Artykuł metodologiczny

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

28.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52295

⸱

28 października 2014

 ,  , 
1Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Montreal Neurological Institute, 3Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Pediatrics, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Streszczenie

Regulacja syntezy białek stanowi kluczowy punkt kontrolny w odpowiedzi komórkowej na stres. W szczególności wykazano, że dyskretne elementy regulatorowe RNA umożliwiają selektywną translację określonych mRNA, które zazwyczaj kodują białka wymagane do określonej reakcji na stres. Identyfikacja tych mRNA, a także charakterystyka mechanizmów regulacyjnych odpowiedzialnych za selektywną translację od pewnego czasu znajduje się w czołówce biologii molekularnej. Profilowanie polisomów jest podstawową metodą w tych badaniach. Celem profilowania polisomów jest uchwycenie translacji mRNA poprzez unieruchomienie aktywnie translujących rybosomów na różnych transkryptach i oddzielenie powstałych polirybosomów przez ultrawirowanie na gradiencie sacharozy, co pozwala na rozróżnienie między transkryptami o wysokiej translacji a transkryptami słabo translowanymi. Można je następnie scharakteryzować za pomocą tradycyjnych metod biologii biochemicznej i molekularnej. Co ważne, połączenie profilowania polisomów z wysokoprzepustowymi podejściami genomicznymi pozwala na analizę regulacji translacyjnej na dużą skalę.

Wprowadzenie

Regulacja syntezy białek (translacja) jest kluczowym procesem komórkowym, który jest ściśle związany z przetrwaniem komórki. Biorąc pod uwagę, że translacja pochłania ponad 50% energii komórki, nie jest zaskakujące, że translacja jest ściśle regulowana, a perturbacje w translacji nie są dobrze tolerowane. I odwrotnie, wiele nieprawidłowych procesów komórkowych wymaga modyfikacji maszynerii translacyjnej i wyniku translacji (tj. proteomu). Dzieje się tak często w różnych reakcjach na stres i stanach chorobowych, a najlepszym przykładem jest prawdopodobnie rak. Kluczową zaletą kontroli translacyjnej jest zdolność komórek do szybkiego przeprogramowania wyjścia białka w odpowiedzi na różne zewnętrzne i wewnętrzne wyzwalacze, a tym samym dostrojenie mechanizmu, który przechyla równowagę między przeżyciem a śmiercią komórki1.

Dwa aspekty kontroli translacyjnej są szczególnie interesujące; zrozumienie natury mechanizmów regulacyjnych i elementów kontrolnych, które pozwalają na specyficzną translację, oraz identyfikacja specyficznych mRNA i ich produktów białkowych, które uczestniczą w odpowiedzi komórkowej na konkretny wyzwalacz, który wywołał selektywną translację w pierwszej kolejności. Profilowanie polisomów jest techniką, która pozwala na skuteczne badanie obu procesów.

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest badanie i ilościowe określenie stanu translacji określonych mRNA w różnych warunkach komórkowych. Zasada tej techniki polega na wychwyceniu translacji mRNA poprzez "zamrożenie" aktywnie translujących rybosomów na różnych transkryptach i oddzielenie powstałych polirybosomów przez ultrawirowanie na gradionym sacharozie, co pozwala na rozróżnienie między wysoce translacyjnymi transkryptami (związanymi przez kilka rybosomów) a słabo translacyjnymi (związanymi przez jeden lub dwa rybosomy). W tym konkretnym protokole antybiotyk cykloheksymimid, który wiąże się z podjednostką rybosomalną 60S i blokuje uwalnianie zdeacetylowanego tRNA z miejsca2 rybosomu E, jest używany do hamowania translokacji rybosomów i zatrzymywania rybosomów na translujących mRNA. Można jednak stosować inne środki blokujące, takie jak emetyna, która również blokuje wydłużenie translacji3.

W przeciwieństwie do technik western blotting i znakowania 35S-Metioniny, które mierzą końcowy wynik procesu translacji, profilowanie polisomów ma tę zaletę, że mierzy związek rybosomów z aktywnie translowanymi mRNA, co pozwala na bardziej szczegółowe badanie mechanizmów translacji w różnych warunkach. W związku z tym technikę tę można łatwo dostosować do specyficznego badania różnych trybów translacji4-6, czynników białkowych zaangażowanych w regulację translacji7-9, warunków stresowych wpływających na syntezę białek1,10,11 lub wpływu struktur mRNA, takich jak IRES lub otwarte ramki odczytu upstream na syntezę białek12-14. Obecnie zastosowania profilowania polisomów są jeszcze szersze dzięki zastosowaniu mikromacierzy DNA 15 lub sekwencjonowania nowej generacji 16,17 do analizy mRNA związanych z polisomami.

Protokół

UWAGA: Uwaga dotycząca pracy z RNA: Podejmij standardowe środki ostrożności w celu ochrony przed degradacją RNA przez RNazy. Używaj rękawiczek, barierowych końcówek do pipet, wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz i chemikaliów na wszystkich etapach protokołu. Do wszystkich roztworów należy używać wody ultraczystej lub uzdatnionej metodą DEPC. Odkaż wszelkie podejrzane powierzchnie roztworem inaktywacyjnym RNazy zgodnie z protokołem producenta.

