Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Regulacja syntezy białek (translacja) jest kluczowym procesem komórkowym, który jest ściśle związany z przetrwaniem komórki. Biorąc pod uwagę, że translacja pochłania ponad 50% energii komórki, nie jest zaskakujące, że translacja jest ściśle regulowana, a perturbacje w translacji nie są dobrze tolerowane. I odwrotnie, wiele nieprawidłowych procesów komórkowych wymaga modyfikacji maszynerii translacyjnej i wyniku translacji (tj. proteomu). Dzieje się tak często w różnych reakcjach na stres i stanach chorobowych, a najlepszym przykładem jest prawdopodobnie rak. Kluczową zaletą kontroli translacyjnej jest zdolność komórek do szybkiego przeprogramowania wyjścia białka w odpowiedzi na różne zewnętrzne i wewnętrzne wyzwalacze, a tym samym dostrojenie mechanizmu, który przechyla równowagę między przeżyciem a śmiercią komórki¹.

Dwa aspekty kontroli translacyjnej są szczególnie interesujące; zrozumienie natury mechanizmów regulacyjnych i elementów kontrolnych, które pozwalają na specyficzną translację, oraz identyfikacja specyficznych mRNA i ich produktów białkowych, które uczestniczą w odpowiedzi komórkowej na konkretny wyzwalacz, który wywołał selektywną translację w pierwszej kolejności. Profilowanie polisomów jest techniką, która pozwala na skuteczne badanie obu procesów.

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest badanie i ilościowe określenie stanu translacji określonych mRNA w różnych warunkach komórkowych. Zasada tej techniki polega na wychwyceniu translacji mRNA poprzez "zamrożenie" aktywnie translujących rybosomów na różnych transkryptach i oddzielenie powstałych polirybosomów przez ultrawirowanie na gradionym sacharozie, co pozwala na rozróżnienie między wysoce translacyjnymi transkryptami (związanymi przez kilka rybosomów) a słabo translacyjnymi (związanymi przez jeden lub dwa rybosomy). W tym konkretnym protokole antybiotyk cykloheksymimid, który wiąże się z podjednostką rybosomalną 60S i blokuje uwalnianie zdeacetylowanego tRNA z miejsca² rybosomu E, jest używany do hamowania translokacji rybosomów i zatrzymywania rybosomów na translujących mRNA. Można jednak stosować inne środki blokujące, takie jak emetyna, która również blokuje wydłużenie translacji³.

W przeciwieństwie do technik western blotting i ^{znakowania 35}S-Metioniny, które mierzą końcowy wynik procesu translacji, profilowanie polisomów ma tę zaletę, że mierzy związek rybosomów z aktywnie translowanymi mRNA, co pozwala na bardziej szczegółowe badanie mechanizmów translacji w różnych warunkach. W związku z tym technikę tę można łatwo dostosować do specyficznego badania różnych trybów translacji^4-6, czynników białkowych zaangażowanych w regulację translacji^7-9, warunków stresowych wpływających na syntezę białek^1,10,11 lub wpływu struktur mRNA, takich jak IRES lub otwarte ramki odczytu upstream na syntezę białek^12-14. Obecnie zastosowania profilowania polisomów są jeszcze szersze dzięki zastosowaniu mikromacierzy DNA ¹⁵ lub sekwencjonowania nowej generacji ^16,17 do analizy mRNA związanych z polisomami.

UWAGA: Uwaga dotycząca pracy z RNA: Podejmij standardowe środki ostrożności w celu ochrony przed degradacją RNA przez RNazy. Używaj rękawiczek, barierowych końcówek do pipet, wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz i chemikaliów na wszystkich etapach protokołu. Do wszystkich roztworów należy używać wody ultraczystej lub uzdatnionej metodą DEPC. Odkaż wszelkie podejrzane powierzchnie roztworem inaktywacyjnym RNazy zgodnie z protokołem producenta.

