Modele urazów rdzenia kręgowego powinny być wysoce powtarzalne. Pokazujemy, że skalibrowany model ucisku rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy jest łatwą w użyciu metodą chirurgiczną do generowania powtarzalnych urazów mysiego rdzenia kręgowego.
Artykuł metodologiczny
Skalibrowany model ucisku rdzenia kręgowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Urazy kompresyjne rdzenia kręgowego myszy są cennymi modelami zwierzęcymi do badania urazów rdzenia kręgowego (SCI) i terapii regeneracyjnej kręgosłupa. Skalibrowany model urazu kompresyjnego za pomocą kleszczy jest wygodnym, tanim i bardzo powtarzalnym modelem zwierzęcym dla SCI. Użyliśmy pary zmodyfikowanych kleszczy zgodnie z metodą opublikowaną przez Plemel i wsp. (2008) do bocznego ściśnięcia rdzenia kręgowego na odległość 0,35 mm. W tym filmie zademonstrujemy laminektomię grzbietową w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego, a następnie ucisk rdzenia kręgowego za pomocą zmodyfikowanych kleszczy. W filmie poruszymy również kwestie związane z opieką nad sparaliżowanymi zwierzętami laboratoryjnymi. Ten model urazu tworzy myszy, które wykazują upośledzenie czucia, a także upośledzoną funkcję lokomotoryczną kończyn tylnych. Co więcej, ta metoda uszkodzenia powoduje konsekwentne aberracje w patologii SCI, określone metodami immunohistochemicznymi. Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni być w stanie określić niezbędne materiały i metody wytwarzania SCI o różnym nasileniu u myszy do badań nad SCI i/lub leczenia mającego na celu złagodzenie upośledzenia po urazie.
Wprowadzenie
Zwierzęce modele SCI są cennymi narzędziami do oceny skuteczności paradygmatów terapeutycznych zaprojektowanych w celu złagodzenia uszkodzeń w wyniku urazu rdzenia kręgowego. Ze względu na konieczność eksperymentalną, modele te muszą zapewniać powtarzalne deficyty w zachowaniach lokomotorycznych i sensorycznych, być regulowane tak, aby powodować urazy o różnym nasileniu i wykazywać, że ciężkość urazu koreluje ze stopniem obserwowanego deficytu neurologicznego. Istnieją trzy główne typy SCI z różnymi cechami urazu: przecięcie, stłuczenie i kompresja1. Krótko mówiąc, uraz przecięty to uszkodzenie rdzenia kręgowego, uraz stłuczenia powstaje w wyniku krótkiej, ogniskowej siły przyłożonej do grzbietowego rdzenia kręgowego, a uraz kompresyjny występuje, gdy na rdzeń kręgowy przyłożona jest uraz powodujący uszkodzenie i może być również określany jako uraz zmiażdżenia2.
Całkowite urazy przecięcia są klinicznie rzadkie u ludzi3, podczas gdy urazy spowodowane stłuczeniem i kompresją są częstsze. Uraz kompresyjny daje wynik podobny do tego, który występuje w ludzkim SCI spowodowanym na przykład uciskiem guza lub innymi szkodliwymi siłami ściskającymi i może być wykonany przy użyciu prostego zestawu narzędzi. Urazy stłuczenia i ucisku są podobne pod tym względem, że oba są siłą ściskającą i oba mają podobne cechy patologiczne, takie jak dezorganizacja cytoarchitektoniczna, i wywołują podobne endogenne reakcje na uraz1,4. Model urazu stłuczenia zwykle przykłada tę siłę do grzbietowego rdzenia kręgowego za pomocą specjalnego aparatu w sposób podobny do ludzkich przypadków SCI wynikających z zaklinowania kręgosłupa2,5,6. Natomiast urazy kompresyjne mogą być generowane różnymi metodami przykładania siły grzbietowo lub bocznie. Metody urazu uciskowego obejmują skalibrowane kleszcze7, klipsy tętniaka2 lub umieszczenie ciężaru bezpośrednio na rdzeniu kręgowym8. Zaletą klipsów do tętniaków jest to, że są one w stanie zapewnić różne ilości siły9. Metoda bezpośredniego dodawania ciężarów do grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego8 wymaga, aby ciężar był na miejscu przez 10 minut, co drastycznie wydłuża czas trwania operacji i powoduje niespójności wynikające z ułożenia ciężaru i ruchu spowodowanego oddychaniem zwierzęcia. Ze względu na niewielkie rozmiary myszy, umieszczanie zwierząt w specjalistycznych aparatach przeznaczonych do stosowania u szczurów, takich jak impaktory do urazów kontuzyjnych, może być trudne lub powodować niespójne obrażenia7. Jednak myszy są dostępne w szerokiej gamie szczepów transgenicznych, w przeciwieństwie do większych zwierząt, takich jak szczury czy króliki, które są bardzo przydatne w badaniach nad SCI.
