Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Streszczenie

Potencjał powierzchniowy jest często pomijaną cechą fizyczną, która odgrywa dominującą rolę w przyleganiu mikroorganizmów do powierzchni podłoża. Mikroskopia siły sondy Kelvina (KPFM) to moduł mikroskopii sił atomowych (AFM), który mierzy różnicę potencjałów kontaktowych między powierzchniami w nanoskali. Połączenie KPFM z AFM pozwala na jednoczesne generowanie potencjału powierzchniowego i map topograficznych próbek biologicznych, takich jak komórki bakteryjne. W tym przypadku wykorzystujemy KPFM do zbadania wpływu potencjału powierzchniowego na adhezję mikrobiologiczną do powierzchni istotnych z medycznego punktu widzenia, takich jak stal nierdzewna i złoto. Mapy potencjału powierzchniowego ujawniły różnice w potencjale powierzchniowym membran mikrobiologicznych na różnych podłożach materiałowych. Wygenerowano wykres wysokości kroku, aby pokazać różnicę w potencjale powierzchniowym w obszarze granicznym między powierzchnią podłoża a mikroorganizmami. Zmiany potencjału powierzchniowego błony komórkowej zostały powiązane ze zmianami w metabolizmie i ruchliwości komórek. Dlatego KPFM stanowi potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania zmian potencjału powierzchni błony mikrobiologicznej po przyczepieniu do różnych powierzchni podłoża. W tym badaniu demonstrujemy procedurę charakteryzowania potencjału powierzchniowego poszczególnych komórek Staphylococcus aureus USA100 opornych na metycylinę na stali nierdzewnej i złocie przy użyciu KPFM.

Wprowadzenie

Biofilmy wytwarzane na powierzchniach sprzętu i w ranach skórnych stanowią problem dla przemysłu medycznego, ponieważ biofilmy są oporne na usuwanie i mogą prowadzić do zwiększonego tempa przenoszenia chorób i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przyczepienie jest pierwszym krokiem w tworzeniu biofilmu i jest najbardziej krytycznym krokiem ze względu na jego odwracalność^1-3. Charakterystyka powierzchni podłoża odgrywa kluczową rolę w przyczepianiu się drobnoustrojów. Wykazano, że czynniki takie jak twardość powierzchni, porowatość, chropowatość i hydrofobowość wpływają na przyczepianie się drobnoustrojów; jednak przeprowadzono niewiele badań oceniających rolę potencjału powierzchniowego podłoża (SP) na adhezję mikrobiologiczną^4,5. Ujemnie naładowane powierzchnie zapobiegają przyczepianiu się zarodników Bacillus thuringiensis do miki, krzemu i złota⁶. Zmiany potencjału błony komórkowej wskazują na zmiany w przyczepieniu i ruchliwości komórek^5,7. Zaobserwowano, że powierzchnie jednorodne elektrycznie łatwiej sprzyjają adhezji mikrobiologicznej⁵. Scharakteryzowanie potencjału powierzchniowego bakterii w nanoskali może zapewnić nowy sposób zrozumienia kinetyki adhezji bakterii do różnych powierzchni, a tym samym może pomóc w opracowaniu strategii przeciwdziałania biofoulingowi. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do charakteryzowania elektrokinetyki bakterii, takich jak elektroforetyczne rozpraszanie światła, potencjał zeta i wyznaczanie punktów izoelektrycznych, mikroskopia sił sondy Kelvina (KPFM) pozwala na badanie pojedynczych komórek, a nie całych kultur^8-11. Jest to korzystne, gdy chce się porównać charakterystyki elektryczne komórka-komórka lub biofilm z dużą dokładnością i precyzją.

