. Ta procedura wykorzystuje proste materiały laboratoryjne i odczynniki i jest idealna dla badaczy, którzy mają niewielkie doświadczenie w wykonywaniu DNA ISH.

Wprowadzenie

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Sondy do pojedynczych regionów kopii w euchromatynie można wygenerować za pomocą kilku podejść, w tym translacji lub znakowania końcowego długich produktów DNA^1,2 oraz włączenia nukleotydów przyłączonych do deoksygeniny (DIG) i ich rozpoznawania przez szeroką gamę przeciwciał sprzężonych z grupami^1-3. Wizualizacja sekwencji euchromatycznych w liczbie kilku lub pojedynczych kopii wymaga użycia pojedynczych, dużych sond o wysokiej aktywności właściwej lub koktajlu wielu, mniejszych sond, które łącznie wzmacniają syg....

Protokół

1. Disekcja i fiksacja tkanek (60 min)

1. W przypadku mózgów Drosophila, umieść larwy 3^rd stadium w kropli 1x PBS (buforu fosforanowego). Wybierz duże larwy 3^rd stadium, które aktywnie pełzają, z fiolek lub butelek, które nie są przeludnione.
   1. Użyj jednej pary pęsety ultrafine, aby chwycić haki gębowe, i drugiej pary pęsety, aby chwycić ciało w 2/3 jego długości (Rysunek 1A, B). Delikatnie pociągnij za haki gębowe, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe i część larwalnego przewodu pokarmowego. Użyj pęsety, aby oddzielić mózg i zwoje brzuszne (Rysunek 1A, B) od pozostałych tkanek i....

Wyniki

Aby zademonstrować tę metodę, przeprowadziliśmy hybrydyzację zestawu krótkich, komercyjnie syntetyzowanych oligosów, które zostały zmodyfikowane chemicznie koniugatami fluorescencyjnymi (Rycina 2), oraz dłuższej sondy biotynilowanej (wykonanej poprzez translację nacięć produktu PCR; Rycina 2B) z chromosomami pochodzącymi z kilku różnych typów tkanek (patrz Tabela 1). Sekwencje docelowe obejmowały powtórzenia satelitarne zlokalizowane w regionach pericentrycznych (heteroc.......

Dyskusja

DNA ISH jest często używany do mapowania określonych sekwencji na chromosomy. Opisaliśmy prostą metodę dla DNA ISH zoptymalizowaną pod kątem sekwencji heterochromatycznych o dużej liczbie kopii. Zamiast używać płukania w roztworze formamidu, co jest wymogiem w innych istniejących protokołach ISH DNA, umieszczamy szkiełka montowane na tkankach bezpośrednio na wstępnie podgrzanym bloku w celu denaturacji DNA. Ta metoda pozwala obejść stosowanie dużych ilości formamidu. Jednym z krytycznych kroków do uzyskania wyraźnych syg.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka pokryte poli-L-lizyną (można również stosować zwykłe szkiełka)	Pęseta Sigma Aldrich
Ultrafine (rozmiar 5)	Szkiełka
22 x 22 mm Fisher			Sigmacote-traktowane przez zanurzenie na 15 sekund, osuszenie i wytarcie wszelkich śladów Sigmacote, aby szkiełko nakrywkowe było przezroczyste
Sigmacote	Sigma
			75 - 150 mm
			parafinowy woskowany
Blok grzewczy z termometrem
Suchy inkubator
Żyletki Komora
			Puste pudełko na końcówki do pipet lub Tupperware, wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi lub Kimwipes
Słoiki z kopliny			z rowkami ślizgowymi
Folia
Pipety
1,5 ml probówki
Lakier			Przezroczyste lub kolorowe
mikropipety P20 i plastikowe końcówki
Spinacze do papieru			20 - 25 standardowych metalowych spinaczy do papieru połączonych w formę chain
Odczynniki
16% paraformaldehydu klasy EM	Mikroskopia elektronowa Odczynniki
Kwas octowy	Sigma
Ciekły azot
100% Etanol, klasa
Komercyjnie syntetyzowane, znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydowane
Długa biotynylowana sonda	Invitrogen; Alternatywne etapy 2.7.1-2.7.3		np. nick translowany i biotynylowany za pomocą BioNick z Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Alternatywne kroki 2.7.1-2.7.3		do wykrywania długiej sondy biotynylowanej
Bufor hybrydyzacyjny	Receptura powyżej
4x SSCT	Receptura powyżej		cytrynian soli fizjologicznej + Tween
0,1x SSC	Receptura powyżej		cytrynian soli fizjologicznej i sodu
Roztwór blokujący	Przepis powyżej
SBT	Przepis powyżej		SSC, albumina surowicy bydlęcej, Tween
1x	Receptura PBT powyżej		soli fizjologicznej buforowanej fosforanem + Tween
1x PBS			sól fizjologiczna buforowana fosforanem
Hipotoniczny			roztwór 0,5% cytrynian sodu w H2O
Formamid	Sigma Aldrich
Vectashield podłoże montażowe z wektorem DAPI	Laboratoria

nakrywkowe Dumont Bibuła filtracyjna Papier wilgotności aluminiowaPasteurado mikrofuge do paznokci chemiczna