1. Przygotowanie roztworów.

  1. Przygotować 500 ml roztworu zasadowego (0,3 M NaCl; 15 mM MgCl2.6H2O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mieszaj za pomocą mieszadła, aż roztwór będzie klarowny i przepuść przez filtr 0,45 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotuj 10 i 50% roztwory sacharozy i 60% roztwór Chase w następujący sposób:
    1. W przypadku 10% roztworu sacharozy (w/v), w 50 ml probówce wirówkowej dodaj 5 g sacharozy i napełnij do 50 ml roztworem zasadowym. Aby uzyskać 50% roztwór sacharozy (w/v), w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 25 g sacharozy i napełnij do 50 ml roztworem zasadowym.
    2. Aby uzyskać 60% (w/v) roztwór Chase, w 50 ml probówce wirówkowej dodać 30 g sacharozy i napełnić do 50 ml roztworem zasadowym. Dodać 100 μl nasyconego roztworu błękitu bromofenolowego (dodać błękit bromofenolowy do wody, aż więcej się nie rozpuści; odwirować w celu osadzenia nierozpuszczonego proszku) do 60% roztworu pościgowego. Wymieszać za pomocą wiru i sprawdzić całkowite rozpuszczenie.
    3. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
  3. Przygotować bufor do lizy RNA. Przygotuj ten bufor na świeżo w dniu eksperymentu. Przygotować 500 μl buforu do lizy RNA dla każdej próbki. Do 1 ml roztworu zasadowego dodać 10 μl Triton X-100 (1% [v/v] final), 1 μl 100 mg/ml cykloheksymidu w DMSO (CHX, 0,1 mg/ml final) i 3,5 μl RNasin (140 U/ml). Wymieszaj za pomocą wiru. Przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Cykloheksymid jest wysoce toksyczny i może powodować mutacje. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania. Aby uniknąć zbyt częstego obchodzenia się z proszkiem, należy przygotować większą ilość 100 mg/ml bulionu w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Utrzymuj zapas roboczy w temperaturze -20 °C.
  4. W dniu eksperymentu przygotuj roztwory Sacharoza + CHX, dodając CHX (końcowe stężenie 0,1 mg / ml) do pożądanej objętości 10% i 50% roztworu sacharozy (~ 7 ml każdego roztworu na gradient).

2. Przygotowanie gradientu sacharozy za pomocą automatycznego kreatora gradientów

  1. Włącz kreator gradientów ''ON'' i wypoziomuj płytkę, na której będą znajdować się gradienty (krytyczny krok!) Kliknij na ''Gotowe'', gdy płyta jest wyrównana.
  2. Wybierz z menu program gradientu, który chcesz uruchomić:
    1. Naciśnij menu ''GRAD'' i wybierz ''LISTA''.
    2. Wybierz "SW41".
    3. Przewiń listę i wybierz program ''10 - 50% gradient - 11 kroków'', naciskając przycisk ''URUCHOM''.
  3. Umieść stożkową probówkę ultrawirówki (probówka SW-41, 14 x 89 mm) w bloku znaczników i użyj dołączonego markera z drobną probówką, aby narysować znak na probówce wzdłuż górnego stopnia bloku znacznika. Umieść rurki w stojaku montażowym na stabilnej powierzchni.
    UWAGA: Ten znak będzie wskazówką dotyczącą napełniania warstwami 10 i 50% roztworów sacharozy.
  4. Podłącz dwie dostarczone kaniule do dwóch strzykawek o pojemności 10 ml i umyj, pipetując w górę iw dół ciepłą wodą destylowaną zawierającą roztwór inaktywacyjny RNazy. Upewnij się, że później usunąłeś wszystkie ślady wody.
  5. Napełnij jedną ze strzykawek 10% sacharozą+CHX i włóż kaniulę na dno probówki ultrawirówki. Delikatnie dozować 10% roztwór sacharozy, aż przejdzie tuż obok oznaczenia na probówce.
    UWAGA: Unikaj robienia bąbelków. Jeśli utworzą się bąbelki, delikatnie postukaj w rurkę, aby je przemieścić.
  6. Napełnij drugą strzykawkę 50% sacharozą+CHX, zetrzyj nadmiar płynu chusteczką i delikatnie włóż kaniulę na dno probówki ultrawirówki. Delikatnie dozuj 50% roztwór sacharozy, aż osiągnie dokładnie ten sam cel. Szybko i płynnie wyjmij kaniulę.
    UWAGA: 10% sacharozy powinno unieść się w probówce i utworzyć łąkotkę u góry. Jeśli nie, dodaj więcej 10% roztworu sacharozy na powierzchni.
  7. Włóż dostarczoną nasadkę, lekko przechylając probówkę ultrawirówki i usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Usuń nadmiar płynu ze zbiornika nakrętki za pomocą mikropipety.
  8. Wytrzyj nadmiar płynu wzdłuż ścianki rurki i umieść na płycie gradientu.
  9. Naciśnij przycisk ''RUN''.
    UWAGA: Płyta przechyli się pod określonym kątem, zatrzyma się na 5 sekund i rozpoczną się obroty w celu utworzenia gradientu.
  10. Po zakończeniu tworzenia gradientu (około 2 minuty, maszyna wyda sygnał dźwiękowy), delikatnie wyjmij ultrawirówkę(y), umieść na stojaku i szybko zdejmij nasadkę ruchem w górę, aby uniknąć zakłócenia gradientu.
  11. Utrzymuj nachylenie (nachylenie) na lodzie. Nie przeszkadzać! Alternatywnie, gradienty utrzymują się przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Alternatywnie użyj dwukomorowego kreatora gradientów, aby utworzyć gradienty w następujący sposób:
    1. Przepłucz rurki i ekspres gradientowy roztworem do inaktywacji RNazy i wodą wolną od RNaz.
    2. Dodaj 5 ml 50% sacharozy + CHX do proksymalnej komory ekspresu gradientu i upewnij się, że powietrze między dwiema komorami zostało usunięte.
    3. Dodać 5 ml 10% sacharozy + CHX do dystalnej komory ekspresu gradientu.
    4. Dodać 0,5 ml 50% sacharozy+CHX na dno stożkowej probówki wirówkowej (probówka SW-41, 14 x 89 mm) i umieścić w uchwycie na probówki.
    5. Włączyć mieszadło umieszczone w komorze proksymalnej, otworzyć kurki odcinające i nachylić osad z prędkością ustawioną na "3" (ok. 1ml/min).
    6. Umieść gradient(y) na lodzie. Nie przeszkadzać.
      UWAGA: Nachylenia można utrzymywać przez noc w temperaturze 4 °C.

