Artykuł metodologiczny

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

DOI:

10.3791/52288

⸱

6 stycznia 2015

 , 
1Department of Biology, University of Rochester, 2W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Podejście to jest szczególnie skuteczne w mapowaniu wysoce powtarzalnych sekwencji do regionów heterochromatycznych, w których podejścia obliczeniowe napotykają na zaporowe wyzwania. Tutaj opisujemy uproszczony protokół dla DNA ISH, który omija płukanie formamidu, które jest standardowym krokiem w innych protokołach DNA ISH. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem hybrydyzacji z krótkimi jednoniciowymi sondami DNA, które przenoszą barwniki fluorescencyjne, które skutecznie oznaczają powtarzające się sekwencje DNA w heterochromatycznych regionach chromosomowych w wielu różnych typach tkanek owadów. Aplikacje mogą być jednak rozszerzone o większe sondy i wizualizację pojedynczych kopii (niepowtarzalnych) sekwencji DNA. Demonstrujemy tę metodę, mapując kilka różnych powtarzających się sekwencji do zgniecionych chromosomów z komórek nerwowych Drosophila melanogaster i spermatocytów Nasonia vitripennis. Pokazujemy wzorce hybrydyzacji zarówno dla małych, komercyjnie zsyntetyzowanych sond, jak i dla większej sondy dla porównania. Ta procedura wykorzystuje proste materiały laboratoryjne i odczynniki i jest idealna dla badaczy, którzy mają niewielkie doświadczenie w wykonywaniu DNA ISH.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hybrydyzacja DNA in situ (DNA ISH) jest powszechnie stosowaną metodą mapowania sekwencji do określonych regionów chromosomów. Sondy do pojedynczych regionów kopii w euchromatynie można wygenerować za pomocą kilku podejść, w tym translacji lub znakowania końcowego długich produktów DNA1,2 oraz włączenia nukleotydów przyłączonych do deoksygeniny (DIG) i ich rozpoznawania przez szeroką gamę przeciwciał sprzężonych z grupami1-3. Wizualizacja sekwencji euchromatycznych w liczbie kilku lub pojedynczych kopii wymaga użycia pojedynczych, dużych sond o wysokiej aktywności właściwej lub koktajlu wielu, mniejszych sond, które łącznie wzmacniają sygnał.

Natomiast wysoce powtarzalne sekwencje występujące w heterochromatynie, takie jak satelitarne DNA, są łatwiejszym celem dla DNA ISH, ponieważ zwykle istnieją jako dziesiątki do tysięcy powtórzeń zgrupowanych w pojedynczych regionach chromosomowych znanych jako bloki. Elementy transpozycyjne można również znaleźć przy dużej liczbie kopii w różnych loci chromosomowych2. W takich przypadkach pojedyncze sondy o niskiej aktywności właściwej mogą skutecznie oznaczać sekwencje heterochromatyczne ze względu na ich hybrydyzację w wielu miejscach. Sondy do powtarzających się sekwencji mogą być syntetyzowane komercyjnie jako krótkie oligonukleotydy (30-50 pz) i chemicznie sprzężone z dowolną z wielu różnych grup fluorescencyjnych. Mapowanie powtarzających się sekwencji w obrębie heterochromatyny przy użyciu technologii sekwencjonowania genomu jest trudne ze względu na wyzwania napotkane przy budowie rusztowań w wysoce powtarzalnych blokach satelitarnych4-6,7. Obecnie ISH jest najskuteczniejszym sposobem mapowania tych sekwencji na poziomie subchromosomów. Strategia ta jest ważna dla mapowania dużej liczby powtarzających się sekwencji, które są odkrywane w trwających badaniach sekwencjonowania genomu i transkryptomu.