KPFM jest modułem mikroskopii sił atomowych (AFM). AFM został opracowany bezpośrednio w wyniku zastosowania skaningowego mikroskopu tunelowego (STM)¹². Pierwsze opublikowane zdjęcia za pomocą STM zostały wykonane przez Gerda Binniga i Heinricha Rorhrera w 1982^roku12. Ich wynalazek był w stanie rozdzielić struktury atomowe poprzez skanowanie rastrowe ostrej końcówki przewodzącej nad przewodzącą powierzchnią w powietrzu. Implikacje uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości podekscytowały biologów, którzy szybko podjęli próbę wykorzystania STM do obrazowania wysuszonych próbek DNA, białek i^wirusów12. STM można również wykonać w cieczach za pomocą specjalistycznych końcówek sondy¹³. Zostało to wykazane przez Lindsay i wsp., którzy użyli STM i AFM do obrazowania cząsteczek DNA w 10 mM HClO₄ i w wodzie, na złotych elektrodach¹³. KPFM wykazano w określaniu potencjałów powierzchniowych analizy DNA i białek²⁵ oraz interakcji biomolekuł z ligandami²⁶.

KPFM działa poprzez pomiar różnicy potencjałów stykowych (CPD) między przewodzącą końcówką wspornikową AFM a idealnie przewodzącą próbką (Rysunek 1, i)^14,15. Próbki niekoniecznie muszą być przewodzące (tj. próbki biologiczne). Obrazowanie można przeprowadzić na powierzchniach mikowych, szklanych i silikonowych (nieprzewodzących), o ile powierzchnia nieprzewodząca jest cienka i znajduje się pod nią materiał przewodzący^6,7. CPD jest równoważne napięciu potencjału powierzchniowego i można je opisać jako różnicę funkcji pracy między końcówką (_końcówką φ) a próbką (φ_próbką), podzieloną przez ujemny ładunek elektronów (-e). Gdy przewodząca końcówka AFM zbliży się do powierzchni próbki (oddzielonej odległością d), generowana jest siła elektrostatyczna (F_es) wynikająca z różnicy energii Fermiego (rysunek 1, ii, a)¹⁵. W tym momencie energie próżni końcówki i próbki (_Ev) są w równowadze i wyrównane. Po zbliżeniu końcówki do powierzchni próbki, końcówka i powierzchnia próbki stykają się elektrycznie i działają jak równoległe kondensatory płytkowe (rysunek 1, ii, b)^14,15. W tym punkcie energie Fermiego końcówki i powierzchni próbki wyrównują się, osiągając równowagę w stanie ustalonym (rys. 1, ii, b). Końcówka i powierzchnia próbki zostaną naładowane, a z powodu różnicy w _{Ev, v} i funkcjach roboczych utworzy się V_CPD. A F_es działa na obszar styku elektrycznego ze względu na utworzony V_CPD. Siła ta jest następnie niwelowana poprzez przyłożenie zewnętrznego V_DC do końcówki, która ma taką samą wielkość jak utworzona V_CPD (rysunek 1, ii, c). To przyłożone napięcie prądu stałego eliminuje ładunek powierzchniowy w obszarze kontaktu elektrycznego, a ilość V_DC niezbędna do wyeliminowania F_es V_CPD jest równa różnicy w funkcjach roboczych między powierzchnią próbki a końcówką¹⁵. Należy zauważyć, że funkcja pracy końcówki jest znana i jest dostarczana przez producentów. We wszystkich metodach KPFM do końcówki przykładane jest również napięcie prądu przemiennego (V_AC, około 100 - 500 mV) w celu wytworzenia oscylujących sił elektrycznych między końcówką a próbką¹⁴. Zapewnia to lepszą rozdzielczość podczas pomiaru zmian w V_{, CPD} i/lub F_es. W związku z tym zmiany częstotliwości lub amplitudy oscylacji elektrycznych mogą być korygowane przez V_DC i można generować mapy potencjału powierzchniowego. Dane z określonych obszarów tych map mogą być dalej analizowane w celu dostarczenia informacji elektrycznych o określonych obiektach topograficznych.

KPFM może być obsługiwany w trzech trybach: (1) tryb podnoszenia, (2) tryb modulacji amplitudy (AM) i (3) tryb modulacji częstotliwości (FM)^14,16. Tryb Lift był początkowym wcieleniem KPFM. Tryb podnoszenia opiera się na metodzie dwuprzebiegowej, w której oscylowana końcówka jest przeciągana po powierzchni w celu uzyskania obrazu topograficznego. W drugim przejściu końcówka jest unoszona o ustaloną odległość nad próbką (10 - 100 nm) i skanowana z powrotem w tym samym obszarze. Ze względu na tę dwuprzebiegową metodę tryb lift, w porównaniu do AM i FM-KPFM, zajmuje najwięcej czasu na akwizycję obrazu. Odsunięcie końcówki od powierzchni zapewnia, że mierzone są tylko wartości dalekiego zasięgu. Ponadto przesłuch między topografią a pomiarami potencjału powierzchniowego jest rozprzężony kosztem zwiększonej rozdzielczości bocznej i czułości.

