Artykuł metodologiczny

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52321

⸱

8 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Streszczenie

Priony to niekonwencjonalne, samorozprzestrzeniające się cząstki białkowe, pozbawione jakiegokolwiek kodującego kwasu nukleinowego. Te białkowe nasiona służą jako matryce do konwersji i replikacji ich łagodnej izoformy komórkowej. Coraz więcej dowodów sugeruje, że wiele agregatów białkowych może działać jako samorozprzestrzeniające się matryce i zakłócać fałdowanie pokrewnych białek. Chociaż agregaty mogą być funkcjonalne w pewnych okolicznościach, proces ten często prowadzi do zakłócenia homeostazy białek komórkowych (proteostazy), co ostatecznie prowadzi do wyniszczających chorób, takich jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) lub pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE). Dokładne mechanizmy propagacji prionów i rozprzestrzeniania się agregatów białkowych z komórki między komórkami są nadal przedmiotem intensywnych badań. Aby pogłębić tę wiedzę, niedawno ustalono nowy model metazoanu w Caenorhabditis elegans, dla ekspresji domeny prionowej cytozolowego białka prionowego drożdży Sup35. Ten model prionowy ma kilka zalet, ponieważ umożliwia bezpośrednie monitorowanie fluorescencyjnie znakowanej domeny prionowej u żywych zwierząt i ułatwia podejście genetyczne. Opisano tutaj metody badania podobnego do prionów zachowania agregatów białkowych i identyfikacji modyfikatorów toksyczności indukowanej prionami przy użyciu C. elegans.

Wprowadzenie

Wiele chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE), są związane z białkami podatnymi na agregację i dlatego są zbiorczo znane jako zaburzenia nieprawidłowego fałdowania białek (PMD). TSE lub choroby prionowe stanowią wyjątkową klasę PMD, ponieważ mogą być zakaźne zarówno dla ludzi, jak i zwierząt1. Na poziomie molekularnym priony replikują się poprzez rekrutację i przekształcanie monomerycznego, bogatego w α-helisę komórkowego PrP kodowanego przez gospodarza (PrPC) w patologiczną konformację PrPSc bogatą w β arkusze2,3. Samorozmnażające się agregaty białkowe zidentyfikowano również u grzybów, które mają ważne cechy wspólne z prionamissaków 4,5. Dodatkowo priony ssaków są zdolne do przemieszczania się z komórki do komórki i infekowania komórek naiwnych6,7.

Chociaż PMD inne niż TSE nie są zakaźne, mają wspólną zasadę chorobotwórczości z chorobami prionowymi8,9. Chociaż białka połączone z każdym z PMD nie są powiązane pod względem struktury ani funkcji, wszystkie tworzą agregaty w procesie podobnym do krystalizacji zwanym polimeryzacją jądrzastą lub zarodkową; Ponadto nasiona białkowe rosną poprzez rekrutację ich rozpuszczalnych izoform2,10,11. Zdolność do samorozmnażania się różni się in vivo, w zależności od wewnętrznych właściwości białka, które wraz z dodatkowymi czynnikami komórkowymi, takimi jak molekularne białka opiekuńcze, ostatecznie determinują tempo zarodkowania agregatów, wysiewu, fragmentacji i rozprzestrzenianiasię 12-15. W związku z tym musi istnieć delikatna równowaga między tymi czynnikami, która umożliwia efektywną propagację białek. Może to również wyjaśniać, dlaczego tylko niektóre agregaty amyloidogenne mają cechy prionu, a zatem nie wszystkie PMD są zakaźne. Wydaje się, że priony reprezentują "najlepsze wyniki" w szerokim spektrum samoreplikujących się agregatów białkowych, co czyni je potężnym narzędziem do badania PMD8,13.