3. Liza komórek i ultrawirowanie.

  1. Umieścić wirnik i wiadra SW-41 w temperaturze 4 °C i ustawić wirówkę na 4 °C.
    UWAGA: Procedura lizy komórek jest zoptymalizowana dla dwóch 150 mm subkonfluentnych (~ 70-80% zlewających się) płytek komórek HEK293 na gradient, a stosowane objętości mogą wymagać dostosowania dla różnych linii komórkowych.
  2. Płytki komórek o odpowiedniej gęstości komórek w pożywce wzrostowej co najmniej 24 godziny przed lizą.
  3. Przygotować podwielokrotność (20 ml na płytkę 150 mm) pożywki wzrostowej zawierającej 0,1 mg/ml CHX.
  4. Inkubować komórki w pożywce CHX + (20 ml na płytkę 150 mm) przez 3 minuty w temperaturze 37 °C/5% CO2 w celu zatrzymania i ustabilizowania polisomów.
  5. Pracując szybko, odessaj pożywkę z płytek, umieść płytki na lodzie i raz umyj komórki 10 ml lodowato zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 , 1,8 mM KH2PO4) uzupełnionej CHX (końcowe stężenie 0,1 mg / ml), uważając, aby powoli pipetować w dół boku ścianki naczynia, aby zminimalizować unoszenie się monowarstwy komórki.
  6. Odessać PBS i dodać dodatkowe 10 ml PBS+CHX do każdej płytki, zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i przenieść całkowitą objętość z obu płytek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie. Zachować 1 ml zawiesiny komórkowej w probówce do mikrofuge na lodzie do dalszej analizy białka.
  7. Odwirować probówkę z komórkami o pojemności 50 ml przy ciśnieniu 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  8. Usuń cały PBS i ponownie zawieś osad w 500 μl lodowatego buforu do lizy RNA.
  9. Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
  10. Pipetować w górę i w dół, aby lizować komórki i inkubować na lodzie przez 10 minut, od czasu do czasu wirując.
  11. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania jąder osadzania.
  12. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
  13. Wirować przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu osadzania resztek komórek.
  14. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i użyć 2 μl do pomiaru gęstości optycznej przy 260 nm (użyć buforu do lizy jako ślepej próby).
  15. Usunąć 50 μl (10% całości) z każdej próbki w celu analizy całkowitego RNA. UWAGA: Lizat można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
  16. Delikatnie załadować równe jednostki A260 na każdy gradient sacharozy (min. 10 OD, optymalnie 25 OD, w maksymalnej objętości 500 μl; w razie potrzeby rozcieńczyć skoncentrowany lizat dodatkowym buforem do lizy).
  17. Upewnij się, że gradienty znajdują się w odległości nie większej niż 0,1 g od siebie przed ultrawirowaniem.
  18. Gradienty wirówki przy 39 000 obr./min (260 343 x g) przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
  19. Podczas wirowania utrzymuj hamulec wirnika włączony i wyłączaj go podczas zwalniania, gdy osiągnie 1,000 obr./min.
    UWAGA: Ten krok minimalizuje wszelkie zakłócenia nachyleń spowodowane nagłymi zmianami przyspieszenia, gdy główki szczotek stykają się z wirnikiem podczas hamowania.