Metoda Plemel polegająca na użyciu kalibrowanych kleszczyków do uciskania rdzenia kręgowego generuje powtarzalne SCI z wysokim stopniem korelacji między ciężkością urazu a deficytem neurologicznym7. Ten chirurgiczny model SCI jest generowany przy użyciu pary kleszczy Dumonta nr 5 zmodyfikowanych tak, aby były trzymane oddzielnie w określonej odległości przez metalową żywicę epoksydową lub inną przeszkodę, aby zapobiec całkowitemu zamknięciu. Ten zaprojektowany odstęp zapewnia, że kleszcze zawsze będą zbliżać się do określonej szerokości podczas wielu operacji i przez różnych użytkowników. Zaletą metody Plemel jest to, że materiały do produkcji skalibrowanych kleszczyków można łatwo zakupić i zmontować w laboratorium bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Kleszcze te mogą wytrzymać wiele rund autoklawowania i sterylizacji, a brak oddzielnego, nieporęcznego aparatu usprawnia operacje.
W tym filmie pokazujemy chirurgiczne użycie pary skalibrowanych kleszczyków na rdzeniu kręgowym myszy w celu wygenerowania urazu kompresyjnego. Zajmujemy się również wyjątkowymi problemami związanymi z opieką nad zwierzętami laboratoryjnymi z uszkodzeniem rdzenia kręgowego w celu poprawy ich jakości życia po operacji i zmniejszenia śmiertelności.
Protokół
Wszystkie procedury i metody opieki nad zwierzętami powinny być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC).
1. Przygotowanie chirurgiczne
- Zbierz wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne i odczynniki: kleszcze, nożyczki vana, roungeurs, retraktor, skalpele, nożyczki, szwy, zszywki do skóry, patyczki higieniczne, sterylną sól fizjologiczną, gąbki chirurgiczne i izofluran. Przygotuj i autoklawuj kompletny zestaw narzędzi chirurgicznych przed operacją. Jeśli wykonujesz operacje na więcej niż jednej myszy, przygotuj i sterylizuj w autoklawie jedną paczkę narzędzi na zwierzę lub autoklawuj jedną paczkę narzędzi chirurgicznych i sterylizuj sterylizatorem narzędzi między operacjami. Ogólnie rzecz biorąc, jedno opakowanie wysterylizowanych narzędzi może być używane na maksymalnie 5 myszach, jeśli terilizator ze szklanymi kulkami jest używany do czyszczenia narzędzi między operacjami (po 5 zwierzętach narzędzia muszą być ponownie oczyszczone i wysterylizowane przed użyciem). Skontaktuj się z lokalnym administratorem IACUC, aby uzyskać wytyczne dla poszczególnych instytucji.
- Wysterylizuj pole operacyjne chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym. Ustaw obłożenia chirurgiczne, aby zapewnić utrzymanie sterylnego pola podczas operacji.
- Zważ każdą mysz przed operacją. Podawać podskórnie dawkę 0,05 mg/kg masy ciała buprenorfiny.
- Znieczulić zwierzę, podając izofluran w dawce 4% w komorze indukcyjnej maszyny do izofluranu.
- Po znieczuleniu zwierzęcia nałóż maść na oczy, aby zapobiec odwodnieniu, ustaw zwierzę na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C i upewnij się, że głowa myszy jest prawidłowo umieszczona w stożku anestezjologicznym. (Uwaga: Użyj źródła ciepła, które nie spowoduje oparzeń termicznych; tj. krążący koc wodny, termofor lub odpowiednik.)W tym momencie należy podać zwierzęciu dawkę 2% izofluranu.
- Ogolić grzbietową powierzchnię myszy, około 1 cm wokół zamierzonego miejsca nacięcia.