Intrygujące, toksyczność związana z agregatami związanymi z chorobą często ma nieautonomiczny komponent komórkowy16,17. Oznacza to, że wpływają one na sąsiednie komórki, które nie wyrażają odpowiedniego genu, w przeciwieństwie do efektu ściśle autonomicznego komórki, który oznacza, że tylko komórki wyrażające gen wykazują określony fenotyp. Zostało to przekonująco wykazane przez specyficzną tkankowo ekspresję lub knock odpowiednich białek w licznych modelach chorób neurodegeneracyjnych18-26. Jako podstawę tej nieautonomicznej dla komórek toksyczności w PMD zasugerowano różne mechanizmy, w tym zmniejszone dostarczanie składników odżywczych, brak równowagi w sygnalizacji neuronalnej, ekscytotoksyczność glutaminianu i zapalenie nerwów16,27,28. Ponadto podobny do prionów ruch agregatów związanych z chorobą między komórkami może przyczyniać się do tego aspektu29,30. Coraz więcej dowodów sugeruje, że inkluzje białek inne niż priony mogą przenosić się z komórki do komórki, co może wyjaśniać charakterystyczne rozprzestrzenianie się patologii obserwowane w wielu PMD30-36. Jednak nie ustalono jeszcze, czy istnieje wyraźny związek przyczynowy między międzykomórkowym przemieszczaniem się białek chorobowych a toksycznym wpływem na sąsiednie komórki. W związku z tym lepsze zrozumienie szlaków komórkowych, które leżą u podstaw transmisji międzykomórkowej i nieautonomicznej toksyczności komórkowej, jest konieczne i niezbędne do opracowania nowych środków terapeutycznych. Jednak wiele aspektów rozprzestrzeniania się podobnych do prionów i czynników komórkowych, które wpływają na przekazywanie z komórki do komórki nieprawidłowo sfałdowanych białek w metazoanach, nie jest dobrze poznanych, w szczególności na poziomie organizmu.

Nicień Caenorhabditis elegans ma kilka zalet, które dają potencjał do odkrycia nowych aspektów rozprzestrzeniania się prionów w metazoanach17. Jest przezroczysty, co pozwala na śledzenie in vivo fluorescencyjnie znakowanych białek w żywym organizmie. Co więcej, wiele procesów komórkowych i fizjologicznych dotkniętych chorobą jest zachowanych od robaków do człowieka, a C. elegans jest również podatny na szeroką gamę manipulacji genetycznych oraz analiz molekularnych i biochemicznych37-39. Dokładnie 959 komórek somatycznych składa się na dorosłego hermafrodytę o prostym planie ciała, który nadal ma kilka różnych typów tkanek, w tym mięśnie, neurony i jelita.

Aby stworzyć nowy model prionów u C. elegans, zdecydowaliśmy się na egzogenną ekspresję dobrze scharakteryzowanej domeny prionowej NM bogatej w glutaminę/asparaginę (Q/N) cytozolowego białka prionowego Sup35, ponieważ nie ma znanych endogennych białek prionowych u robaków4,40. Priony drożdży okazały się nieocenione w wyjaśnianiu podstawowych mechanizmów replikacji prionów41-44. Co więcej, NM jest pierwszym cytozolowym białkiem podobnym do prionów, które, jak wykazano, podsumowuje pełny cykl życia prionu w hodowli komórkowej ssaków45,46. Podobnie, gdy ulegała ekspresji u C. elegans, domena prionowa Sup35 wyjątkowo dobrze dostosowała się do różnych wymagań dotyczących rozmnażania w komórkach metazoan w porównaniu z komórkami drożdży i wykazywała kluczowe cechy biologii prionów40. Agregacja NM wiązała się z głębokim fenotypem toksycznym, w tym z zaburzeniem integralności mitochondriów i pojawieniem się różnych pęcherzyków związanych z autofagią na poziomie komórkowym, a także zatrzymaniem zarodków i larw, opóźnieniem rozwoju i rozległym zaburzeniem środowiska fałdowania białek na poziomie organizmu. Uderzające jest to, że domena prionowa wykazuje autonomiczną i nieautonomiczną toksyczność komórkową, wpływając na sąsiednie tkanki, w których transgen nie uległ ekspresji. Ponadto transport pęcherzykowy domeny prionowej w obrębie komórek i między komórkami jest monitorowany w czasie rzeczywistym in vivo40.

Tutaj opisujemy, jak badać rozprzestrzenianie się prionów u C. elegans. Wyjaśnimy, jak monitorować transport wewnątrz- i międzykomórkowy pęcherzyków zawierających domenę prionową za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Położymy nacisk na wykorzystanie specyficznych dla tkanek czujników składania i wszechobecnie wyrażanych reporterów stresu do oceny autonomicznego i nieautonomicznego wpływu komórek na sprawność komórkową. Na koniec opiszemy procedurę niedawno przeprowadzonego badania przesiewowego interferencji RNA całego genomu (RNAi) w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów toksyczności indukowanej prionami. W połączeniu metody te mogą pomóc w wyodrębnieniu szlaków genetycznych zaangażowanych w międzykomórkowy ruch białek i ich nieautonomiczną toksyczność komórkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Monitorowanie transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych za pomocą obrazowania in vivo w czasie

UWAGA: Hoduj linie dzikiego typu (WT) (N2) oraz linie transgeniczne C. elegans zgodnie ze standardowymi metodami i ściśle kontroluj temperaturę hodowli47.