4. Konfiguracja instrumentu systemu frakcjonowania gradientowego.

  1. Ustawić przyrząd i oślepić spektrofotometr wodą w następujący sposób:
    1. Włącz komponenty i pozwól lampie rozgrzać się przez co najmniej 15 minut.
    2. Upewnij się, że kolektor frakcji jest ustawiony na metodę "polisomową" (naciśnij dwukrotnie ikonę folderu; dwukrotnie strzałkę powrotu, aby powrócić do ekranu głównego).
    3. Upewnij się, że zawór na kolektorze frakcji jest ustawiony na odpady (strzałka wskazująca ikonę kosza na śmieci). Umieścić kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającą wodę destylowaną pod probówką do zbierania odpadów.
    4. Wybierz następujące ustawienia w rejestratorze wykresów: Ustaw pokrętło czułości na "USTAW LAMPĘ I OPTYKĘ"; ustaw przełącznik filtra szumów w pozycji "1.5"; ustaw pokrętło separatora szczytów na "OFF"; ustaw szybkie wybieranie wykresu na "30 cm/h" (5 cm/10 min); ustaw pokrętło regulacji linii bazowej (na górze spektrofotometru) na "MAX OPEN".
      UWAGA: Opcjonalnie: Zamiast rejestratora wykresów można użyć oprogramowania do nagrywania wykresów. Na komputerze kliknij "start". Otworzy się okno akwizycji: w menu Opcje odznacz opcję Wstrzymaj grafikę. W obszarze Skalowanie ustaw limity grafu na -10 i 100 (można je zmienić w locie podczas uruchamiania). Kliknij przycisk Zapisz, aby utworzyć nowy plik i nagrać przebieg.
    5. Umieść strzykawkę i cylinder w pompie i dokręć na miejscu (użyj dostarczonych i klucza imbusowego).
      UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno.
    6. Napełnić strzykawkę roztworem Chase Solution, używając komendy ''REV'' z SZYBKĄ prędkością. Ustaw pompę w pozycji pionowej i przepuszczaj powietrze przez rurkę za pomocą polecenia "NAPRZÓD". Używaj RAPID wyłącznie do tej funkcji i prania.
    7. Zainstaluj rurkę ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNaz.
    8. Przekłuć probówkę ultrawirówki kaniulą, aż pojawią się dwa czarne znaki (otwór dozujący znajduje się między tymi dwoma znakami) i uruchomić pompę strzykawkową w trybie "ręcznym" z prędkością 6,0 ml/min.
    9. Gdy woda przepływa przez komórkę przepływową (gdy roztwór bruzdy wypełnia 1/3 rurki), zmień prędkość na zmienną i ustaw na 1.0 ml / min.
    10. Przy natężeniu przepływu 1.0 ml/min wyreguluj pokrętło regulacji linii bazowej na spektrofotometrze, aż napięcie na wykresie spadnie do zera (+/- 0.5 jednostki).
      UWAGA: Obserwować wypływanie wody z rurki odpływowej do kolby Erlenmeyera.
    11. Ustaw żądaną czułość na "0.5" lub "1.0" AU.
      UWAGA: 1.0 AU działa najlepiej dla 10 jednostek OD w gradiencie 10 ml. Jeśli OD jest mniejsze niż 10, można użyć czułości "0.5" w celu wzmocnienia sygnału.
    12. Naciśnij przycisk Auto Baseline i dostosuj ustawienie linii bazowej do znaku 10% na rejestratorze wykresów, obracając pokrętło przesunięcia rejestratora (opcjonalnie, jeśli używasz rejestratora cyfrowego).
    13. Po osiągnięciu stabilnej linii bazowej ustaw przełącznik pompy w pozycji "OFF", a pokrętło prędkości wykresu na 60 cm/h w przypadku korzystania z analogowego rejestratora wykresów lub "OFF" w przypadku korzystania z rejestratora cyfrowego.
    14. Odzyskaj roztwór Chase, przełączając pompę w pozycję "REV" (w razie potrzeby można zwiększyć natężenie przepływu z powrotem do 6,0 ml/min... NIE UŻYWAJ RAPID), aż dotrze do pierwszego znaku na kaniuli do przekłuwania.
    15. Wyjmij probówkę wirówkową i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza w kaniuli, przepuszczając przez nią trochę roztworu Chase. Wytrzyj etap przekłuwania do czysta.
      UWAGA: Część resztek wody może wyciekać z komory przepływowej.

5. Frakcjonowanie gradientowe i pobieranie próbek.

  1. Zainstalować i przekłuć probówkę wirówkową zawierającą gradient sacharozy.
  2. Umieścić jedenaście probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml w tacce na frakcję w pozycjach 1-11 tak, aby nakrętki nie wystawały do góry. Zastąp ''rurkę #1'' na razie ''rurką odpływową'', aby zebrać płyn pozostały w wężyku kolektora.
  3. Ustaw pokrętło sterowania pompą w pozycji "Ręczny", a natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na "6.0 ml/min"
  4. Naciśnij ikonę "Odtwórz" na kolektorze frakcji. Jak tylko ramię dotrze do pierwszej probówki, naciśnij przycisk ''pauza'' (spowoduje to ustawienie ramienia i otwarcie zaworu dozującego frakcję).
  5. Uruchom pompę za pomocą polecenia ''FORWARD'' i monitoruj pióro rejestratora wykresów. Gdy zacznie odchylać się w górę (wskazując, że próbka przechodzi przez komórkę przepływową spektrofotometru), szybko zamień "rurkę odpływową" na "rurkę #1".
  6. Po zebraniu pierwszej kropli szybko przełącz polecenia na "Zdalny start/stop", "Zmienna (1,0 ml/min)" i naciśnij ikonę "Odtwórz".
    UWAGA: Pompa jest teraz sterowana przez interfejs kolektora frakcji, a 1 ml frakcji będzie zbierany co minutę.
  7. Od tego momentu odczyty A260 będą pojawiać się na interfejsie rejestratora cyfrowego (lub analogowego rejestratora wykresów). Upewnij się, że przycisk ''Nagraj'' w oprogramowaniu jest wciśnięty!
  8. Po tym, jak niebieski roztwór Chase dostanie się do probówki zbiorczej lub ostatniej probówki (zwykle rurki 11), naciśnij ikonę "Stop".
    UWAGA: Zawór dozujący powinien przełączyć się na zawór odpływowy.
  9. Utrzymuj frakcje na lodzie, aż wszystkie gradienty zostaną ułamkowane. Pod koniec dnia frakcje mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przed izolacją białka lub RNA. Jeśli wymagana jest analiza białka i RNA, podziel każdą frakcję na pół (po 500 μl do analizy białek i RNA).