Wydajność i łatwość mapowania powtarzających się sekwencji na chromosomach montowanych na szkiełku znacznie zwiększyłaby uproszczony protokół dla DNA ISH. Na przykład, istniejące protokoły dla DNA ISH obejmują wielokrotne płukanie zhybrydyzowanych tkanek w roztworze formamidu2,8, co znacznie wydłuża czas wymagany do mapowania sekwencji, a także wytwarza duże ilości odpadów chemicznych dla tego kosztownego odczynnika. Tutaj opisujemy poprawioną metodę DNA ISH, która omija potrzebę mycia formamidem i wykorzystuje podstawowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki. Metoda ta została pierwotnie zaprojektowana do szybkiego mapowania wysoce powtarzalnych sekwencji DNA w heterochromatycznych regionach neuroblastów larwalnych Drosophila przy użyciu komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleotydów, które są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi. Jednak metoda ta sprawdza się również w przypadku mapowania powtarzających się sekwencji przy użyciu większych sond syntetyzowanych w inny sposób9,10 i w wielu różnych typach tkanek i chromosomów. Ponadto metoda ta może być używana do mapowania sekwencji euchromatycznych przy użyciu dłuższych lub wielu, krótkich sond w interesującej nas sekwencji euchromatycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja i utrwalenie tkanek (60 min)

  1. W przypadku mózgów Drosophila umieść larwy 3w stadium rozwojowym w kropli 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami). Wybierz duże larwy w 3. stadium rozwojowym, które aktywnie pełzają z fiolek lub butelek, które nie są przepełnione.
    1. Użyj jednej ultracienkiej pary pęset, aby chwycić haczyki do ust, a drugiej pary pęset, aby chwycić 2/3 długości ciała (Rysunek 1A, B). Delikatnie pociągnij za haczyki do ust, aby odsłonić mózg, zwoje brzuszne, gruczoły ślinowe i część przewodu pokarmowego larw. Użyj pęsety, aby oddzielić mózg i brzuszne zwoje (ryc. 1A, B) od innych tkanek i umieść w kropli 1x PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z Tween) na plastikowej płytce Petriego.
  2. Do sekcji jąder Nasonia wybierz męskie 3-dniowe poczwarki (żółte ciała z czerwonymi oczami). Samce Nasonia mają małe długości poduszek skrzydeł w porównaniu z samicami w stadium poczwarki (ryc. 1C).
    1. Przytrzymaj poczwarkę w górnej części brzucha w pobliżu klatki piersiowej za pomocą jednej pary pęset, a za pomocą drugiej pary pęsety chwyć bardzo dystalny koniec brzucha i wyciągnij jądra w kształcie łzy (będą one otoczone tłustym ciałem, które można delikatnie strząsnąć; Rysunek 1D). Odłącz wszelkie zewnętrzne części ciała od jąder, co uniemożliwi prawidłowe zgniecenie, i umieść w kropli 1x PBT na plastikowej płytce Petriego.
  3. Dla każdego szkiełka należy przeanalizować łącznie cztery lub pięć próbek tkanek (tj. mózgów larw Drosophila lub jąder Nasonia).
    UWAGA: Więcej niż pięć próbek doprowadzi do przepełnienia jąder i chromosomów.
  4. Opcjonalnie, aby osiągnąć pewną separację chromatyd siostrzanych w euchromatycznych regionach chromosomów mitotycznych, potraktuj tkankę roztworem hipotonicznym: przenieś mózgi z 1x PBT do kropli 0,5% cytrynianu sodu przez 5-10 (nie więcej niż 10) min.
    UWAGA: Kolchicyna (inhibitor mitotyczny) może być pomocna w zwiększaniu liczby figur mitotycznych w metafazie11. Jednak jego stosowanie nie jest konieczne, jeśli stosuje się bardzo duże, zdrowe larwy, a nawet niepożądane, ponieważ może negatywnie wpływać na rozdzielczość chromosomów, rozprzestrzenianie się i morfologię.
  5. Umieścić kroplę (~20 μl) roztworu utrwalającego (2,5% paraformaldehydu w 45% kwasie octowym) na powierzchni czystego szkiełka nakrywkowego nasączonego Sigmacote.
    UWAGA: Roztwór utrwalający należy przygotować na każdy dzień stosowania. Roztwory utrwalające o zawartości 1,8-3,7% paraformaldehydu w 45% kwasie octowym dają najlepsze wyniki dla FISH. Używanie tkanek innych niż mózgi lub jądra lub dostosowanie tego protokołu do immuno-FISH może wymagać eksperymentowania z różnymi utrwalaczami (lista różnych utrwalaczy, patrz12).
  6. Ostrożnie przenieść każdą próbkę tkanki z buforu preparacyjnego (1x PBT) do kropli utrwalacza za pomocą ultracienkiej pęsety, minimalizując przenoszenie buforu preparacyjnego do roztworu utrwalającego. Próbki tkanek należy umieścić w taki sposób, aby były równomiernie oddalone od siebie w kropelce utrwalającej. Inkubować tkanki w utrwalaczu przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Ostrożnie umieść szkiełko pokryte polilizyną stroną zadrukowaną do dołu na chusteczce i szkiełku nakrywkowym. Nie dociskaj w tym momencie, ale zamiast tego pozwól, aby oba elementy lekko się zetknęły, tak aby szkiełko nakrywkowe przykleiło się do spodu prowadnicy. Odwróć szkiełko tak, aby szkiełko nakrywkowe znalazło się na górze.
  8. Umieść szkiełko/chusteczkę/szkiełko nakrywkowe w złożonym kawałku bibuły filtracyjnej. Na stabilnej powierzchni, używając kciuka, dociśnij bardzo mocno prosto w dół do pozycji bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym. Należy uważać, aby uniknąć bocznego przesuwania się szkiełka nakrywkowego (spowoduje to rozmazywanie się tkanki).
  9. Zanurz szkiełko/chusteczkę/szkiełko nakrywkowe w ciekłym azocie (patrz aparatura na rysunku 1E, F) i odstaw, aż azot przestanie wrzeć (dłużej jest w porządku). Zdejmij szkiełko i natychmiast oderwij szkiełko nakrywkowe świeżą żyletką, przesuwając róg szkiełka nakrywkowego w górę (unikaj drapania zamocowanej chusteczki żyletką).
    1. Wstępne schłodzenie szkiełka/chusteczki/szkiełka nakrywkowego na bloku suchego lodu, ślizgiem nakrywkowym do góry, przez 1-2 minuty przed zanurzeniem w ciekłym azocie pomoże zapobiec pękaniu szkiełek.
  10. Natychmiast umieść szkiełko z chusteczką w słoiku Coplin wypełnionym 100% etanolem w temperaturze pokojowej i odstaw na co najmniej 5 minut (w razie potrzeby czas ten może się wydłużyć).
    UWAGA: Można również użyć zimnego 100% etanolu.
  11. Wyjmij szkiełko chusteczką, odchoczy nadmiar etanolu za pomocą Kimwipe (bez dotykania utrwalonej chusteczki) i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu na 1 godzinę.
    1. Przejdź bezpośrednio do kroku 2 lub utrzymuj szkiełka w suchości w powietrzu o niskiej wilgotności lub w komorze osuszającej przez tygodnie, a nawet miesiące przed wykonaniem hybrydyzacji.