1. Przygotowanie roztworów.

1. Przygotować 500 ml roztworu zasadowego (0,3 M NaCl; 15 mM MgCl₂^.6H₂O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mieszaj za pomocą mieszadła, aż roztwór będzie klarowny i przepuść przez filtr 0,45 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj 10 i 50% roztwory sacharozy i 60% roztwór Chase w następujący sposób:
   1. W przypadku 10% roztworu sacharozy (w/v), w 50 ml probówce wirówkowej dodaj 5 g sacharozy i napełnij do 50 ml roztworem zasadowym. Aby uzyskać 50% roztwór sacharozy (w/v), w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 25 g sacharozy i napełnij do 50 ml roztworem zasadowym.
   2. Aby uzyskać 60% (w/v) roztwór Chase, w 50 ml probówce wirówkowej dodać 30 g sacharozy i napełnić do 50 ml roztworem zasadowym. Dodać 100 μl nasyconego roztworu błękitu bromofenolowego (dodać błękit bromofenolowy do wody, aż więcej się nie rozpuści; odwirować w celu osadzenia nierozpuszczonego proszku) do 60% roztworu pościgowego. Wymieszać za pomocą wiru i sprawdzić całkowite rozpuszczenie.
   3. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
3. Przygotować bufor do lizy RNA. Przygotuj ten bufor na świeżo w dniu eksperymentu. Przygotować 500 μl buforu do lizy RNA dla każdej próbki. Do 1 ml roztworu zasadowego dodać 10 μl Triton X-100 (1% [v/v] final), 1 μl 100 mg/ml cykloheksymidu w DMSO (CHX, 0,1 mg/ml final) i 3,5 μl RNasin (140 U/ml). Wymieszaj za pomocą wiru. Przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Cykloheksymid jest wysoce toksyczny i może powodować mutacje. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania. Aby uniknąć zbyt częstego obchodzenia się z proszkiem, należy przygotować większą ilość 100 mg/ml bulionu w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Utrzymuj zapas roboczy w temperaturze -20 °C.
4. W dniu eksperymentu przygotuj roztwory Sacharoza + CHX, dodając CHX (końcowe stężenie 0,1 mg / ml) do pożądanej objętości 10% i 50% roztworu sacharozy (~ 7 ml każdego roztworu na gradient).