  1. Wygeneruj linie transgeniczne C. elegans wykazujące ekspresję białka prionopodobnego, oznakowanego monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym (mRFP). Obejrzyj ten film, który demonstruje sposób stosowania mikroiniekcji48. Aby uzyskać więcej szczegółów i metod opisujących sposób integracji tych linii ekstrachromosomalnych, zapoznaj się z49.
  2. Przygotuj zsynchronizowane populacje poprzez składanie jaj lub wybielanie zgodnie ze standardowymi metodami50.
    1. Synchronizacja poprzez składanie jaj
      1. Przenieś 10 - 20 dorosłych osobników zapłodnionych na płytkę i pozwól im składać jaja przez 1 - 2 h. Usuń dorosłe osobniki z płytki i pozwól potomstwu rosnąć do pożądanego wieku.
    2. Synchronizacja poprzez wybielanie
      1. Zbierz niezsynchronizowaną populację dorosłych osobników zapłodnionych i wybiel je za pomocą alkalicznego roztworu podchlorynu (250 mM NaOH i rozcieńczenie komercyjnego wybielacza w H2O w stosunku 1:4 (v/v)). Przemyj jaja dwukrotnie (218 x g przez 1 min) buforem M947 (21 mMNa2HPO4·7H2O, 22 mMKH2PO4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO4·7H2O, dodać dH2O do objętości 1 L).
      2. Pozostaw je do wyklucia w buforze M9 przy łagodnym mieszaniu przez noc (O/N) w temperaturze 20 °C. Rozwój nicieni zostanie zatrzymany w stadium L1 wobec braku źródła pożywienia, co pozwoli uzyskać zsynchronizowaną populację. Przenieś stadiy L1 na świeże płytki z pożywką dla nicieni (NGM) zaszczepione bakteriami E. coli OP50 i pozwól potomstwu rozwijać się do pożądanego wieku47.
  3. Przygotuj 2% podkładki agarowe (w H2O) na szkiełku przedmiotowym zgodnie z opisem50.
    1. Przygotuj dwa szkiełka przedmiotowe z naklejonymi taśmami etykietami na całej ich długości, które będą służyć jako dystansery. Umieść trzecie szkiełko przedmiotowe pomiędzy nimi.
    2. Rozpuść 2% agarozy w H2O i nanieś jedną kroplę na czyste szkiełko.
    3. Umieść czwarte szkiełko prostopadle do trzech pozostałych szkiełek na kropli agaru. Delikatnie dociśnij je, aby spłaszczyć podkładkę do tej samej grubości co taśma etykietująca.
    4. Pozostaw do wyschnięcia na 1 min przed usunięciem dystanserów i delikatnym rozdzieleniem szkiełek. Podkładka agarowa przylgnie do jednego z nich.
  4. Nanieś pipetą ~10 µl środka anestetycznego (2 mM lewamisolu w buforze M9) na podkładkę i przenieś ~10 osobników za pomocą igły platynowej. Przykryj szkiełkiem nakrywką (~22 x 22 mm) i wykonaj zdjęcia w ciągu 1 h.
  5. Alternatywnie, aby uzyskać filmy z dłuższego okresu czasu lub dodatkowo zminimalizować możliwość ruchu zwierząt, zastosuj kombinację anestetyka i unieruchomienia za pomocą kulek51.
    1. Przygotuj 10% podkładki agarowe (w buforze M9) zgodnie z opisem51 i dodaj nicienie do 3 µl roztworu standardów wielkości nanosfer (kule polistyrenowe, 100 nm) oraz 3 µl środka anestetycznego (4 mM lewamisolu w buforze M9). Delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywką. Aby uniknąć wysychania, uszczelnij szkiełko nakrywką VALAPem (mieszaniną równych ilości wazeliny, lanoliny i wosku parafiniowego).
  6. Wykonaj obrazowanie unieruchomionych nicieni za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Wyniki uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu dyskowego (Spinning Disc AF) wyposażonego w kamerę EM-CCD oraz oprogramowanie do automatyzacji mikroskopii i analizy obrazu, takie jak MetaMorph; poniżej opisano szczegóły, jednak można również użyć innych porównywalnych systemów obrazowania konfokalnego.
    1. Użyj obiektywu olejowego 63X lub 100X/1.4NA i umieść szkiełko przedmiotowe z nicieniami w uchwycie na szkiełko.
    2. Uruchom oprogramowanie. Dostosuj moc lasera i filtry do obrazowania mRFP. Użyj lasera 561 nm przy mocy 10% i filtra emisyjnego >600 nm.
    3. Otwórz funkcję „MultiDimensional Acquisition”. W zakładce „Main” zaznacz pola „Timelapse” i „Run Journals” (Hardware Auto Focus: wyłączony).
    4. W zakładce „Saving” wybierz lub utwórz folder katalogu, w którym mają zostać zapisane pliki. Przypisz nazwę do pliku.
    5. W zakładce „Wave Length” wybierz odpowiednie oświetlenie i dostosuj czas ekspozycji oraz wzmocnienie (gain). Użyj ustawienia „YokoQuad Red” (lub równoważnego ustawienia oświetlenia dla obrazowania mRFP) z czasem ekspozycji od 100 do 300 msec i wzmocnieniem kamery od 100 do 300, w zależności od poszczególnych próbek (oceniając na podstawie obrazu na żywo).
    6. W zakładce „Timelapse” wybierz „Number of time points” = 301, „Duration” = 5 min oraz „Time/Interval” = 1 sec.
    7. W zakładce „Journals” wybierz Journal: „AFC SET Z HOLD” i „AFC Return to Z HOLD”, Type: „Special” (dwukrotnie), Initial Point: „Start of time point” oraz „End of time point”. Ta opcja autofokusa jest istotna dla obrazowania tego samego przekroju przez dłuższy czas.
    8. Po zakończeniu konfiguracji naciśnij „Acquire”. Film timelapse zostanie zapisany jako oddzielne pliki TIFF.
    9. Otwórz wszystkie pliki .tiff danej serii czasowej w programie ImageJ. Przejdź do „Image” → „Stacks” → „Images to Stacks”. Opcjonalnie dostosuj jasność i kontrast, dodaj pasek skali itp. Eksportuj film przez „File” → „Save as” → „AVI…” (przykład znajduje się w Video 1 i 2 odpowiadających Rysunkowi 1).