figure-protocol-1
Rysunek 1: (A) Larwa Drosophila w trzecimstadium rozwojowym (po prawej), ze wskazaniami miejsc, w których należy chwycić haczyki gębowe (oznaczone *) i 2/3 drogi w dół larw, aby wypreparować mózg; (po lewej) schemat larwy w tym samym stadium rozwoju, przedstawiający względne położenie mózgu w głowie larwy. (B) Mózg i brzuszne zwoje wypreparowane z larwy Drosophila w 3stadium rozwojowym (po prawej) i schemat tej tkanki (po lewej). (C) 3-dniowa poczwarka Nasonia w stadium żółtego ciała i czerwonych oczu. (D) Para jąder wycięta z 3-dniowej poczwarki samca Nasonia (po prawej) z pozycjami wskazującymi, gdzie należy chwycić poczwarkę z tyłu brzucha (oznaczone *) i w połowie ciała; (po lewej) schemat przedstawiający poczwarki osy płci męskiej i żeńskiej; poczwarki męskie można odróżnić po skrzydłach, które nie wystają poza profil strzałkowy (strzałka), w przeciwieństwie do samic, które mają skrzydła wystające poza profil; Względne położenie pary jąder pokazano w poczwarce samca. (E) Aparatura – sznur spinaczy do papieru – oraz (F) metoda używana do zanurzania szkiełek w naczyniu z ciekłym azotem. Do jednoczesnego zanurzania wielu slajdów można użyć wielu sznurków spinaczy do papieru.