- Zdezynfekuj miejsce nacięcia, przemywając chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym, a następnie roztworem jodu (10% jodu powidonu, 1% jodu dostępnego). Powtórz 3 razy.
2. Laminektomia grzbietowa
- Przed wykonaniem nacięcia upewnij się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone, sprawdzając odruchy metodą szczypania palców u nóg lub ogonów.
- Wykonaj nacięcie wzdłuż grzbietu kręgosłupa za pomocą skalpela i ostrza, a następnie ponownie sprawdź odruchy. Odchyl plecy w łuk, aby prawidłowo uwidocznić punkty orientacyjne, takie jak granice między kręgami.
- Przeciąć skórę. Włóż retraktor, aby utrzymać skórę i powięź z powrotem od rdzenia kręgowego. Oczyść tkankę po obu stronach rdzenia kręgowego, aby odsłonić mięśnie pokrywające kręgosłup.
UWAGA: Chirurg powinien być zaznajomiony z anatomicznymi punktami orientacyjnymi. Na przykład dolny kąt łopatki odpowiada T7. Wierzchołek naturalnej krzywizny kręgosłupa myszy to T12 i może być używany jako punkt odniesienia. - Przy odpowiednim oświetleniu określ przestrzeń między kręgami. Znajdź tylny koniec T10 i przetnij mięśnie i powięź prostopadłą do przestrzeni krążka międzykręgowego. Wytnij tylko tyle, aby odsłonić wyrostek kolczysty i tylną blaszkę T10.
- Za pomocą pary kleszczy Dumont #5 z cienką końcówką usuń część tkanki z blaszki i wyrostka kolczystego, aby odsłonić mały fragment rdzenia kręgowego. W razie potrzeby użyj kleszczyków tkankowych, aby ustabilizować kręgosłup.
- Wykonaj laminektomię, wkładając jedną stronę pary małych nożyczek vana wzdłuż grzbietowo-bocznej strony kręgu i tuż pod blaszką.
- Wykonuj małe, ostrożne nożyce, aby przeciąć boczną stronę blaszki kręgowej. Upewnij się, że na rdzeń kręgowy nie wywierany jest nacisk.
- Powtórz po drugiej stronie.
- W razie potrzeby delikatnie uciskaj patyczkiem higienicznym lub gąbką chirurgiczną, uważając, aby nie wywierać nacisku na rdzeń kręgowy.
UWAGA: Przygotuj piankę żelową nasączoną sterylną solą fizjologiczną na wypadek konieczności opanowania krwawienia. - Po wykonaniu nacięć podnieś grzbietową część kręgu i delikatnie usuń wszelkie przyczepy tkankowe. W razie potrzeby należy zastosować odpowiednie środki w celu zatamowania krwawienia.
3. Kompresja rdzenia kręgowego
- Używając kleszczy roungeurs lub laminektomii, upewnij się, że boczne strony rdzenia kręgowego są wolne od kości kręgowej, tak aby skalibrowane kleszcze do urazu kompresyjnego mogły znajdować się po obu stronach rdzenia kręgowego. Ramiona kleszczy muszą być umieszczone w przestrzeni zewnątrzoponowej po sąsiednich stronach rdzenia kręgowego, a końcówki kleszczy muszą być w stanie dotrzeć do dna kanału kręgowego.
- Upewnij się, że widoczność rdzenia kręgowego jest dobra.
- Umieść skalibrowane kleszcze Dumont #5 mniej więcej pośrodku odsłoniętego segmentu rdzenia kręgowego. Przypomnijmy, że ramiona kleszczy muszą być umieszczone w przestrzeni zewnątrzoponowej po sąsiednich stronach, a końcówki muszą dotykać dna kanału kręgowego, aby spowodować powtarzalne urazy.
- Ostrożnie ściśnij rdzeń kręgowy, aż przekładki się połączą. Przytrzymaj w miejscu przez 15 sekund.
- Delikatnie zwolnij siłę ściskającą i usuń skalibrowane kleszcze z rdzenia kręgowego. W celu odzyskania homeostazy przed zamknięciem rany należy użyć jałowej soli fizjologicznej.
4. Zamykanie ran
- Ostrożnie zszyj warstwę mięśniową nad rdzeniem kręgowym, uważając, aby nie zakłócić ani nie wywierać nacisku na rdzeń kręgowy.
- Użyj szwów lub zszywek, aby zamknąć skórę nad raną.