2. Przygotowanie gradientu sacharozy za pomocą automatycznego kreatora gradientów

1. Włącz kreator gradientów ''ON'' i wypoziomuj płytkę, na której będą znajdować się gradienty (krytyczny krok!) Kliknij na ''Gotowe'', gdy płyta jest wyrównana.
2. Wybierz z menu program gradientu, który chcesz uruchomić:
   1. Naciśnij menu ''GRAD'' i wybierz ''LISTA''.
   2. Wybierz "SW41".
   3. Przewiń listę i wybierz program ''10 - 50% gradient - 11 kroków'', naciskając przycisk ''URUCHOM''.
3. Umieść stożkową probówkę ultrawirówki (probówka SW-41, 14 x 89 mm) w bloku znaczników i użyj dołączonego markera z drobną probówką, aby narysować znak na probówce wzdłuż górnego stopnia bloku znacznika. Umieść rurki w stojaku montażowym na stabilnej powierzchni.
   UWAGA: Ten znak będzie wskazówką dotyczącą napełniania warstwami 10 i 50% roztworów sacharozy.
4. Podłącz dwie dostarczone kaniule do dwóch strzykawek o pojemności 10 ml i umyj, pipetując w górę iw dół ciepłą wodą destylowaną zawierającą roztwór inaktywacyjny RNazy. Upewnij się, że później usunąłeś wszystkie ślady wody.
5. Napełnij jedną ze strzykawek 10% sacharozą+CHX i włóż kaniulę na dno probówki ultrawirówki. Delikatnie dozować 10% roztwór sacharozy, aż przejdzie tuż obok oznaczenia na probówce.
   UWAGA: Unikaj robienia bąbelków. Jeśli utworzą się bąbelki, delikatnie postukaj w rurkę, aby je przemieścić.
6. Napełnij drugą strzykawkę 50% sacharozą+CHX, zetrzyj nadmiar płynu chusteczką i delikatnie włóż kaniulę na dno probówki ultrawirówki. Delikatnie dozuj 50% roztwór sacharozy, aż osiągnie dokładnie ten sam cel. Szybko i płynnie wyjmij kaniulę.
   UWAGA: 10% sacharozy powinno unieść się w probówce i utworzyć łąkotkę u góry. Jeśli nie, dodaj więcej 10% roztworu sacharozy na powierzchni.
7. Włóż dostarczoną nasadkę, lekko przechylając probówkę ultrawirówki i usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Usuń nadmiar płynu ze zbiornika nakrętki za pomocą mikropipety.
8. Wytrzyj nadmiar płynu wzdłuż ścianki rurki i umieść na płycie gradientu.
9. Naciśnij przycisk ''RUN''.
   UWAGA: Płyta przechyli się pod określonym kątem, zatrzyma się na 5 sekund i rozpoczną się obroty w celu utworzenia gradientu.
10. Po zakończeniu tworzenia gradientu (około 2 minuty, maszyna wyda sygnał dźwiękowy), delikatnie wyjmij ultrawirówkę(y), umieść na stojaku i szybko zdejmij nasadkę ruchem w górę, aby uniknąć zakłócenia gradientu.
11. Utrzymuj nachylenie (nachylenie) na lodzie. Nie przeszkadzać! Alternatywnie, gradienty utrzymują się przez noc w temperaturze 4 °C.
12. Alternatywnie użyj dwukomorowego kreatora gradientów, aby utworzyć gradienty w następujący sposób:
    1. Przepłucz rurki i ekspres gradientowy roztworem do inaktywacji RNazy i wodą wolną od RNaz.
    2. Dodaj 5 ml 50% sacharozy + CHX do proksymalnej komory ekspresu gradientu i upewnij się, że powietrze między dwiema komorami zostało usunięte.
    3. Dodać 5 ml 10% sacharozy + CHX do dystalnej komory ekspresu gradientu.
    4. Dodać 0,5 ml 50% sacharozy+CHX na dno stożkowej probówki wirówkowej (probówka SW-41, 14 x 89 mm) i umieścić w uchwycie na probówki.
    5. Włączyć mieszadło umieszczone w komorze proksymalnej, otworzyć kurki odcinające i nachylić osad z prędkością ustawioną na "3" (ok. 1ml/min).
    6. Umieść gradient(y) na lodzie. Nie przeszkadzać.
       UWAGA: Nachylenia można utrzymywać przez noc w temperaturze 4 °C.