AM-KPFM poprawia rozdzielczość poprzeczną i czułość, wykorzystując podwójne częstotliwości do jednoczesnego pomiaru topografii próbki i potencjału powierzchni (skanowanie jednoprzebiegowe)¹⁴. W trybie AM wspornik jest oscylowany mechanicznie, zwykle 5% poniżej swojej pierwszej częstotliwości rezonansowej (f₀) i oscylowany elektrycznie (przez V_AC) przy drugiej częstotliwości rezonansowej (f₁). Zmiany amplitudy f₀ prowadzą do generowania danych topograficznych, podczas gdy zmiany amplitudy f₁, spowodowane zmianami F_es i V_CPD, dają dane pomiarowe potencjału powierzchniowego. F₀ i f₁ wspornika są oddzielone znacznymi częstotliwościami i energiami, które sygnalizują, że przesłuchy są zminimalizowane¹⁴. Skrzynka elektroniki głowicy (HEB) AFM oddziela te dwa sygnały, aby jednocześnie dostarczyć zarówno dane topograficzne, jak i dane o potencjale powierzchniowym w jednym skanie. FM-KPFM zwiększa rozdzielczość jeszcze bardziej niż AM-KPFM na powierzchniach biologicznych¹⁴. FM-KPFM działa inaczej niż AM-KPFM, ponieważ mierzy zmiany gradientów siły elektrostatycznej, a nie siły elektrostatycznej (F_es)¹⁵. Podobnie jak tryb AM, tryb FM wykorzystuje podwójne częstotliwości i jednoprzebiegowy mechanizm skanowania w celu jednoczesnego uzyskania danych topograficznych i potencjału powierzchniowego¹⁴. W trybie FM wspornik jest oscylowany mechanicznie przy f₀ i oscylowany elektrycznie przy niskiej zmodyfikowanej częstotliwości (f_mod, zwykle 1 - 5 kHz). Po oddziaływaniach elektrostatycznych f₀ i f_mod mieszają się, tworząc pasma boczne f₀ ± f_mod. Te wstęgi boczne są bardzo wrażliwe na zmiany siły elektrostatycznej i można je oddzielić od f₀ za pomocą HEB AFM. Ponieważ FM-KPFM mierzy zmiany gradientów sił elektrostatycznych, kształt wierzchołka końcówki i jego konserwacja/integralność odgrywają kluczową rolę w ogólnej rozdzielczości potencjału powierzchni^{14, 15}. Rozdzielczość potencjału powierzchniowego w trybach AM i FM mieści się w zakresie 1 nm bocznie^14-16. Należy zauważyć, że obrazowanie KPFM można wykonać w cieczach niepolarnych, a ostatnio wykazano, że wykonuje się je w cieczach polarnych o niskiej jonowości (<10 mM) (w trybach KPFM w pętli otwartej, które nie wymagają sprzężenia zwrotnego polaryzacji, co eliminuje zastosowanie polaryzacji prądu stałego), takich jak woda MilliQ; jednak obrazowanie KPFM nie zostało jeszcze wykonane na żywych komórkach w roztworach polarnych^17-20. Dodatkowym wyzwaniem związanym z obrazowaniem SP w cieczy jest to, że roztwory powszechnie stosowane do utrzymywania komórek (tj. sól fizjologiczna buforowana fosforanami) mają wysokie stężenia ruchomych jonów, co prowadziłoby do reakcji Farada, dynamiki ładunku wywołanej odchyleniem oraz dyfuzji/redystrybucji jonów²⁰. Tak więc w tym eksperymencie pomiary wykonano z wysuszonych i martwych komórek MRSA na powierzchniach ze stali nierdzewnej i złota funkcjonalizowanych poli-L-lizyną w warunkach otoczenia. Obrazowanie można przeprowadzić w warunkach powietrza lub próżni na próbkach biologicznych, które zostały wcześniej wysuszone lub unieruchomione na powierzchniach²⁰. Wykazano również, że warunki wilgotne wpływają na obrazowanie powierzchni z użyciem KPFM⁶.

