Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Summary

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Abstract

Potencjał powierzchniowy jest często pomijaną cechą fizyczną, która odgrywa dominującą rolę w przyleganiu mikroorganizmów do powierzchni podłoża. Mikroskopia siły sondy Kelvina (KPFM) to moduł mikroskopii sił atomowych (AFM), który mierzy różnicę potencjałów kontaktowych między powierzchniami w nanoskali. Połączenie KPFM z AFM pozwala na jednoczesne generowanie potencjału powierzchniowego i map topograficznych próbek biologicznych, takich jak komórki bakteryjne. W tym przypadku wykorzystujemy KPFM do zbadania wpływu potencjału powierzchniowego na adhezję mikrobiologiczną do powierzchni istotnych z medycznego punktu widzenia, takich jak stal nierdzewna i złoto. Mapy potencjału powierzchniowego ujawniły różnice w potencjale powierzchniowym membran mikrobiologicznych na różnych podłożach materiałowych. Wygenerowano wykres wysokości kroku, aby pokazać różnicę w potencjale powierzchniowym w obszarze granicznym między powierzchnią podłoża a mikroorganizmami. Zmiany potencjału powierzchniowego błony komórkowej zostały powiązane ze zmianami w metabolizmie i ruchliwości komórek. Dlatego KPFM stanowi potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania zmian potencjału powierzchni błony mikrobiologicznej po przyczepieniu do różnych powierzchni podłoża. W tym badaniu demonstrujemy procedurę charakteryzowania potencjału powierzchniowego poszczególnych komórek Staphylococcus aureus USA100 opornych na metycylinę na stali nierdzewnej i złocie przy użyciu KPFM.

Introduction

Biofilmy wytwarzane na powierzchniach sprzętu i w ranach skórnych stanowią problem dla przemysłu medycznego, ponieważ biofilmy są oporne na usuwanie i mogą prowadzić do zwiększonego tempa przenoszenia chorób i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przyczepienie jest pierwszym krokiem w tworzeniu biofilmu i jest najbardziej krytycznym krokiem ze względu na jego odwracalność^1-3. Charakterystyka powierzchni podłoża odgrywa kluczową rolę w przyczepianiu się drobnoustrojów. Wykazano, że czynniki takie jak twardość powierzchni, porowatość, chropowatość i hydrofobowość wpływają na przyczepianie się drobnoustrojów; jednak przeprowadzono niewiele badań oceniaj....

Protocol

1. Przygotowanie wyrobów szklanych i kultur

1. Przed przystąpieniem do tego eksperymentu przygotuj 5% płytki z agarem z krwią owczą (SBA) do uprawy MRSA. Inkubować płytki SBA przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Po tym czasie powinny być obecne pojedyncze, dobrze odizolowane kolonie, które można wykorzystać do kolejnych inokulacji w płynnych pożywkach. Płytki SBA z pojedynczymi koloniami należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 - 2 miesiące.
   UWAGA: Płytki agarowe z krwią owczą są dostarczane w gotowych opakowaniach zawierających od 20 do 25 płytek w zależności od producenta i zazwyczaj składają się z tryptycznej bazy agaru sojowego z dodatkiem....

Results

Możliwość pomiaru SP za pomocą KPFM opiera się na zasadzie, że zarówno powierzchnia próbki, jak i końcówka wspornika są do pewnego stopnia przewodzące. Stal nierdzewna i złoto działały jak powierzchnie przewodzące, do których przyczepiono MRSA. Wykonano obrazy KPFM 15 komórek MRSA na obu powierzchniach o rozdzielczości 512 x 512 i obszarach skanowania od 5 x 5 μm do 10 x 10 μm. Skanowanie odbywało się z prędkością linii w zakresie od 0,02 linii/s do 0,05 linii/sek. W związku z tym, przy 512 punktach danych zebranych na l.......

Discussion

KPFM został wykorzystany jako nowatorska technika uzyskiwania danych elektrycznych powierzchni. Jest powszechnie stosowana jako metoda badania rozkładu ładunków w chemii i dopiero niedawno zaczęła być stosowana do badania układów biologicznych w skali mikro i nano. Na podstawie zebranych danych stwierdziliśmy, że drobnoustroje nie wydają się łatwo przyczepiać do czystych powierzchni ze stali nierdzewnej i złota, nawet po 3 godzinach inkubacji statycznej. Powierzchnie funkcjonalizowane poli-L-lizyną wykazywały szybkie prz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop sił atomowych 5500ILM	Agilent Technologies	#N9435S
Metalowe dyski do próbek AFM/STM	TED PELLA, INC.	#16219	Tarcze do pobierania próbek ze stali nierdzewnej
DPE (Low-Noise) Przewodzące sondy SPM	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	W każdym chipie znajdują się 4 wsporniki pokryte Pt. Do eksperymentów wykorzystaliśmy wspornik B.
Metalowe dyski do próbek AFM/STM pokryte złotem PELCO	TED PELLA, INC.	#16218-G	Złote dyski z próbkami
Oprogramowanie PicoView	Agilent Technologies	#N9797B	Oprogramowanie do obrazowania mikroskopu sił atomowych 5500ILM
Oprogramowanie do obrazowania obrazu Pico (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Mikroskop sił atomowych oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Scilogex D3024 Mikrowirówka o dużej prędkości	Thomas Scientific	#91201513	Wirówka stosowana na etapach mycia komórek w celu oddzielenia komórek (osadów) od podłoża
Tryptykaza Agar sojowy z 5% krwią owczą	BD	#221261	Gotowe talerze
Tryptyczny bulion sojowy	BD	#257107	Występuje w postaci suchego proszku. Instrukcja, jak zrobić na pojemniku.