2. Hybrydyzacja in situ (30 min w dniu 1; 1 godzina—2,5 godziny w przypadku długich sond—w dniu 2)

  1. Dodaj 1 μl (100 ng) każdej sondy do 20 μl 1,1x buforu hybrydyzacyjnego. Pipetować sondę/bufor hybrydyzacyjny na powierzchnię utrwalonej tkanki (unikać dotykania tkanki).
  2. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe bezpośrednio na sondzie/buforze hybrydyzacyjnym, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe jest wyśrodkowane bezpośrednio nad tkanką. Bufor powinien migrować do zewnętrznej krawędzi szkiełka nakrywkowego, nie pozostawiając pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Małe pęcherzyki, które nie stykają się z tkanką, nie stanowią żadnych problemów podczas zabiegu. Usuń duże pęcherzyki, ostrożnie podnosząc róg szkiełka nakrywkowego i ostrożnie upuszczając go z powrotem na szkiełko.
  3. Umieścić szkiełko/chusteczkę/szkiełko nakrywkowe na powierzchni bloku podgrzanego do temperatury 95 °C (szkiełko nakrywkowe do góry). Przykryj dużym kawałkiem folii aluminiowej, aby zapobiec ekspozycji na światło. Pozostawić szkiełko do inkubacji w temperaturze 95 °C przez 5 min.
    UWAGA: Typowy blok grzewczy z otworami na rurki można odwrócić, aby uzyskać płaską powierzchnię, na której można umieścić szkiełko/chusteczkę/szkiełko nakrywkowe.
  4. Zdejmij szkiełko, pozwalając mu lekko ostygnąć, aż będzie ciepły w dotyku. Ostrożnie owiń kawałek rozciągniętego Parafilmu wokół szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić płyn pod nim.
  5. Umieścić szczelnie zamknięte szkiełko w komorze wilgotnościowej i umieścić komorę w inkubatorze nagrzanym do 30 °C. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 godziny do nocy.
    1. Utwórz komorę wilgotności z pustego pudełka na końcówki lub pojemnika Tupperware z pokrywką z dampChusteczki Kimwipes lub ręczniki papierowe umieszczone na dnie.
      UWAGA: Jednoniciowe sondy oligo DNA zostały zaprojektowane tak, aby miały 28-33 zasady, aby osiągnąć teoretyczną temperaturę topnienia (Tm) 45-47 °C. Te zakresy długości iT m odzwierciedlają fakt, że wiele powtarzających się sekwencji, które badaliśmy, jest bogatych w AT, a zatem ma bardzo niską zawartość GC. Dłuższe sondy będą prawdopodobnie miały wyższe wartości Tm; może to skutkować wyższą hybrydyzacją tła w standardowej temperaturze hybrydyzacji wynoszącej 30 °C. W związku z tym może być konieczne rozwiązywanie problemów z temperaturami hybrydyzacji, aby osiągnąć najlepsze wyniki. Aby znaleźć najlepszą temperaturę hybrydyzacji, stopniowo zwiększaj (lub zmniejszaj) temperaturę o 5 °C.
  6. Ostrożnie wyjmij Parafilm z suwaka, a następnie ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, powoli podnosząc jeden róg. Umyj szkiełko trzy razy przez 15 minut każde mycie w buforze 0,1x SSC. Przykryj słoik Coplin folią aluminiową podczas prania, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
  7. Jeśli nie używasz długiej sondy biotynylowej, przejdź do kroku 2.8.
    1. Jeśli używasz długiej sondy biotynylowej, osusz obszar wokół tkanki za pomocą Kimwipe, uważając, aby nie dotknąć samej tkanki. Umieścić 100 μl roztworu blokującego na chusteczce i delikatnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków. Owinąć szkiełko nakrywkowe folią Parafilm i umieścić w temperaturze 37 °C na 30 minut.
    2. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe i osusz tkankę za pomocą Kimwipe. Odmierzyć pipetą 100 μl rodaminy-awidyny rozcieńczonej w stosunku 1:1000 w SBT na tkankę i delikatnie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie zatrzymać pęcherzyków. Owinąć szkiełko nakrywkowe folią Parafilm i umieścić w temperaturze 37 °C na 30 minut.
    3. Ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i umyć szkiełko 3 razy po 5 minut w 4x SSCT, a następnie 3 razy po 5 minut w 0,1x SSC.
      UWAGA: Szkiełka można prać przez dłuższy czas.
  8. Usuń szkiełko i osusz tkankę suchą chusteczką Kimwiste, aby usunąć nadmiar buforu (unikaj dotykania chusteczki). Umieść szkiełko chusteczką do góry w ciemnym miejscu na 10-15 minut lub do momentu, gdy wilgoć całkowicie się rozproszy.
  9. Odpipetować 11 μl pożywki mocującej Vectashield (z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem-DAPI) na tkankę. Ostrożnie umieścić czyste szkiełko nakrywkowe (nie potraktowane Sigmacote) bezpośrednio na środku podłoża montażowego i tkanki. Podłoże montażowe powinno powoli przemieszczać się na zewnątrz w kierunku krawędzi szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Jeśli nośnik montażowy nie dotrze ze wszystkich stron do krawędzi szkiełka nakrywkowego, można nałożyć dodatkowe 1-2 μl nośnika nakrywkowego w jedno miejsce na krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby wypełnić wymaganą objętość. W takim przypadku należy przed uszczelnieniem zetrzeć nadmiar medium z powierzchni prowadnicy.
  10. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Unikaj malowania lakieru do paznokci na próbce tkanki.
  11. Umieść szkiełko pionowo w ciemnym miejscu i pozwól lakierowi do wyschnięcia do całkowitego stwardnienia (zwykle 30 minut lub dłużej). W tym momencie należy zobrazować tkankę lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 tygodnia w celu późniejszego obrazowania.