3. Liza komórek i ultrawirowanie.

1. Umieścić wirnik i wiadra SW-41 w temperaturze 4 °C i ustawić wirówkę na 4 °C.
   UWAGA: Procedura lizy komórek jest zoptymalizowana dla dwóch 150 mm subkonfluentnych (~ 70-80% zlewających się) płytek komórek HEK293 na gradient, a stosowane objętości mogą wymagać dostosowania dla różnych linii komórkowych.
2. Płytki komórek o odpowiedniej gęstości komórek w pożywce wzrostowej co najmniej 24 godziny przed lizą.
3. Przygotować podwielokrotność (20 ml na płytkę 150 mm) pożywki wzrostowej zawierającej 0,1 mg/ml CHX.
4. Inkubować komórki w pożywce CHX + (20 ml na płytkę 150 mm) przez 3 minuty w temperaturze 37 °C/5% CO₂ w celu zatrzymania i ustabilizowania polisomów.
5. Pracując szybko, odessaj pożywkę z płytek, umieść płytki na lodzie i raz umyj komórki 10 ml lodowato zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ , 1,8 mM KH₂PO₄) uzupełnionej CHX (końcowe stężenie 0,1 mg / ml), uważając, aby powoli pipetować w dół boku ścianki naczynia, aby zminimalizować unoszenie się monowarstwy komórki.
6. Odessać PBS i dodać dodatkowe 10 ml PBS+CHX do każdej płytki, zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i przenieść całkowitą objętość z obu płytek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie. Zachować 1 ml zawiesiny komórkowej w probówce do mikrofuge na lodzie do dalszej analizy białka.
7. Odwirować probówkę z komórkami o pojemności 50 ml przy ciśnieniu 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
8. Usuń cały PBS i ponownie zawieś osad w 500 μl lodowatego buforu do lizy RNA.
9. Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
10. Pipetować w górę i w dół, aby lizować komórki i inkubować na lodzie przez 10 minut, od czasu do czasu wirując.
11. Wirować przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania jąder osadzania.
12. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
13. Wirować przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu osadzania resztek komórek.
14. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i użyć 2 μl do pomiaru gęstości optycznej przy 260 nm (użyć buforu do lizy jako ślepej próby).
15. Usunąć 50 μl (10% całości) z każdej próbki w celu analizy całkowitego RNA. UWAGA: Lizat można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
16. Delikatnie załadować równe jednostki A260 na każdy gradient sacharozy (min. 10 OD, optymalnie 25 OD, w maksymalnej objętości 500 μl; w razie potrzeby rozcieńczyć skoncentrowany lizat dodatkowym buforem do lizy).
17. Upewnij się, że gradienty znajdują się w odległości nie większej niż 0,1 g od siebie przed ultrawirowaniem.
18. Gradienty wirówki przy 39 000 obr./min (260 343 x g) przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
19. Podczas wirowania utrzymuj hamulec wirnika włączony i wyłączaj go podczas zwalniania, gdy osiągnie 1,000 obr./min.
    UWAGA: Ten krok minimalizuje wszelkie zakłócenia nachyleń spowodowane nagłymi zmianami przyspieszenia, gdy główki szczotek stykają się z wirnikiem podczas hamowania.