W tym badaniu użyliśmy FM-KPFM i AFM do zbadania roli SP w przyczepianiu opornego na metycylinę Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) do funkcjonalizowanej poli-L-lizyną powierzchni ze stali nierdzewnej i złota. MRSA zyskał ostatnio status "superbakterii" wielolekoopornej (MDR) ze względu na naturalnie wyselekcjonowaną oporność na wiele antybiotyków β-laktamowych i cefalosporyn²¹. Zakażenia MRSA są obecnie trudniejsze, trudniejsze i groźniejsze do leczenia, co prowadzi do stosowania ostrzejszych środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak wankomycyna lub oksazolidynony, które mają wyższy poziom toksyczności u ludzi, a zatem nie mogą być stosowane jako leczenie długoterminowe²². Stal nierdzewna została wybrana ze względu na jej znaczenie medyczne i powszechne zastosowanie jako materiał w igłach podskórnych, basenach, klamkach, zlewach itp. Złoto było używane jako metal porównawczy. FM-KPFM wykorzystano do zbadania, czy SP błony mikrobiologicznej zmienia się po przyczepieniu do substratów.

Protokół

1. Przygotowanie wyrobów szklanych i kultur

1. Przed przystąpieniem do tego eksperymentu przygotuj 5% płytki z agarem z krwią owczą (SBA) do uprawy MRSA. Inkubować płytki SBA przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Po tym czasie powinny być obecne pojedyncze, dobrze odizolowane kolonie, które można wykorzystać do kolejnych inokulacji w płynnych pożywkach. Płytki SBA z pojedynczymi koloniami należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 - 2 miesiące.
   UWAGA: Płytki agarowe z krwią owczą są dostarczane w gotowych opakowaniach zawierających od 20 do 25 płytek w zależności od producenta i zazwyczaj składają się z tryptycznej bazy agaru sojowego z dodatkiem 5% w/v krwi owczej.
2. Przygotuj 500 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) uzupełnionego 1% glukozy i 0,1% NaCl. Następnie zbierz i wyczyść 2 szklane probówki. Jeśli pokrywki do sterylizacji w autoklawie nie są dostępne dla probówek, użyj folii aluminiowej jako nakrętki. Autoklaw TSB i probówki wraz z pudełkiem końcówek do pipet o pojemności 1 ml.
3. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego lub w pobliżu palnika Bunsena odpipetować 5 ml wcześniej autoklawizowanego TSB do autoklawowanych probówek. Należy uważać, aby upewnić się, że dano wystarczająco dużo czasu, aby TSB i probówki ostygły do temperatury pokojowej. Z wcześniej prążkowanej 5% płytki SBA zaszczepij pojedynczą kolonię w 6 ml bulionu TSB. Jedna będzie zawierała MRSA, a druga probówka będzie używana jako kontrola ujemna w celu zapewnienia sterylności.
4. Pobrać zaszczepione probówki TSB i umieścić je w inkubatorze tłokowym na 24 godziny w temperaturze 37 °C i przy 200 obr./min. Po tym czasie wzrost drobnoustrojów powinien być widoczny w probówce MRSA, podczas gdy w probówce kontrolnej nie powinien być żaden wzrost.
5. Pobrać 1 ml z 24-godzinnej hodowli i odpipetować do 6 ml świeżego TSB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin przy 200 obr./min.
6. Odpipetować 1 ml 6-godzinnej subkultury do 1,5 ml probówki do mikrofuge. Wirować przez 3 minuty przy 850 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml dejonizowanego_H2O. Odwirować, powtórzyć i ponownie zawiesić.