2. Wykorzystanie czujników fałdowania i reporterów stresu do badania autonomicznych komórkowych i nieautonomicznych komórkowych wpływów na proteostazę i toksyczność

  1. Wytworzyć linie transgeniczne współwyrażające sensor fałdowania lub reporter stresu wraz z białkiem prionopodobnym. Metody przeprowadzania krzyżówek lub wytwarzania linii transgenicznych opisano w źródłach48,49,52. Listę szczepów C. elegans, które można wykorzystać, przedstawiono w Tabeli 1.
  2. Przygotować zsynchronizowane populacje zwierząt transgenicznych i hodować je do pożądanego wieku zgodnie z powyższym opisem (sekcja 1.2)50.
  3. Za pomocą stereomikroskopu zbadać odpowiedni fenotyp sensora fałdowania lub reportera stresu.
    1. W przypadku sensora fałdowania określić liczbę zwierząt z agregatami w każdym dniu po synchronizacji (przykład przedstawiono na Ryc. 2E i F).
    2. W przypadku reportera stresu sprawdzić, czy współwyrażanie białka prionopodobnego prowadzi do zwiększenia fluorescencji reportera (przykład przedstawiono na Ryc. 3).

3. Przesiew genomowy w celu zidentyfikowania supresji toksyczności indukowanej prionami u C. elegans

Proces eksperymentu RNAi, etapy inkubacji, nicienie w stadium L1, metoda: przesiewanie genów, schemat.
Rysunek 4. Schematyczna reprezentacja protokołu przesiewowego RNAi. Szczegółowy opis poszczególnych kroków znajduje się w sekcji 3 protokołu.