6. Mycie

UWAGA: (jest to opcjonalny krok, który należy wykonać tylko wtedy, gdy ma być zebranych wiele gradientów).

  1. Zanurzyć rurkę odpływową w kolbie Erlenmeyera zawierającej ~50 ml ultraczystej wody i odwrócić pompę przy natężeniu przepływu 6 ml/min.
  2. Zatrzymaj pompę, gdy roztwór Chase dotrze do pierwszego znaku na kaniuli do przekłuwania.
  3. Wyjmij probówkę wirówkową, usuń powietrze z kaniuli i wyczyść etap przebijania.
    UWAGA: Część resztek wody może wyciekać z komory przepływowej.
  4. Powtórzyć procedurę frakcjonowania, zaczynając od kroku 5.1.

7. Końcowe porządki.

  1. Odłącz rurkę pompy od spodu przebijarki i przepompuj roztwór Chase do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, używając ustawienia szybkiego przepływu. Roztwór Chase należy przechowywać w temperaturze 4 °C, ponieważ można go ponownie użyć.
  2. Podłącz rurkę pompy do 3-drożnego systemu rurek i zamknij zawór prowadzący do strzykawki. Podłącz jedną probówkę do strzykawki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą destylowaną, a drugą rurkę do podstawy przebijacza.
  3. Zainstalować probówkę ultrawirówki używaną do etapu wygaszania i przepuścić co najmniej 50 ml wody destylowanej przez spektrofotometr i probówkę zbiorczą (przełącz się do menu zbierania w interfejsie, klikając ikonę "Start/Pauza").
  4. Wyjmij rurkę, strzykawkę (użyj klucza imbusowego, aby odkręcić) i wszystkie inne wyjmowane elementy i dokładnie umyj ciepłą wodą z kranu, a następnie spłucz ultraczystą wodą.
    UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas mycia tłoka, cylindra, rurki i kaniuli przebijającej.
    UWAGA: Ze szklanym cylindrem strzykawki należy obchodzić się ostrożnie! Przechowuj wszystkie elementy z dala od kurzu.
  5. Wytrzyj dno komory przepływowej miękką chusteczką zwilżoną wodą destylowaną. Wytrzyj tackę na kolektor frakcji i wszelkie inne miejsca, w których mogła zostać rozlana sacharozy.

8. Izolacja RNA z frakcji sacharozy.

  1. Przygotować 50 μl roztworu proteinazy K na każdy 1 ml frakcji sacharozy (37,5 μl 10% SDS, 7,5 μl 0,5M EDTA, 1 μl Glycoblue, 4 μl 20 mg/ml Proteinazy K).
  2. W probówce o płaskim dnie o pojemności 2 ml inkubować 1 ml frakcji sacharozy z 50 μl roztworu proteinazy K w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę (w przypadku stosowania frakcji 500 μl należy odpowiednio dostosować objętość roztworu proteinazy K).
  3. Do > UWAGA: fenol/chloroform może powodować oparzenia w kontakcie i wdychaniu . Noś fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i używaj dygestorii.
  4. Wirować ~30 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń ~80-90% fazy wodnej (nie dotykaj interfazy, która może zawierać genomowe DNA) i umieść w nowej probówce.
  6. Dodać równą objętość chloroformu i powtórzyć krok 8.4.
  7. Usuń fazę wodną, uważając, aby uniknąć interfazy.
  8. Dodać 1:10 objętość 3 M octanu sodu o pH 5,2 (alternatywnie można użyć 5 M octanu amonu).
  9. Dodać 1,5 objętości schłodzonego, absolutnego etanolu i wirować przez 15 sekund.
  10. Wytrącać przez noc w temperaturze -20 °C (lub 1 godzinę w temperaturze -80 °C w pośpiechu).
    UWAGA: W razie potrzeby próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na dłużej.
  11. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Umyj granulat 1 ml schłodzonego 70% etanolu wolnego od RNaz.
  13. Wysuszyć granulat na powietrzu i ponownie zawiesić w 20 μl wody wolnej od RNaz.
  14. Określić ilościowo całkowite RNA za pomocą spektrofotometrii w celu zapewnienia odpowiedniej wydajności i czystości (w oparciu o stosunek A260/280) i przejść do standardowej analizy RT-qPCR14 przy użyciu równych objętości każdej frakcji i starterów PCR specyficznych dla interesującego mRNA.

9. Izolacja białek z frakcji sacharozy.

  1. Oprócz RNA białka mogą być izolowane i identyfikowane również w poszczególnych frakcjach polisomów. Użyj jednego z wielu doskonałych dostępnych protokołów izolacji białek, np. 18.