2. Czyszczenie i zaszczepianie podłoży ze stali nierdzewnej i złota

1. Pobrać krążki z próbkami AFM ze stali nierdzewnej i złota (odpowiednio o średnicy 20 mm i 10 mm) i oczyścić każdą stronę 5 ml dejonizowanego_H2O. Trzymać krążki z próbkami w ręce dominującej za pomocą kleszczy i używać ręki subdominującej do pipetowania 5 ml z każdej strony krążka próbki. Po umyciu obu stron umieścić krążki z próbkami w zlewce zawierającej 20 ml dejonizowanego_H2O, a następnie przeprowadzić sonikację na 1 minutę.
2. Po sonikacji użyj kleszczyków, aby usunąć krążki z próbką ze zlewki. Umieść krążki tak, aby opierały się pod kątem 60° o krawędź otwartej płytki Petriego na ręczniku papierowym. Użyj pokrywki płytki Petriego, aby przykryć krążki suszące. Poczekaj, aż dyski całkowicie wyschną przed kontynuowaniem. Czas schnięcia może wynosić od 4 do 8 godzin.
3. Po wyschnięciu użyj kleszczyków, aby umieścić krążki próbek na płytce Petriego.
   1. Opcjonalnie funkcjonalizować powierzchnie krążków próbek dowolnym materiałem (np. kolagenem, hialuronanem, nanocząstkami srebra itp.).
   2. W tym eksperymencie użyj poli-L-lizyny do pokrycia powierzchni podłoża. W celu funkcjonalizacji poli-L-lizyny należy pobrać pipetą 200 - 400 μl 0,1% poli-L-lizyny (w H₂O) na krążki z próbką i pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na szalce Petriego.
   3. Po upływie 1 godziny przytrzymać krążek z próbką za pomocą kleszczyków i przemyć 1 ml dejonizowanego_H2O. Pozostaw do wyschnięcia na ręcznikach papierowych zgodnie z opisem w kroku 2.2.
4. Pobrać 2x umyte ponownie zawieszone komórki i płytkę 200 - 400 μl na krążkach z próbkami wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Jeżeli krążki próbki są pokryte poli-L-lizyną, inkubować przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Po inkubacji komórek na krążkach z próbkami, delikatnie przemyć krążki z próbkami 1 ml dejonizowanego_H2O. Pozostaw dyski do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem.

3. Obrazowanie KPFM

UWAGA: Do tego eksperymentu użyj Agilent 5500 series ILM-AFM.