  1. Synchronizacja nicieni C. elegans i powielenie biblioteki RNAi
    1. Do przesiewu RNAi należy użyć biblioteki RNAi Ahringera (lub biblioteki RNAi Vidala)53,54. Przenieść bibliotekę RNAi z oryginalnego formatu 384-dołkowego do płytek 96-dołkowych, wypełniając płytki 100 µl pożywki LB-amp (50 μg/ml ampicyliny w LB) uzupełnionej o 10% glicerolu, a następnie zaszczepić je za pomocą replikatora 96-pinowego. Hodować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem i przechowywać w -80 °C.
    2. Utrzymywać linie WT oraz linie transgeniczne C. elegans w temperaturze 20 °C na płytkach NGM z wysianymi bakteriami E. coli OP50 zgodnie ze standardowymi metodami47.
    3. Zsynchronizować nicienie transgeniczne z domeną prionową oraz nicienie WT (kontrolne) poprzez wybielanie (patrz sekcja 1.2).
    4. W tym samym dniu, w którym przeprowadzane jest wybielanie nicieni, przygotować pożywkę LB uzupełnioną o 50 μg/ml ampicyliny. Używając automatycznego dozownika odczynników, rozdzielić (lub pipetować ręcznie) 65 μl pożywki LB-amp do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
    5. Wyjąć płytki z 96-dołkową biblioteką RNAi Ahringera z -80 °C i przenieść je do sterylnego dygestorium wyłożonego ręcznikami papierowymi. Natychmiast usunąć taśmę uszczelniającą, trzymając płytkę dnem do góry, gdy płytki są jeszcze zamrożone, uważając, aby uniknąć kontaminacji lodem z zewnętrznej strony płytek. Odwrócić płytki i pozostawić do rozmrożenia przez około 30 min.
    6. Zanurzyć sterylny replikator 96-pinowy w jednej płytce biblioteki RNAi, a następnie w jednej świeżej płytce z LB-amp. Do każdej płytki należy używać świeżego, sterylnego replikatora. Wszystkie płytki uszczelnić folią klejącą i zwrócić płytki biblioteki do -80 °C. Replikatory można moczyć w wybielaczu, płukać i autoklawować w celu ponownego użycia.
    7. Pozostawić powielone płytki RNAi do wzrostu przez noc w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 300 rpm. Aby użyć bakterii E. coli HT115 zawierających pusty wektor (L4440) jako kontrolę, hodować je oddzielnie w probówce, a następnie pipetować 65 μl hodowli za pomocą pipety wielokanałowej do jednej czwartej dwóch płytek 96-dołkowych.
  2. Indukcja produkcji bakteryjnego dsRNA i dodanie nicieni
    1. Rozcieńczyć izopropyl-β-D-thiogalaktopiranozyd (IPTG) do stężenia 5 mM w ddH2O. Używając automatycznej stacji roboczej z głowicą wielokanałową, rozdzielić (lub pipetować ręcznie) 10 μl rozcieńczonego IPTG do każdego dołka z bakteriami RNAi oraz do płytek kontrolnych. Ponownie uszczelnić i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Inkubować przy wytrząsaniu przez 3 h w 37 °C.
    2. Podczas wytrząsania bakterii, przygotować nicienie. Dokładnie wymieszać zawiesinę M9/nicienie i pipetować małą próbkę (~5 - 10 µl) na szklane szkiełko mikroskopowe. Policzyć liczbę nicieni pod stereomikroskopem i obliczyć liczbę nicieni na 1 μl.
    3. Stosując technikę sterylną, przygotować roztwór uzupełnionego M9 (M9+) o następujących stężeniach końcowych: 0,20 mg/ml IPTG, 8,0 μg/ml cholesterolu, 50 μg/ml ampicyliny, 9,6 μg/ml tetracykliny, 0,0835 μg/ml Fungizone oraz 15 nicieni na 50 μl.
      1. Przygotować oddzielne roztwory dla nicieni transgenicznych z domeną prionową oraz nicieni WT. Końcowa objętość roztworu nicieni w M9+ będzie zależeć od liczby powielonych płytek RNAi (patrz poniżej), plus około 30 ml objętości martwej, która pozostanie w zbiorniku, jeśli używany jest automatyczny dozownik.
    4. Po 3-godzinnej indukcji produkcji bakteryjnego dsRNA wyjąć płytki z inkubatora i pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej (RT, ~30 min), aby uniknąć szoku termicznego zwierząt.
    5. Rozdzielić 50 μl roztworu transgenicznych nicieni z domeną prionową w M9+ do każdego dołka płytek RNAi oraz do jednej z kontrolnych płytek z pustym wektorem. Należy mieszać roztwór nicieni przed każdym krokiem, ponieważ zwierzęta mają tendencję do sedymentacji na dno zbiornika.
    6. Rozdzielić nicienie WT do drugiej płytki kontrolnej. Pozostawić płytki nieuszczelnione, aby umożliwić napowietrzanie. Aby zapobiec odparowaniu hodowli ciekłej, ułożyć 4-5 płytek jedna na drugiej i owinąć wilgotnym ręcznikiem papierowym oraz folią aluminiową. Inkubować przy 200 rpm w 20 °C przez 4 dni.
  3. Ocena
    UWAGA: Po 4 dniach w inkubatorze nicienie będą w drugim dniu dorosłości i będą gotowe do przesiewu. Przed rozpoczęciem analizy pozwolić zwierzętom przystosować się do warunków bez wytrząsania przez 30 min, aby zapewnić niezakłócone ruchy typu thrashing.
    1. Używając kamery Falcon 4M60 podłączonej do komputera z monitorem, przeprowadzić wizualny przesiew w kierunku zwiększonej intensywności ruchów thrashing w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami transgenicznymi z domeną prionową.
    2. Sporządzić listę wstępnych wyników pozytywnych w celu potwierdzenia ich za pomocą wrMTrck (patrz następna sekcja).