4. Konfiguracja instrumentu systemu frakcjonowania gradientowego.

1. Ustawić przyrząd i oślepić spektrofotometr wodą w następujący sposób:
   1. Włącz komponenty i pozwól lampie rozgrzać się przez co najmniej 15 minut.
   2. Upewnij się, że kolektor frakcji jest ustawiony na metodę "polisomową" (naciśnij dwukrotnie ikonę folderu; dwukrotnie strzałkę powrotu, aby powrócić do ekranu głównego).
   3. Upewnij się, że zawór na kolektorze frakcji jest ustawiony na odpady (strzałka wskazująca ikonę kosza na śmieci). Umieścić kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającą wodę destylowaną pod probówką do zbierania odpadów.
   4. Wybierz następujące ustawienia w rejestratorze wykresów: Ustaw pokrętło czułości na "USTAW LAMPĘ I OPTYKĘ"; ustaw przełącznik filtra szumów w pozycji "1.5"; ustaw pokrętło separatora szczytów na "OFF"; ustaw szybkie wybieranie wykresu na "30 cm/h" (5 cm/10 min); ustaw pokrętło regulacji linii bazowej (na górze spektrofotometru) na "MAX OPEN".
      UWAGA: Opcjonalnie: Zamiast rejestratora wykresów można użyć oprogramowania do nagrywania wykresów. Na komputerze kliknij "start". Otworzy się okno akwizycji: w menu Opcje odznacz opcję Wstrzymaj grafikę. W obszarze Skalowanie ustaw limity grafu na -10 i 100 (można je zmienić w locie podczas uruchamiania). Kliknij przycisk Zapisz, aby utworzyć nowy plik i nagrać przebieg.
   5. Umieść strzykawkę i cylinder w pompie i dokręć na miejscu (użyj dostarczonych i klucza imbusowego).
      UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno.
   6. Napełnić strzykawkę roztworem Chase Solution, używając komendy ''REV'' z SZYBKĄ prędkością. Ustaw pompę w pozycji pionowej i przepuszczaj powietrze przez rurkę za pomocą polecenia "NAPRZÓD". Używaj RAPID wyłącznie do tej funkcji i prania.
   7. Zainstaluj rurkę ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNaz.
   8. Przekłuć probówkę ultrawirówki kaniulą, aż pojawią się dwa czarne znaki (otwór dozujący znajduje się między tymi dwoma znakami) i uruchomić pompę strzykawkową w trybie "ręcznym" z prędkością 6,0 ml/min.
   9. Gdy woda przepływa przez komórkę przepływową (gdy roztwór bruzdy wypełnia 1/3 rurki), zmień prędkość na zmienną i ustaw na 1.0 ml / min.
   10. Przy natężeniu przepływu 1.0 ml/min wyreguluj pokrętło regulacji linii bazowej na spektrofotometrze, aż napięcie na wykresie spadnie do zera (+/- 0.5 jednostki).
       UWAGA: Obserwować wypływanie wody z rurki odpływowej do kolby Erlenmeyera.
   11. Ustaw żądaną czułość na "0.5" lub "1.0" AU.
       UWAGA: 1.0 AU działa najlepiej dla 10 jednostek OD w gradiencie 10 ml. Jeśli OD jest mniejsze niż 10, można użyć czułości "0.5" w celu wzmocnienia sygnału.
   12. Naciśnij przycisk Auto Baseline i dostosuj ustawienie linii bazowej do znaku 10% na rejestratorze wykresów, obracając pokrętło przesunięcia rejestratora (opcjonalnie, jeśli używasz rejestratora cyfrowego).
   13. Po osiągnięciu stabilnej linii bazowej ustaw przełącznik pompy w pozycji "OFF", a pokrętło prędkości wykresu na 60 cm/h w przypadku korzystania z analogowego rejestratora wykresów lub "OFF" w przypadku korzystania z rejestratora cyfrowego.
   14. Odzyskaj roztwór Chase, przełączając pompę w pozycję "REV" (w razie potrzeby można zwiększyć natężenie przepływu z powrotem do 6,0 ml/min... NIE UŻYWAJ RAPID), aż dotrze do pierwszego znaku na kaniuli do przekłuwania.
   15. Wyjmij probówkę wirówkową i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza w kaniuli, przepuszczając przez nią trochę roztworu Chase. Wytrzyj etap przekłuwania do czysta.
       UWAGA: Część resztek wody może wyciekać z komory przepływowej.

5. Frakcjonowanie gradientowe i pobieranie próbek.

1. Zainstalować i przekłuć probówkę wirówkową zawierającą gradient sacharozy.
2. Umieścić jedenaście probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml w tacce na frakcję w pozycjach 1-11 tak, aby nakrętki nie wystawały do góry. Zastąp ''rurkę #1'' na razie ''rurką odpływową'', aby zebrać płyn pozostały w wężyku kolektora.
3. Ustaw pokrętło sterowania pompą w pozycji "Ręczny", a natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na "6.0 ml/min"
4. Naciśnij ikonę "Odtwórz" na kolektorze frakcji. Jak tylko ramię dotrze do pierwszej probówki, naciśnij przycisk ''pauza'' (spowoduje to ustawienie ramienia i otwarcie zaworu dozującego frakcję).
5. Uruchom pompę za pomocą polecenia ''FORWARD'' i monitoruj pióro rejestratora wykresów. Gdy zacznie odchylać się w górę (wskazując, że próbka przechodzi przez komórkę przepływową spektrofotometru), szybko zamień "rurkę odpływową" na "rurkę #1".
6. Po zebraniu pierwszej kropli szybko przełącz polecenia na "Zdalny start/stop", "Zmienna (1,0 ml/min)" i naciśnij ikonę "Odtwórz".
   UWAGA: Pompa jest teraz sterowana przez interfejs kolektora frakcji, a 1 ml frakcji będzie zbierany co minutę.
7. Od tego momentu odczyty A260 będą pojawiać się na interfejsie rejestratora cyfrowego (lub analogowego rejestratora wykresów). Upewnij się, że przycisk ''Nagraj'' w oprogramowaniu jest wciśnięty!
8. Po tym, jak niebieski roztwór Chase dostanie się do probówki zbiorczej lub ostatniej probówki (zwykle rurki 11), naciśnij ikonę "Stop".
   UWAGA: Zawór dozujący powinien przełączyć się na zawór odpływowy.
9. Utrzymuj frakcje na lodzie, aż wszystkie gradienty zostaną ułamkowane. Pod koniec dnia frakcje mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przed izolacją białka lub RNA. Jeśli wymagana jest analiza białka i RNA, podziel każdą frakcję na pół (po 500 μl do analizy białek i RNA).