Wyniki

Opisaliśmy niedawno nową rolę supresora nowotworowego PDCD4 jako selektywnego inhibitora translacji mRNA zawierających IRES i kodujących inhibitory apoptozy XIAP oraz Bcl-xL12. Profilowanie polisomów było kluczową techniką służącą do wykazania specyficznego udziału PDCD4 w translacji zależnej od IRES. Komórki HEK293 poddano transfekcji przejściowej w celu obniżenia endogennych poziomów PDCD4 (Rysunek 1A), a następnie poddano je analizie profilu polisomów. Zaobserwowaliśmy, że redukcja poziomów PDCD4 nie upośledziła globalnej translacji komórkowej, co wynikało z braku zmian w profilu polisomów przy porównaniu komórek traktowanych siCTRL i siPDCD4 (Rysunek 1B). Podobnie rozkład polisomów dla wariantu XIAP pozbawionego IRES 19 nie uległ zmianie pomiędzy komórkami traktowanymi a nietraktowanymi (Rysunek 1C). W przeciwieństwie do tego, rozkład polisomów dla dwóch mRNA zawierających IRES, XIAP i Bcl-xL, uległ znaczącej zmianie. Wobec braku PDCD4 rozkład tych dwóch mRNA przesunął się w stronę ciężkich rybopolisomów (Rysunek 1D, E). Ponieważ nie towarzyszyło temu zmianom w stacjonarnych poziomach mRNA dla XIAP i Bcl-xL (Rysunek 1F), wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i Bcl-xL w komórkach z obniżonymi poziomami PDCD4, co zostało dodatkowo potwierdzone za pomocą Western blottingu (Rysunek 1G).

Wyniki eksperymentu z siRNA pokazujące poziomy PDCD4, XIAP i Bcl-xL; Western blot, wykresy analizy mRNA.
Rycina 1: Profilowanie polizomów identyfikuje PDCD4 jako selektywny inhibitor translacji XIAP i Bcl-xL. (A) Komórki HEK293 traktowano siRNA przeciwko PDCD4 lub kontrolnym (CTRL) niecelującym siRNA, po czym poddano je lizie i analizie Western blot z użyciem przeciwciał anty-PDCD4 i anty-Nukleolina w celu weryfikacji stopnia wyciszenia PDCD4. (B) PDCD4 wyciszono zgodnie z opisem w punkcie (A), a lizaty komórkowe poddano profilowaniu polizomów. Reprezentatywny profil polizomów przedstawiono w górnym panelu; rozkład mRNA dla XIAP non-IRES (C), Bcl-xL (D) oraz XIAP IRES (E) w stosunku do GAPDH przedstawiono jako procent całkowitego mRNA (% mRNA) w każdej frakcji. (F) Stacjonarne poziomy mRNA zmierzono metodą RT-qPCR w komórkach traktowanych siRNA przeciwko PDCD4 lub kontrolnym (CTRL) siRNA. (G) Lizaty z punktu (A) poddano również analizie Western blot z użyciem przeciwciał anty-XIAP, anty-Bcl-xL i anty-Nukleolina. (Uwaga: Dane przedstawione na Rycinie 1 zostały pierwotnie opublikowane w 12) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Profilowanie polissomalne to potężna technika, która pozwala na ilościowe określenie stanu translacji określonych transkryptów w różnych warunkach leczenia. Jest to w zasadzie bardzo prosta technika, ale wymaga kilku etapów wykonania, z których niektóre mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych profili polisomowych. Te kluczowe kroki to: 1) użycie chemikaliów i tworzyw sztucznych wolnych od RNaz, 2) przygotowanie dobrych gradientów sacharozy (z naszego doświadczenia wynika, że 10-50% gradienty sacharozy najlepiej sprawdzają się do wydajnego rozwiązywania podjednostek 40/60S i mRNA ze związanymi rybosomami) oraz 3) użycie komórek, które rosną wykładniczo i nie więcej niż 80% zlewają się, aby uchwycić najwyższe wskaźniki translacji. Ten ostatni krok powinien być brany pod uwagę podczas wykonywania zabiegów z długimi komórkami, takich jak knockdown lub nadekspresja genów, tak aby ilość komórek do płytki była funkcją tego, jak bardzo komórki będą zlewać się w punkcie końcowym.

W przedstawionych tutaj wynikach analiza profilu polisomów była ważnym narzędziem do oceny roli PDCD4 w regulacji translacji mRNA XIAP i Bcl-xL12 zawierających IRES. Fakt, że nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian w ogólnych profilach polisomów po knock-down PDCD4 (Figura 1B), pozwolił nam stwierdzić, że PDCD4 nie upośledza globalnej translacji komórkowej w warunkach eksperymentu. Następnie wykorzystaliśmy analizę RT-qPCR, aby określić rozkład mRNA XIAP i Bcl-xL w komórkach traktowanych PDCD4 lub siRNA kontrolnym. qPCR jest metodą z wyboru do analizy profili polisomów, w przeciwieństwie do standardowego RT-PCR lub Northern blot, ponieważ pozwala na ilościową, a nie półilościową analizę dystrybucji mRNA oraz na wykrycie subtelnych zmian w wydajności translacyjnej między zabiegami. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie wykazać, że dystrybucja mRNA XIAP i Bcl-xL (wyrażona jako procent całkowitego docelowego mRNA w gradiencie) została znacznie przesunięta do ciężkich polirybosomów (mRNA z dużą liczbą rybosomów z nimi związanych) po knock-down PDCD4 (Figura 1D, E), wskazując w ten sposób na wzrost translacji tych mRNA. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez wzrost poziomów białek XIAP i Bcl-xL, ale nie ich poziomów RNA w stanie stacjonarnym (Figura 1F, G). Co ważne, rozkład polisomów wariantu XIAP innego niż IRES pozostał niezmieniony między komórkami leczonymi i nieleczonymi (Figura 1C). Alternatywnie, wydajność translacyjną można przedstawić jako stosunek zawartości mRNA w polisomach (zwykle frakcjach od 5 do 10) w porównaniu z monosomami (zwykle frakcjami od 2 do 4)14.