- Jeśli używasz znieczulenia gazowego, zacznij zmniejszać/wyłączać środek znieczulający.
- Podawać 0,1 ml obrączkarek z mleczanami na 10 g masy ciała, aby pomóc w uwzględnieniu odwodnienia podczas operacji i po operacji, gdy zwierzę jest ospałe i dochodzi do siebie po urazie. Przed wstrzyknięciem roztwór należy ogrzać do temperatury ciała.
- Umieść mysz w klatce bez ściółki. Klatka powinna spoczywać na poduszce grzewczej (jak opisano w 1.1.5) w taki sposób, aby połowa obszaru klatki znajdowała się na podkładce, podczas gdy druga połowa spoczywała na liczniku RT, aby dać myszowi opcje klimatyczne, gdy jest już w ruchu. Zadbaj o to, aby "klatka odzyskiwania" znajdowała się w cichym otoczeniu. Uważnie monitoruj zwierzę, aż odzyska przytomność, w którym to czasie mysz można przenieść do zwykłej klatki z pościelą.
5. Opieka pooperacyjna
- Po zabiegu należy podawać podskórnie dawkę 0,05 mg/kg masy ciała buprenorfiny co 12 godzin przez pierwsze 3 dni po zabiegu, a następnie w razie potrzeby w celu opanowania objawów bólu.
- Dawkę obrączkarza z mleczanami należy podawać podskórnie 0,1 ml na 10 g masy ciała) przez pierwsze 3 - 5 dni po zabiegu. Dawkę tę należy podać, jeśli/kiedy zwierzę zacznie wykazywać objawy odwodnienia poza tym początkowym okresem.
- Ręcznie odciągaj pęcherz moczowy zwierząt za pomocą manewru Crede dwa razy dziennie. Delikatnie dotykaj brzucha zwierzęcia, aby zlokalizować pęcherz, a następnie delikatnie uciskaj w dół, aż pęcherz będzie pusty.
- Jeśli pęcherz moczowy nie opróżnia się lub mocz jest krwawy lub mętny, należy podawać zwierzęciu 50 mg/kg masy ciała Baytrilu we wstrzyknięciu międzyotrzewnowym przez 10 dni.
- Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak autofagii, odwodnienia i nadmiernej utraty masy ciała (więcej niż 20% masy ciała). Jeśli zwierzę doświadczy któregokolwiek z tych objawów, należy natychmiast skonsultować się z weterynarzem w sprawie opcji leczenia lub poddać zwierzę eutanazji w sposób humanitarny, zgodnie z wytycznymi IACUC.
- Biorąc pod uwagę, że mobilność może być ograniczona zaraz po operacji, należy podjąć niezbędne kroki, aby zapewnić zwierzętom dostęp do pożywienia i wody. W takich przypadkach paczkowana mokra karma, a także hydrożel, mogą być dostępne dla zwierząt.
6. Oceń uszkodzenia tkanek wynikające z urazu kompresyjnego
- Znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w krokach 1.4 i 1.5. Sprawdź głębokość znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi i monitorowanie odruchów mrugania rogówki. Gdy zwierzę jest niewrażliwe na bodźce, przejdź do kroku 6.2.
- Wykonaj perfuzję śródsercową10.
- Odsłoń jamę klatki piersiowej i włóż igłę do lewej komory. Wypłucz istniejące płyny za pomocą 20 - 30 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 15 - 25 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA).
- Usuń rdzeń kręgowy.
- Przeciąć skórę od grzbietu do rdzenia kręgowego i usunąć nadmiar tkanki otaczającej długość kręgosłupa.
- Wyciąć kręgosłup i odciąć pozostałą tkankę. Rzeczywisty poziom laminektomii i urazu można potwierdzić, licząc żebra.
- Użyj nożyczek i kleszczy vanna, aby przemieścić małe odcinki kręgosłupa w kierunku ogonowym do rostralnego. Kontynuuj cięcie, aż przewód zostanie odsłonięty na tyle, aby umożliwić bezpieczne usunięcie. Wizualizacja miejsca i procesu cięcia może być ułatwiona dzięki zastosowaniu stereoskopu.