6. Mycie

UWAGA: (jest to opcjonalny krok, który należy wykonać tylko wtedy, gdy ma być zebranych wiele gradientów).

1. Zanurzyć rurkę odpływową w kolbie Erlenmeyera zawierającej ~50 ml ultraczystej wody i odwrócić pompę przy natężeniu przepływu 6 ml/min.
2. Zatrzymaj pompę, gdy roztwór Chase dotrze do pierwszego znaku na kaniuli do przekłuwania.
3. Wyjmij probówkę wirówkową, usuń powietrze z kaniuli i wyczyść etap przebijania.
   UWAGA: Część resztek wody może wyciekać z komory przepływowej.
4. Powtórzyć procedurę frakcjonowania, zaczynając od kroku 5.1.

7. Końcowe porządki.

1. Odłącz rurkę pompy od spodu przebijarki i przepompuj roztwór Chase do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, używając ustawienia szybkiego przepływu. Roztwór Chase należy przechowywać w temperaturze 4 °C, ponieważ można go ponownie użyć.
2. Podłącz rurkę pompy do 3-drożnego systemu rurek i zamknij zawór prowadzący do strzykawki. Podłącz jedną probówkę do strzykawki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą destylowaną, a drugą rurkę do podstawy przebijacza.
3. Zainstalować probówkę ultrawirówki używaną do etapu wygaszania i przepuścić co najmniej 50 ml wody destylowanej przez spektrofotometr i probówkę zbiorczą (przełącz się do menu zbierania w interfejsie, klikając ikonę "Start/Pauza").
4. Wyjmij rurkę, strzykawkę (użyj klucza imbusowego, aby odkręcić) i wszystkie inne wyjmowane elementy i dokładnie umyj ciepłą wodą z kranu, a następnie spłucz ultraczystą wodą.
   UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas mycia tłoka, cylindra, rurki i kaniuli przebijającej.
   UWAGA: Ze szklanym cylindrem strzykawki należy obchodzić się ostrożnie! Przechowuj wszystkie elementy z dala od kurzu.
5. Wytrzyj dno komory przepływowej miękką chusteczką zwilżoną wodą destylowaną. Wytrzyj tackę na kolektor frakcji i wszelkie inne miejsca, w których mogła zostać rozlana sacharozy.

8. Izolacja RNA z frakcji sacharozy.

1. Przygotować 50 μl roztworu proteinazy K na każdy 1 ml frakcji sacharozy (37,5 μl 10% SDS, 7,5 μl 0,5M EDTA, 1 μl Glycoblue, 4 μl 20 mg/ml Proteinazy K).
2. W probówce o płaskim dnie o pojemności 2 ml inkubować 1 ml frakcji sacharozy z 50 μl roztworu proteinazy K w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę (w przypadku stosowania frakcji 500 μl należy odpowiednio dostosować objętość roztworu proteinazy K).
3. Do > UWAGA: fenol/chloroform może powodować oparzenia w kontakcie i wdychaniu . Noś fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i używaj dygestorii.
4. Wirować ~30 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń ~80-90% fazy wodnej (nie dotykaj interfazy, która może zawierać genomowe DNA) i umieść w nowej probówce.
6. Dodać równą objętość chloroformu i powtórzyć krok 8.4.
7. Usuń fazę wodną, uważając, aby uniknąć interfazy.
8. Dodać 1:10 objętość 3 M octanu sodu o pH 5,2 (alternatywnie można użyć 5 M octanu amonu).
9. Dodać 1,5 objętości schłodzonego, absolutnego etanolu i wirować przez 15 sekund.
10. Wytrącać przez noc w temperaturze -20 °C (lub 1 godzinę w temperaturze -80 °C w pośpiechu).
    UWAGA: W razie potrzeby próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na dłużej.
11. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
12. Umyj granulat 1 ml schłodzonego 70% etanolu wolnego od RNaz.
13. Wysuszyć granulat na powietrzu i ponownie zawiesić w 20 μl wody wolnej od RNaz.
14. Określić ilościowo całkowite RNA za pomocą spektrofotometrii w celu zapewnienia odpowiedniej wydajności i czystości (w oparciu o stosunek A260/280) i przejść do standardowej analizy RT-qPCR¹⁴ przy użyciu równych objętości każdej frakcji i starterów PCR specyficznych dla interesującego mRNA.