Stosowanie kontroli w całym protokole jest ważne dla walidacji wszelkich wyników profilowania polisomów, ponieważ piki obserwowane na podstawie odczytów absorbancji przy 254 nm nie mogą być same w sobie przypisane rybosomalnemu RNA (detergenty, takie jak Triton X-100 silnie absorbują w tym regionie widma i mogą zasłaniać piki 40/60S na szczycie gradientu). Należy przeprowadzić ślepe gradienty bez lizatu i/lub z buforem lizatu w celu określenia względnego udziału w absorbancji przy 254 nm. Sztuczne struktury wyższego rzędu mogą również prowadzić do błędnych interpretacji polisosomów tam, gdzie w rzeczywistości ich nie ma (np. "pseudopolisomy"20). Sekwestracja magnezu (stosowana w całej procedurze do stabilizacji rybosomów 80S) z chelatatorem kationów dwuwartościowych EDTA dodanym do lizatów i bufora gradientowego (20 mM przez 15 min) spowoduje rozdzielenie rybosomu na jego podjednostki składowe małe (40S) i duże (60S). Tak więc, jeśli piki absorbancji zarejestrowane przy 260 nm są rzeczywiście polisomami, traktowanie EDTA spowoduje załamanie profilu tak, że w pobliżu szczytu gradientu zostanie zaobserwowane pojedyncze maksimum odpowiadające wolnemu mRNA i jednostkom rybosomalnym (dane nie pokazane). Równolegle z zapadnięciem się profilu wywołanym przez EDTA, wszystkie konkretne cele analizowane za pomocą qPCR powinny teraz znajdować się na szczycie gradientu.

Liczba rybosomów związanych z mRNA nie zawsze jest wskaźnikiem tego, jak skutecznie ta konkretna mRNA jest translowana. Rzeczywiście, istnieją specyficzne konteksty, w których aktywna translacja na polisomach zostaje zatrzymana 21,22 , o czym czytelnik powinien wiedzieć. Ustalenie, czy transkrypty są aktywnie zaangażowane w maszynerię translacyjną, można przeprowadzić poprzez: a) potraktowanie próbki puromycyną, która w przeciwieństwie do EDTA powoduje "odpływ" rybosomów, które aktywnie przemieszczają się przez mRNA, lub b) potraktowanie próbki homoharringtoniną, która hamuje translokację tylko pierwszego rybosomu w kodonie startowym, ponownie powodując "spływanie" wszelkich translokujących się rybosomów w dół strumienia.

Kluczowe znaczenie ma również wykorzystanie transkryptów kontrolnych do analizy qPCR. Wybór transkryptów, na które nie mają wpływu różne warunki leczenia, takie jak niektóre geny porządkowe (GAPDH, aktyna, tubulina, nukleolina), rybosomalne mRNA (18S, RPL13A) lub w tym przypadku wariant ILES bez IRES, jest ważny dla sprawdzenia, czy wpływ leczenia na translację jest specyficzny czy uogólniony. Te transkrypty kontrolne można wykorzystać do normalizacji rozkładu analizowanych mRNA, tak jak to miało miejsce tutaj (mRNA XIAP i Bcl-xL znormalizowano do mRNA GAPDH i wyrażono jako procent całkowitej zawartości mRNA reprezentowanej przez sumę zawartości mRNA w każdej frakcji) lub alternatywnie, docelowe i kontrolne mRNA mogą być wyrażone jako wartości bezwzględne i pokazane osobno. Analiza qPCR wejściowych lizatów (zwykle 10% całkowitej objętości) jest kolejnym krokiem, który pozwoli kontrolować dystrybucję określonych mRNA. Idealnie, zawartość mRNA określonego transkryptu w lizacie wejściowym powinna być porównywalna z sumą zawartości mRNA we wszystkich 10 analizowanych frakcjach. Wreszcie, opcjonalnym krokiem do kontroli etapu ekstrakcji fenol:chloroform jest wzbogacenie każdej frakcji polisomów o mRNA reporterowe transkrybowane in vitro (takie jak CAT, acetylotransferaza chloramfenikolu), które zostanie następnie określone ilościowo za pomocą qPCR i może być nawet wykorzystane do normalizacji danych 14.