- Umieść tkankę rdzenia kręgowego w 4% PFA. Pozostawić tkankę do utrwalenia w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
- Tkanka krioprotekcyjna, inkubacja w 30% sacharozie przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
- Zanurz tkankę w OCT. Krótko mówiąc, weź tkankę z 30% inkubacji sacharozy i usuń nadmiar roztworu. Umieścić tkankę w kriofordzie wypełnionym OCT i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Usunąć pleśń z 4 °C, potwierdzić kierunkową orientację tkanki, umieścić formę w płytkim naczyniu z 2-metylobutanem (wstępnie schłodzonym przez 1 godzinę na suchym lodzie) i pozostawić OCT do całkowitego zestalenia się. Przechowywać na suchym lodzie w przypadku natychmiastowego użycia lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Pokrój tkankę na skrawki strzałkowe o długości 20 μm za pomocą kriostatu. Zamontuj chusteczkę bezpośrednio na szkiełkach. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E).
- Krótko nawodnij tkankę (5 min, 2 razy), zaplamij hematoksyliną (2,5 min) i umyj wodą (1 min, 2 razy).
- Inkubować tkankę w 50%, a następnie 70% etanolu (po 3 minuty), barwić eozyną (45 sekund) i odwadniać przez inkubację w 90% (5 sekund), 95% (5 sekund), 100% etanolu (2 min) i izopropanolu (2 min).
- Klarować ksylenem (5 min, 3 razy).
UWAGA: Barwienie H&E będzie się różnić w zależności od grubości i warunków tkanki. Dlatego przed przystąpieniem do pobierania eksperymentalnych próbek tkanek wymagana jest standaryzacja.
- Przykryj tkankę cienkim paskiem Permount (~100 μm) i szkiełkiem nakrywkowym. Dociśnij szkiełko nakrywkowe ze wszystkich stron, aby zapewnić prawidłowe rozprowadzenie płynu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N.
- Wizualizuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu cyfrowego i rejestruj obrazy za pomocą dołączonego oprogramowania.
Wyniki
U 12 myszy (25 - 30 gramów) przeprowadzono laminektomię zgodnie z powyższym opisem, a następnie wykonano kompresję rdzenia kręgowego przy wartościach 0.25 mm (n = 4), 0.35 mm (n = 4) oraz 0.55 mm (n = 4). Zwierzęta uśmiercono w trzecim (n = 6) i siódmym (n = 6) dniu po urazie poprzez perfuzję wewnątrzsercową. Rdzeń kręgowy wyjęto z kanału kręgowego, a następnie tkankę przygotowano i przetworzono zgodnie z powyższym opisem. Obrazy całego rdzenia kręgowego wykonano za pomocą cyfrowego mikroskopu Leica EZ4 oraz dołączonego oprogramowania. Obrazy przekrojów rdzenia kręgowego wykonano przy powiększeniu 2X przy użyciu cyfrowego mikroskopu Olympus oraz dołączonego oprogramowania.
Stwierdzono, że kompresja rdzenia kręgowego powoduje uraz, którego centrum znajduje się w miejscu ucisku (Rysunek 1). Skutki urazu rozciągają się na kilka milimetrów w kierunku rostralnym i kaudalnym. Stopień nasilenia urazu wzrastał wraz ze zmniejszaniem się odległości między dystansami (0.25 mm > 0.35 mm > 0.55 mm, Rysunek 2). Trzy dni po kompresji w centrum urazu oraz w obszarach otaczających widoczna była krew, która nie występowała 7 dni po urazie. Kompresje o wartości 0.25 mm i 0.35 mm doprowadziły do powstania jamistości, czego nie zaobserwowano w modelu 0.55 mm. Po 7 dniach w miejscu centrum urazu odnotowano znaczny zanik wielkości grzbietowej i brzusznej istoty białej, organizacja istoty szarej była silnie zaburzona, a jamistość utrzymywała się. Te zmiany cytoarchitektoniczne przekładają się na zaburzenia motoryczne i sensoryczne w zachowaniu zwierząt, oceniane za pomocą odpowiednich testów, takich jak skala Basso Mouse Scale for Locomotor Function oraz testy włókien von Frey i chlorkiem etylu w celu oceny funkcji sensorycznych, co wykazano w poprzednich publikacjach8.