4. Potwierdzenie wyników wstępnego przesiewu

  1. Analiza motylości na płytkach stałych
    1. Przygotować płytki z NGM uzupełnionym o 100 µg/ml ampicyliny, 12,5 µg/ml tetracykliny oraz 1 mM IPTG, zgodnie ze standardowymi metodami47. Jeśli to możliwe, należy użyć maszyny do wylewania płytek, aby zapewnić taką samą wysokość podłoża na wszystkich płytkach, co pozwoli na usprawnienie procesu akwizycji wideo.
    2. Wyhodować poszczególne klony RNAi w ~1 ml LB + 50 µg/ml ampicyliny, przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C przy 250 rpm.
    3. Następnego dnia indukowany ekspresję dsRNA za pomocą 1 mM IPTG przez 3 h. Zasiać płytki 150 µl każdego bakteryjnego klonu RNAi, rozprowadzając je cienką warstwą. Pozostawić bakterie do wyschnięcia przez 2 dni w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności. Przygotować 3 płytki na każdy klon RNAi.
    4. Zsynchronizować populację nicieni metodą wybielania (bleaching) zgodnie ze standardowymi metodami50 (patrz sekcja 1.2) i pozwolić jajom wykluć się przez noc w medium M9.
    5. Pobrać próbkę zawiesiny nicieni i oznaczyć liczbę nematod na 1 µl pod stereomikroskopem. Następnie pipetować odpowiednią objętość M9 z nicieniami na każdą płytkę eksperymentalną tak, aby zawierała 25 - 30 nicieni w stadium L1. Hodować nematody w temperaturze 20 °C przez 4 dni, aż nicienie osiągną 2. dzień dorosłości.
  2. Ilościowa analiza motylości nicieni za pomocą wtyczki wrMTrck dla programu ImageJ
    UWAGA: Filmy zostały zarejestrowane przy użyciu stereomikroskopu z powiększeniem 10X, cyfrowej kamery Hamamatsu Orca-R2 C10600-10B oraz oprogramowania obrazującego Hamamatsu Simple PCI.
    1. Włączyć kamerę i oprogramowanie obrazujące Simple PCI. Kliknąć „Live”, aby umożliwić dostrojenie warunków obrazowania.
    2. Ustawić parametry wideo w następujący sposób: Gain = 0; Light Mode = High; Speed Index = 1; Binning = 2. Kliknąć „Auto Expose”, a następnie dostosować warunki oświetlenia, przesuwając lustra mikroskopu oraz pokrętła jasności i kontrastu.
      UWAGA: Wideo musi mieć wysoki kontrast bez prześwietleń, tak aby zwierzęta jawiły się jako czarne kształty na jasnym tle.
    3. Kliknąć „Time Scan” i wybrać folder oraz nazwę pliku. Ustawić „Field Delay” na 20 msec oraz „Stop at Time” na 30 sec. Nacisnąć „Live Review”, aby wybrać obszar płytki do nagrania (tam, gdzie znajduje się najwięcej nicieni). Stukać w płytkę 3 lub 4 razy na stoliku, szybko potwierdzić jej pozycję w polu widzenia i nacisnąć „Start”.
    4. Po zakończeniu nagrywania filmu kliknąć prawym przyciskiem myszy na obraz i wybrać „Export Montage Sequence”, aby wyeksportować film z formatu .cxd do .avi.
  3. Analiza filmów z motylością
    1. Otworzyć oprogramowanie ImageJ, przejść do karty „Plugins”, następnie „wrmtrck” i wybrać „wrMTrck Batch”. Wybrać katalog zawierający wszystkie pliki do analizy.
    2. W głównym oknie wejściowym wrMTrck_Batch wprowadzić wartości zgodnie ze szczegółami na Rysunku 5C. Wyjaśnienie każdego z parametrów znajduje się w instrukcjach dołączonych do wtyczki. Kliknąć „OK” i uruchomić analizę ruchu.
    3. Aby zweryfikować wyniki i potwierdzić, że wszystkie wykryte ścieżki pochodzą od rzeczywistych osobników C. elegans oraz usunąć artefakty, należy otworzyć każdy z plików .txt utworzonych dla każdego filmu i skopiować informacje do pliku oprogramowania do analizy danych. Otworzyć utworzone pliki „*_labels.zip” i uruchomić wynikowe pliki „*_labels.tif”, aby ręcznie sprawdzić i usunąć błędne ścieżki nicieni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie międzykomórkowego rozprzestrzeniania się białek prionopodobnych za pomocą in vivo obrazowanie poklatkowe