Receptury/roztworów

10x PBS

  • 80 g NaCl
  • 2,0 g KCl
  • 14,4 g na2HPO4
  • 2,4 g KH2PO4
  • pH do 7,4, H, 2O do 1 L

1x PBT

  • 5 ml 10x PBS
  • 45 ml H2O
  • 0,1% Animacja 20

20x SSC

  • 175,3 g NaCl
  • 88,2 g cytrynianu
  • w 800 ml H2O
  • pH do 7,H2O do 1 L

4x SSCT

  • 200 ml 20x SSC
  • 799 ml H2O
  • 0,1% Animacja 20

0.1x SSC

  • 5 ml 20x SSC
  • 995 ml H2O

Mieszanka hybrydyzacyjna (20 μl; zmodyfikowana z 11)

  • 10 μl formamidu
  • 4 μl 50% siarczanu dekstranu
  • 2 μl 20x SSC
  • 4 μl H2O

SBT8 (10 ml)

  • 2 ml 20x SSC
  • 0,01 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
  • 10 μl Animacja 20
  • 7,9 ml H2O

Roztwór blokujący8 (10 ml)

  • 0,3 g masy ciała
  • 10 μl Animacja 20
  • 2 ml 20x SSC
  • 8 ml H2O

Utrwalacz roztwór z paraformaldehydem (1 ml)