Rycina 1. Reprezentatywne obrazy nieuszkodzonego rdzenia kręgowego przed i po urazie. (A) Nieuszkodzony rdzeń kręgowy. (B) Rdzeń kręgowy po kompresji o 0,35 mm. Strzałki wskazują granicę urazu. Gwiazdka oznacza epicentrum urazu. D = grzbietowy, L = boczny. Pasek skali: 0,50 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy rdzenia kręgowego myszy przed i po kompresyjnym urazie rdzenia przy różnych szerokościach kompresji. (A) Przekrój strzałkowy rdzenia kręgowego kontrolnego. (B) Przekrój czołowy w centrum urazu (epicenter) SCI o szerokości 0,35 mm 7 dni po urazie kompresyjnym (dpi). (C,E,G) Przekroje strzałkowe rdzeni kręgowych 3 dpi o szerokości 0,25, 0,35 lub 0,55 mm. (D,F,H) Przekroje strzałkowe rdzeni kręgowych barwionych H&E 7 dpi o szerokości 0,25, 0,35 lub 0,55 mm. Gwiazdka oznacza centrum urazu. Wszystkie przekroje barwione H&E. D = grzbietowy, L = boczny. Pasek skali: 1,25 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Wybór modelu SCI jest ważny w projektowaniu eksperymentów mających na celu określenie skuteczności leczenia przypadków SCI u ludzi. Takie eksperymenty wymagają modelu zwierzęcego, który jest wysoce powtarzalny, aby ograniczyć zmienność, która może skutkować niejednoznacznymi danymi. Powinny one mieć również znaczenie kliniczne, aby dokładnie ocenić stan człowieka, który modelują. W tym celu wybór urazu uciskowego lub stłuczenia zamiast przecięcia jest bardziej istotny klinicznie3. Jednak impaktory i aparaty do obniżania masy ciała w przypadku kontuzji wymagają użycia drogich i skomplikowanych maszyn. W przeciwieństwie do tego, skalibrowany model kleszczy SCI wykorzystuje zmodyfikowane kleszcze, które są łatwe do złożenia z powszechnych materiałów laboratoryjnych, a operacja wymaga tylko jednego dodatkowego kroku po standardowej laminektomii grzbietowej, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Jednak jedną z wad stosowania tej metody jest to, że siła ściskająca jest zawsze przykładana bocznie, a nie grzbietowo, co najczęściej obserwuje się w klinicznych przypadkach SCI9 u ludzi, a urazy kompresyjne generowane przy użyciu tej metody wpływają na większy rostralno-ogonowy zasięg tkanki niż modele stłuczeń1,2. Model ten został zademonstrowany przez pomysłodawców tej techniki, a także przez nas, w celu wygenerowania powtarzalnego SCI7,11 i jest dobrze dopasowany do wielkości myszy. Co więcej, ten model urazów pozwala na ocenę zwierząt po operacji i zabiegach terapeutycznych przy użyciu wielu testów behawioralnych, takich jak skala Basso Mouse for Locomotion i test włosów von Freya, w celu sprawdzenia, czy kohorta zwierząt ma taką samą ciężkość urazu i deficyty neurologiczne7,11-13. Te same techniki mogą być również stosowane do oceny skuteczności leczenia podawanego zwierzętom podczas badań śledczych, spełniając ogólne kryteria dla modeli zwierzęcych stosowanych do oceny terapii SCI2,7.
Metoda produkcji skalibrowanych kleszczy do modelu urazu jest prosta i można ją osiągnąć za pomocą wielu różnych metod. Zastosowaliśmy metodę dystansową11, opublikowaną przez Plemel7, a także zmodyfikowaliśmy kleszcze za pomocą małej, co nie tylko zapewnia łatwiejszą metodę tworzenia urządzenia uciskowego, ale także pozwala na wszechstronność w regulacji końcowej szerokości kompresji, co jest korzystne dla badań porównawczych. Zakres opcji tworzenia kleszczy jest prawie nieograniczony, o ile przekładki zapewniają stabilny sposób zamykania kleszczy na tę samą odległość i mogą wytrzymać autoklawowanie i sterylizację. Metody chirurgiczne opisane w tym filmie są wysoce powtarzalne u wszystkich użytkowników, jednak konieczne jest zachowanie ostrożności podczas wykonywania laminektomii i zszywania zwierzęcia po wykonaniu zabiegu, aby rdzeń kręgowy nie był narażony na dodatkowe siły ściskające, które mogą zwiększyć nasilenie urazu i zakłócić przyszłe eksperymenty.