9. Izolacja białek z frakcji sacharozy.

1. Oprócz RNA białka mogą być izolowane i identyfikowane również w poszczególnych frakcjach polisomów. Użyj jednego z wielu doskonałych dostępnych protokołów izolacji białek, np. ¹⁸.

Niedawno opisaliśmy nową rolę supresora nowotworów PDCD4 jako selektywnego inhibitora translacji mRNA zawierających IRES, kodujących inhibitory apoptozy XIAP i Bcl-xL12. Profilowanie polisomów było kluczową techniką demonstrującą specyficzny udział PDCD4 w translacji za pośrednictwem IRES. Komórki HEK293 były przejściowo transfekowane w celu wyczerpania endogennych poziomów PDCD4 (Figura 1A), a następnie poddawane analizie profilu polisomowego. Zaobserwowaliśmy, że zmniejszenie poziomów PDCD4 nie upośledzało globalnej translacji komórkowej, co ocenia się na podstawie braku zmian w profilu polisomów podczas porównywania komórek traktowanych siCTRL i siPDCD4 (Figura 1B). Podobnie, rozkład polisomów wariantu XIAP 19 innego niż IRES był niezmieniony między komórkami traktowanymi i nieleczonymi (Figura 1C). W przeciwieństwie do tego, rozkład polisomów dwóch mRNA zawierających IRES, XIAP i Bcl-xL, został znacząco zmieniony. W przypadku braku PDCD4 dystrybucja tych dwóch mRNA jest przesunięta do ciężkich rybopolisomów (ryc. 1D, E). Ponieważ nie towarzyszą temu zmiany poziomów mRNA XIAP i Bcl-xL w stanie stacjonarnym (Figura 1F), wyniki te wykazują zwiększoną translację XIAP i Bcl-xL w komórkach o obniżonych poziomach PDCD4, co zostało dodatkowo potwierdzone przez Western blotting (Figura 1G).

Ryc. 1: Profilowanie polisomów identyfikuje PDCD4 jako selektywny inhibitor translacji XIAP i Bcl-xL. (A) Komórki HEK293 traktowano siRNA PDCD4 lub kontrolnym (CTRL), niedocelowym siRNA, lizowanym i poddanym analizie Western blot z przeciwciałami anty-PDCD4 i anty-nukleolinowymi w celu sprawdzenia zakresu knock-down PDCD4. (B) PDCD4 został powalony jak w (A), a lizaty komórkowe poddano profilowaniu polisomowemu. Reprezentatywny profil polisomu jest pokazany w górnym panelu; rozkład mRNA XIAP non-IRES (C), Bcl-xL (D) i XIAP IRES (E) w stosunku do GAPDH jest pokazany jako procent całkowitego mRNA (% mRNA) w każdej frakcji. (F) Poziomy mRNA w stanie stacjonarnym mierzono za pomocą RT-qPCR w komórkach PDCD4 siRNA lub kontrolnych (CTRL) traktowanych siRNA. (G) Lizaty z (A) poddano również analizie western blot z przeciwciałami anty-XIAP, anty-Bcl-xL i anty-nukleoliną. (Uwaga. Dane przedstawione na rysunku 1 zostały pierwotnie opublikowane w 12) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.