Linie transgeniczne C. elegans wykazujące ekspresję domeny prionowej są szczególnie odpowiednie do analizy niektórych aspektów białek prionopodobnych, np. transmisji międzykomórkowej i toksyczności nieautonomicznej komórkowo. Przezroczystość tych organizmów umożliwia śledzenie białek znakowanych fluo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody pomagają zilustrować rozprzestrzenianie się oraz złożoną, autonomiczną i nieautonomiczną toksyczność komórkową białek prionopodobnych. Niedawno odkryliśmy, że podatna na agregację cytozolowa domena prionowa jest pobierana do pęcherzyków związanych z błoną w procesie związanym z autofagią. Specyficzny podzbiór tych pęcherzyków transportuje domenę prionową w obrębie i między komórkami i tkankami40. Kluczem do monitorowania ich ruchu u żywego zwierzęcia jest to, że białko musi być oznaczone m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Cindy Voisine i Yoko Shibata za pomocną dyskusję i krytyczne komentarze na temat rękopisu. Dziękujemy za udzieloną pomoc: Laboratorium Analiz Wysokoprzepustowych (HTAL) oraz Zakładowi Obrazowania Biologicznego (BIF) na Uniwersytecie Northwestern. Praca ta została sfinansowana z grantów z National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), Ellison Medical Foundation oraz Fundacji Daniela F. i Ady L. Rice (dla R.I.M.). C.I.N.-K. została wsparta przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
Wzorce wielkości nanosfery 100 nmThermoScientific3100A
LevamisoleSigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
Biblioteka Ahringer RNAiŹródło: BioSciences http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/produkty-klonowe/niessaki/c-elegans/biblioteka-elegans-rnai/
Sprzęt
Wirówka z chłodzeniem Sorvall Legend XTR, 120VACThermoScientific75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96-pinowy replikator Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
Wytrząsarka inkubacyjna HiGro o dużej pojemności Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Zautomatyzowana stacja robocza Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Wytrząsarka Beckman Coulterhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44Nowy Brunszwikhttp://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04& action=produkty& contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDygwarny aparat CCDHamamatsuhttp://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Mikroskop konfokalny Spinning Disc AF Aparat Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 Teledyne Dalsa http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Oprogramowanie
MetaMorph Microscopy Automation & Oprogramowanie do analizy obrazumolekularne
Hamamatsu Oprogramowanie do analizy obrazu SimplePCIMeyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJWtyczka NIHhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck dla ImageJhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans szczepy
N2 (WT)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]Morimotodostępne w naszym laboratorium 
W tabeli 1 przedstawiono źródło naprężeń czujnika składanego i reportera
Dozownik odczynników Urządzenia http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.htmlLaboratorium naprężeń

Bibliografia

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351(2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294(2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419(2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568(2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840(2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399(2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model C elegansmikroskopia fluorescencyjna time lapsegenomowy screening RNAianaliza programem Worm Trackertoksyczno autonomiczna kom rkowoefekty nieautonomiczne kom rkowomonitorowanie transportu p cherzykowegotest motoryki thrashingodpowied na stres oksydacyjny

Powiązane artykuły