Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Summary

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Abstract

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Podejście to jest szczególnie skuteczne w mapowaniu wysoce powtarzalnych sekwencji do regionów heterochromatycznych, w których podejścia obliczeniowe napotykają na zaporowe wyzwania. Tutaj opisujemy uproszczony protokół dla DNA ISH, który omija płukanie formamidu, które jest standardowym krokiem w innych protokołach DNA ISH. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem hybrydyzacji z krótkimi jednoniciowymi sondami DNA, które przenoszą barwniki fluorescencyjne, które skutecznie oznaczają powtarzające się sekwencje DNA w heterochromatycznych regionach chromosomowych w wielu różnych typach tkanek owadów. Aplikacje mogą być jednak rozszerzone o większe sondy i wizualizację pojedynczych kopii (niepowtarzalnych) sekwencji DNA. Demonstrujemy tę metodę, mapując kilka różnych powtarzających się sekwencji do zgniecionych chromosomów z komórek nerwowych Drosophila melanogaster i spermatocytów Nasonia vitripennis. Pokazujemy wzorce hybrydyzacji zarówno dla małych, komercyjnie zsyntetyzowanych sond, jak i dla większej sondy dla porównania. Ta procedura wykorzystuje proste materiały laboratoryjne i odczynniki i jest idealna dla badaczy, którzy mają niewielkie doświadczenie w wykonywaniu DNA ISH.

Introduction

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Sondy do pojedynczych regionów kopii w euchromatynie można wygenerować za pomocą kilku podejść, w tym translacji lub znakowania końcowego długich produktów DNA^1,2 oraz włączenia nukleotydów przyłączonych do deoksygeniny (DIG) i ich rozpoznawania przez szeroką gamę przeciwciał sprzężonych z grupami^1-3. Wizualizacja sekwencji euchromatycznych w liczbie kilku lub pojedynczych kopii wymaga użycia pojedynczych, dużych sond o wysokiej aktywności właściwej lub koktajlu wielu, mniejszych sond, które łącznie wzmacniają syg....

Protocol

1. Sekcja i utrwalenie tkanek (60 min)

1. W przypadku mózgów Drosophila umieść larwy 3^w stadium rozwojowym w kropli 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Wybierz duże larwy w 3^. stadium rozwojowym, które aktywnie pełzają z fiolek lub butelek, które nie są przepełnione.
   1. Użyj jednej ultracienkiej pary pęset, aby chwycić haczyki do ust, a drugiej pary pęset, aby chwycić 2/3 długości ciała (Rysunek 1A, B). Delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe i część przewodu pokarmowego larw. Użyj pęsety, aby oddzielić mózg i brzuszne zwoje (ryc. 1A, B

Results

Aby zademonstrować tę metodę, zhybrydyzowaliśmy zestaw małych komercyjnie syntetyzowanych oligonukleotydów, które były chemicznie modyfikowane za pomocą koniugatów fluorescencyjnych (Rysunek 2) i dłuższej sondy biotynylowanej (wykonanej przez translację produktu PCR; Ryc. 2B) do chromosomów z kilku różnych typów tkanek (patrz tabela 1). Sekwencje docelowe obejmowały powtórzenia satelitarne zlokalizowane w regionach pericentromerowych (heterochromatycznych) chromosomów mi.......

Discussion

DNA ISH jest często używany do mapowania określonych sekwencji na chromosomy. Opisaliśmy prostą metodę dla DNA ISH zoptymalizowaną pod kątem sekwencji heterochromatycznych o dużej liczbie kopii. Zamiast używać płukania w roztworze formamidu, co jest wymogiem w innych istniejących protokołach ISH DNA, umieszczamy szkiełka montowane na tkankach bezpośrednio na wstępnie podgrzanym bloku w celu denaturacji DNA. Ta metoda pozwala obejść stosowanie dużych ilości formamidu. Jednym z krytycznych kroków do uzyskania wyraźnych syg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka pokryte poli-L-lizyną (można również stosować zwykłe szkiełka)	Pęseta Sigma Aldrich
Ultrafine (rozmiar 5)	Szkiełka
22 x 22 mm Fisher			Sigmacote-traktowane przez zanurzenie na 15 sekund, osuszenie i wytarcie wszelkich śladów Sigmacote, aby szkiełko nakrywkowe było przezroczyste
Sigmacote	Sigma
			75 - 150 mm
			parafinowy woskowany
Blok grzewczy z termometrem
Suchy inkubator
Żyletki Komora
			Puste pudełko na końcówki do pipet lub Tupperware, wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi lub Kimwipes
Słoiki z kopliny			z rowkami ślizgowymi
Folia
Pipety
1,5 ml probówki
Lakier			Przezroczyste lub kolorowe
mikropipety P20 i plastikowe końcówki
Spinacze do papieru			20 - 25 standardowych metalowych spinaczy do papieru połączonych w formę chain
Odczynniki
16% paraformaldehydu klasy EM	Mikroskopia elektronowa Odczynniki
Kwas octowy	Sigma
Ciekły azot
100% Etanol, klasa
Komercyjnie syntetyzowane, znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydowane
Długa biotynylowana sonda	Invitrogen; Alternatywne etapy 2.7.1-2.7.3		np. nick translowany i biotynylowany za pomocą BioNick z Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Alternatywne kroki 2.7.1-2.7.3		do wykrywania długiej sondy biotynylowanej
Bufor hybrydyzacyjny	Receptura powyżej
4x SSCT	Receptura powyżej		cytrynian soli fizjologicznej + Tween
0,1x SSC	Receptura powyżej		cytrynian soli fizjologicznej i sodu
Roztwór blokujący	Przepis powyżej
SBT	Przepis powyżej		SSC, albumina surowicy bydlęcej, Tween
1x	Receptura PBT powyżej		soli fizjologicznej buforowanej fosforanem + Tween
1x PBS			sól fizjologiczna buforowana fosforanem
Hipotoniczny			roztwór 0,5% cytrynian sodu w H2O
Formamid	Sigma Aldrich
Vectashield podłoże montażowe z wektorem DAPI	Laboratoria