Przy odpowiednim przeszkoleniu i praktyce, skalibrowany model ucisku kleszczowego dobrze nadaje się do wykonywania SCI u myszy, które naśladują przypadki kliniczne obserwowane u ludzi2,3,7. Ze względu na łatwość tworzenia kleszczy, produkcja myszy o różnym stopniu nasilenia obrażeń może być łatwa do wykonania. Będzie to bardzo korzystne dla obserwacji wpływu genetycznego na SCI o różnym stopniu nasilenia u myszy transgenicznych, a także oceny skuteczności przeszczepów komórek macierzystych u myszy. Większość badań w literaturze przeprowadzono na szczurach ze względu na ich rozmiar, który generalnie ułatwia przeprowadzanie operacji. Jednak metoda opublikowana przez Plemela i wsp.7 i opisane przez nas w tym filmie powinny umożliwić przeprowadzenie SCI na myszach z dużą łatwością i powtarzalnością.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Fundusze na tę pracę zostały zapewnione przez Shriners Hospitals i stypendia CIRM dla AMC i AM. Chcielibyśmy również podziękować Plemel i wsp.7 za pierwsze zaprojektowanie i opublikowanie skalibrowanego modelu kleszczy
.Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Maszyna do izofluranu | Smiths Medical PM, Inc | VCT302 | |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical | NDC: 66794-013-25 | |
| Prosektorium | Seiler Mikroskopy precyzyjne | SSI 202/402 | |
| Germinator-500 (sterylizator narzędzi) | Thomas Scientific | 3885A20 | |
| Puralube (maść do oczu) | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Rękojeść do skalpela (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Ostrze skalpela (#11) | Fisher Scientific | 08-914B | |
| Retraktor (Colibri) | Narzędzia do nauki o nauce | 17000-03 | |
| Friedman Pearson roungeur | Narzędzia do nauki o nauce | 16021-14 | |
| Nożyczki Vanna (Castroviejo) | Roboz | RS-5658 | |
| Kleszczyki do tkanek | Narzędzia do nauki o | 11029-14 | |
| Kleszcze do laminektomii (Dumont #2) | Narzędzia do nauki pięknej | 11223-20 | |
| Kleszcze Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Zszywacz | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| Zszywki (klipsy do ran) | Reflex7 | 203-1000 | |
| Szwy | Henry Schein | 101-2636 | |
| Igły (30 G x ½) | 305106 | biomedycznego | |
| BD (1 ml) | 309659 | biomedyczna | |
| Baytril (enrofloksacyna) | Bayer | NADA 140-913 | |
| Buprenex (buprenorfina) | Cardinal Health | NDC 12496-0757-1 |
Bibliografia
- McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. Endogenous proliferation after SCI in animal models. Stem Cells Int. 2012, 387513(2012).
- Onifer, S. M., Rabchevsky, A. G., Scheff, S. W. Rat models of traumatic SCI to assess motor recovery. ILAR J. 48 (4), 385-395 (2007).
- Bunge, R. P., Puckett, W. R., Becerra, J. L., Marcillo, A., Quencer, R. M. Observations on the pathology of human SCI. A review and classification of 22 new cases with details from a case of chronic cord compression with extensive focal demyelination. Adv Neurol. 59, 75-89 (1993).
- Beattie, M. S., et al. Endogenous repair after spinal cord contusion injuries in the rat. Exp Neurol. 148 (2), 453-463 (1997).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe SCI in rats. J Vis Exp. 78, (2013).
- Plemel, J. R., et al. A graded forceps crush SCI model in mice. J Neurotrauma. 25 (4), 350-370 (2008).
- Wu, D., Shibuya, S., Miyamoto, O., Itano, T., Yamamoto, T. Increase of NG2-positive cells associated with radial glia following traumatic SCI in adult rats. J Neurocytol. 34 (6), 459-469 (2005).
- Namiki, J., Tator, C. H. Cell proliferation and nestin expression in the ependyma of the adult rat spinal cord after injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (5), 489-498 (1999).
- Teletin, M., et al. Histopathology in Mouse Metabolic Investigations. Current Protocols in Molecular Biology. 29, (2007).
- McDonough, A., Hoang, A. N., Monterrubio, A. M., Greenhalgh, S., Martinez-Cerdeno, V. Compression injury in the mouse spinal cord elicits a specific proliferative response and distinct cell fate acquisition along rostro-caudal and dorso-ventral axes. Neuroscience. 254, 1-17 (2013).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after SCI in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
Przedruki i uprawnienia