Jak w przypadku każdej techniki, profilowanie polisomów ma pewne ograniczenia. Fakt, że zwykle trzeba zebrać co najmniej 10 frakcji (bardziej subtelne zmiany w wydajności translacji mogą wymagać 20 lub więcej), aby uzyskać ładne rozkłady polysomów, sprawia, że ten krok jest ograniczający, w tym sensie, że tylko maksymalnie 4 próbki mogą być analizowane na raz, aby móc wygodnie obsłużyć ekstrakcję RNA i analizę qPCR 40 próbek i 4 kontrolnych wejść jednocześnie. Wielkość próbki może łatwo sumować się z liczbą transkryptów, które mają być analizowane i ile powtórzeń qPCR należy wykonać, co może być kosztowne. Innym ograniczeniem analizy profilowania polissomalnego opartej na qPCR jest to, że można ją przeprowadzić tylko w podejściu opartym na kandydatach (gdzie transkrypty do analizy są znane z wyprzedzeniem) i nie można jej zastosować do analizy translacji całego genomu. Jednak na początku XXIwieku badacze zaczęli badać ich polisomalne RNA na poziomie genomu za pomocą mikromacierzy DNA 15, a ostatnio za pomocą sekwencjonowania nowej generacji 16,17. W tym potężnym podejściu profilowanie polisomalne jest przeprowadzane zgodnie z opisem w tym protokole, z wyjątkiem tego, że zamiast przeprowadzać analizę qPCR poszczególnych frakcji, frakcje monosomów (zwykle frakcje 2-4) i frakcje polisomów (zwykle frakcje) są łączone razem, a zmiany w globalnej translacji analizowane za pomocą mikromacierzy DNA lub sekwencjonowania RNA całego genomu. W związku z tym dzięki takiemu podejściu możliwa jest ocena wszystkich mRNA, których dystrybucja przesuwa się z polisomów do monosomów (spadek translacji) lub odwrotnie (wzrost translacji) po określonym traktowaniu. Walidację i kwantyfikację rozkładu specyficznych polisomów mRNA można następnie przeprowadzić za pomocą qPCR. Jeszcze skuteczniejszym zastosowaniem zasady profilowania polissomalnego jest profilowanie rybosomów. Niedawno poinformowano o dalszym wysokowydajnym rozszerzeniu tej techniki, które pozwala na jednoczesne monitorowanie setek frakcji polisomów 23. Daje to wyraźną przewagę podczas sondowania wydajności translacji kolekcji zmutowanych lub w badaniach przesiewowych RNAi na dużą skalę. Profilowanie rybosomów to technika, która wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji do mapowania fragmentów RNA chronionych przez rybosomy (ślady rybosomów) zaangażowane w syntezę białek24,25. W tej technice translokacja rybosomów może być hamowana za pomocą cykloheksymidu (odwracalnego) lub emetyny (nieodwracalnego), a następnie lizy komórek i trawienia RNazy, aby uzyskać populację śladów rybosomów. Rybosomy są wzbogacane, izolowane jest całkowite RNA i usuwane jest zanieczyszczające rybosomalne i mitochondrialne rybosomalne RNA. Ślady RNA około 26-28 nukleotydów są izolowane, transkrybowane wstecznie, przekształcane do biblioteki cDNA i sekwencjonowane26. W przeciwieństwie do standardowego profilowania polisomów, podejście to nie tylko identyfikuje określone mRNA, które są regulowane translacyjnie, ale także dostarcza informacji specyficznych dla mRNA w rozdzielczości kodonów, takich jak dokładne zajęcie i gęstość rybosomów wzdłuż określonego transkryptu. Jest to szczególnie interesujące dla mRNA ze specyficznymi trybami translacji, takimi jak mRNA zawierające IRES, ponieważ może dostarczyć więcej informacji na temat tego, gdzie w transkryptie zachodzi rekrutacja rybosomów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni byłym i obecnym członkom laboratorium, w szczególności Urszuli Liwak, za krytyczną dyskusję na temat protokołów profilowania polisomów i udostępniania danych. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem, Towarzystwa Badań nad Rakiem oraz Narodowej Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych Kanady dla MH. MDF była wspierana przez Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award i Ontario Graduate Scholarship, a praca ta stanowi część jej pracy doktorskiej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gradient Master 108 automatyczna maszyna do gradientówBIOCOMP107-201M
Auto Densi-Flow dwukomorowa maszyna do gradientówLABCONCO4517000
Beckman Ultrawirówka Beckman CoulterModel # L-100-XP
Frakcjonator gradientu gęstościTELEDYNE ISCO69-3873-246Składa się z: systemu przebijania rur,  pompy perystaltycznej, detektora UA-6 z filtrami 254 i 280 nm oraz kolektora frakcji Foxy R1
Oprogramowanie do akwizycji danych WinDaqDATAQ INSTRUMENTSWINDAQ/LITE
http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmProbówki wirówkowe Pollyallomer (do SW41, 14 x 89 mm)Beckman Coulter331372
Probówki wirówkowe 2 ml bez nukleaz (nos delfina)DiaMedPRE1900-N
Probówki wirówkowe 2 ml bez nukleaz (płaskie dno)SafeSeal12000
Sacharoza (bez nukleaz)Calbiochem573113MW = 342,3 g/mol
CykloheksymidSIGMAC7698MW = 281,4 g/mol. Zawiesić w DMSO i utrzymywać w temperaturze -80C przez długi czas. Uwaga: TOKSYCZNY! Może powodować podrażnienia dróg oddechowych i skóry. Podczas ważenia noś maskę.
Chlorek sodu (bez nukleaz)OmniPur7710MW = 58,44 g/mol
MgCl2,6H2O (bez nukleaz)OmniPur5980MW = 203,3 g/mol
Tris Zasada (bez nukleaz)J.T. Baker4109-01MW = 121,14 g/mol
Triton X-100OmniPur9400Uwaga: TOKSYCZNY! Może powodować układ moczowy i podrażnienie skóry
Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RNasinPromegaN2515
RNaseZap roztwór do inaktywacji rnazyAmbion, Life TechnologiesAM9780
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg / ml)Invitrogen, Life TechnologiesAM9516
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)Ambion, Life TechnologiesAM9722Uwaga: TOKSYCZNY ! Może powodować podrażnienie dróg moczowych, a także podrażnienie i korozję skóry

Bibliografia

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  3. Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
  4. Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
  5. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  6. McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
  7. Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
  8. Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
  9. Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
  10. Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
  11. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  12. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  13. Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
  14. Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
  15. Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
  16. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
  17. Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
  18. Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
  19. Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
  20. Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
  21. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  22. Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
  23. Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
  24. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

gradient sacharozowyultrawirowanieunieruchomienie rybosom wtraktowanie cykloheksymidzbieranie frakcjidetekcja RNAregulacja translacjiodpowied na stres
Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.