  • 393,75 μl H2O (najpierw dodaj wodę)
  • 450 μl lodowatego kwasu octowego
  • 156,25 μl 16% paraformaldehydu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować tę metodę, zhybrydyzowaliśmy zestaw małych komercyjnie syntetyzowanych oligonukleotydów, które były chemicznie modyfikowane za pomocą koniugatów fluorescencyjnych (Rysunek 2) i dłuższej sondy biotynylowanej (wykonanej przez translację produktu PCR; Ryc. 2B) do chromosomów z kilku różnych typów tkanek (patrz tabela 1). Sekwencje docelowe obejmowały powtórzenia satelitarne zlokalizowane w regionach pericentromerowych (heterochromatycznych) chromosomów mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ISH jest często używany do mapowania określonych sekwencji na chromosomy. Opisaliśmy prostą metodę dla DNA ISH zoptymalizowaną pod kątem sekwencji heterochromatycznych o dużej liczbie kopii. Zamiast używać płukania w roztworze formamidu, co jest wymogiem w innych istniejących protokołach ISH DNA, umieszczamy szkiełka montowane na tkankach bezpośrednio na wstępnie podgrzanym bloku w celu denaturacji DNA. Ta metoda pozwala obejść stosowanie dużych ilości formamidu. Jednym z krytycznych kroków do uzyskania wyraźnych syg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie łączy ich konkurencyjny konflikt interesów finansowych ani żaden inny.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Zhaohua Irene Tang z Działu Naukowego W. M. Keck za użycie jej mikroskopu epifluorescencyjnego oraz laboratorium Werren za przekazanie Nasonii do sekcji. Praca ta była częściowo wspierana przez stypendium NIH-NRSA (5F32GM105317-02) na rzecz AML.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka pokryte poli-L-lizyną (można również stosować zwykłe szkiełka)Pęseta Sigma Aldrich
Ultrafine (rozmiar 5)Szkiełka
22 x 22 mm FisherSigmacote-traktowane przez zanurzenie na 15 sekund, osuszenie i wytarcie wszelkich śladów Sigmacote, aby szkiełko nakrywkowe było przezroczyste
SigmacoteSigma
75 - 150 mm
parafinowy woskowany
Blok grzewczy z termometrem
Suchy inkubator
Żyletki Komora
Puste pudełko na końcówki do pipet lub Tupperware, wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi lub Kimwipes
Słoiki z koplinyz rowkami ślizgowymi
Folia
Pipety
1,5 ml probówki
LakierPrzezroczyste lub kolorowe
mikropipety P20 i plastikowe końcówki
Spinacze do papieru20 - 25 standardowych metalowych spinaczy do papieru połączonych w formę chain
Odczynniki
16% paraformaldehydu klasy EMMikroskopia elektronowa Odczynniki
Kwas octowySigma
Ciekły azot
100% Etanol, klasa
Komercyjnie syntetyzowane, znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydowane
Długa biotynylowana sondaInvitrogen; Alternatywne etapy 2.7.1-2.7.3np. nick translowany i biotynylowany za pomocą BioNick z Invitrogen
Rhodamine-AvidinRoche; Alternatywne kroki 2.7.1-2.7.3do wykrywania długiej sondy biotynylowanej
Bufor hybrydyzacyjnyReceptura powyżej
4x SSCTReceptura powyżejcytrynian soli fizjologicznej + Tween
0,1x SSCReceptura powyżejcytrynian soli fizjologicznej i sodu
Roztwór blokującyPrzepis powyżej
SBTPrzepis powyżejSSC, albumina surowicy bydlęcej, Tween
1xReceptura PBT powyżejsoli fizjologicznej buforowanej fosforanem + Tween
1x PBSsól fizjologiczna buforowana fosforanem
Hipotonicznyroztwór 0,5% cytrynian sodu w H2O
FormamidSigma Aldrich
Vectashield podłoże montażowe z wektorem DAPI Laboratoria
nakrywkowe Dumont Bibuła filtracyjna Papier wilgotności aluminiowaPasteurado mikrofuge do paznokci chemiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
  2. Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
  3. Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
  4. Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
  5. Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
  6. Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
  7. He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
  8. Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  9. Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
  10. Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).
  11. Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
  12. Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
  13. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescence MicroscopyChromosome SquashingTissue DissectionHypotonic Solution TreatmentFormamide Free ProtocolShort DNA ProbesHeterochromatic RegionsMitotic ChromosomesInsect Tissue Types

Powiązane artykuły