1. Aby uruchomić AFM, włącz jednostkę komputerową wraz z kontrolerem HEB i MAC III AFM. Otwórz oprogramowanie do obrazowania AFM (np. PicoView firmy Agilent). Upewnij się, że początkowo wybrałeś ACAFM lub inne prawidłowe oznaczenie na AFM do obrazowania w trybie przerywanego kontaktu.
2. Używając kleszczyków AFM w dominującej ręce i przytrzymując sprężynowy uchwyt klipsa otwartą ręką subdominującą, umieść wspornik KPFM w głowicy. Należy zachować ostrożność podczas obsługi i przenoszenia głowicy AFM do AFM, ponieważ ta jednostka (przynajmniej w modelu 5500 ILM-AFM) zawiera delikatną jednostkę kryształu piezoelektrycznego, która kontroluje kierunki skanowania X, Y i Z.
   UWAGA: Wsporniki KPFM użyte w tym przypadku były wspornikami przewodzącymi DPE (niskoszumowymi) firmy Mikromasch o średnich częstotliwościach rezonansowych 80 kHz i stałych sprężystości 2,7 N/m. Wsporniki o tych częstotliwościach rezonansowych i stałych sprężystości zostały wybrane ze względu na ich łatwość obsługi. Wsporniki o większych stałych sprężystości i wyższych częstotliwościach rezonansowych mogą być również używane do obrazowania.
3. Ostrożnie załaduj głowicę do AFM i podłącz odpowiednie przewody (w tym przypadku należy podłączyć dwa przewody: światło laserowe i silnik podnośnika stage).
4. Ustaw laser na końcówce wspornika. Niektóre jednostki są wyposażone w funkcję kamery, która pozwala na łatwiejsze wyrównanie. Jeśli funkcja kamery nie jest dostępna w AFM, wyrównaj na końcówce wspornika zgodnie z poniższym opisem:
   1. Obróć pokrętło od przodu do tyłu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przesunąć laser nad chipem wspornikowym. Gdy laser dotrze do chipa, zostanie zablokowany i nie będzie już widoczny. Przekręć pokrętło tylko kilka razy.
   2. Obracaj pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż plamka lasera pojawi się ponownie. Laser znajduje się teraz na krawędzi chipa.
   3. Obróć pokrętło od lewej do prawej, aby ustawić laser na wsporniku. Gdy laser przechodzi przez wspornik, znika i pojawia się ponownie w krótkich odstępach czasu. Plamka lasera powinna być widoczna w osłonie z matowego szkła, w której później znajdzie się jednostka fotodiody.
   4. Przekręć pokrętło od przodu do tyłu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby przesunąć miejsce w dół wspornika w kierunku końcówki, aż miejsce na matowym szkle zniknie.
   5. Przekręć pokrętło od przodu do tyłu tylko nieznacznie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby ustawić laser tak, aby znajdował się na końcówce wspornika. Plamka lasera pojawi się ponownie na matowym szkle.
      UWAGA: Jest to metoda pozycjonowania laserowego wsporników desek do nurkowania. W przypadku trójkątnych wsporników proces wyrównywania różni się nieznacznie.
5. Po wyrównaniu lasera przytrzymaj silnik podnośnika stolika w pozycji "otwartej" przez 10 sekund, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń między wspornikiem a próbką podczas mocowania próbki do AFM.
6. Umieść próbkę na stoliku próbki KPFM. Zmielić próbkę za pomocą drutu miedzianego. Podłącz odpowiednie przewody z AFM do sample stage. Podłącz stolik do AFM. W większości przypadków stolik jest utrzymywany na miejscu za pomocą magnesów.
7. W oprogramowaniu AFM dostrój wspornik, a następnie rozpocznij zbliżanie się końcówki wspornika do próbki. Upewnij się, że czas stabilizacji jest ustawiony na nie więcej niż 10 ms, a prędkości zbliżania się nie przekraczają 2.0 μm/s, aby uniknąć uszkodzenia końcówki.
8. Gdy końcówka wspornika znajdzie się na powierzchni próbki, wybierz rozmiar okna obrazowania i idealny obszar obrazowania. Zoptymalizuj wzmocnienia I i P wraz z nastawą wspornika, aby zoptymalizować obrazowanie topograficzne.
   1. Po zoptymalizowaniu obrazowania topograficznego włącz moduł KPFM (tryb FM lub AM; tutaj użyj trybu FM). Należy zauważyć, że obrazowanie KPFM jest bardzo trudne poza oknem obrazowania 5 μm x 5 μm. Ponadto, aby uzyskać optymalne obrazowanie KPFM, użyj rozdzielczości 512 x 512 z niskimi prędkościami skanowania (0,02 - 0,05 linii/s).
9. W przypadku ustawień FM-KPFM (nie ustawień ACAFM) ustaw procent napędu w zakresie od 5 do 10%. Ustawić częstotliwość wspornikową w zakresie od 1 do 5 kHz przy szerokości pasma 2 kHz. Ustaw wzmocnienia I i P dla ustawień FM-KPFM na 0.3%.
   1. Zmieniaj szerokość pasma sygnału oraz wzmocnienia I i P między powierzchniami próbki. Aby zoptymalizować obrazowanie SP, należy dodatkowo dostosować szerokość pasma sygnału oraz wzmocnienia I i P, aby uzyskać optymalne obrazy. Zalecany zakres zysków I i P wynosi od 0,22 do 0,35%.
10. Przetwarzaj i analizuj zebrane obrazy KPFM za pomocą oprogramowania do przetwarzania po obrazie w celu zbierania danych SP.

Wyniki

Możliwość pomiaru SP za pomocą KPFM opiera się na zasadzie, że zarówno powierzchnia próbki, jak i końcówka wspornika są do pewnego stopnia przewodzące. Stal nierdzewna i złoto działały jak powierzchnie przewodzące, do których przyczepiono MRSA. Wykonano obrazy KPFM 15 komórek MRSA na obu powierzchniach o rozdzielczości 512 x 512 i obszarach skanowania od 5 x 5 μm do 10 x 10 μm. Skanowanie odbywało się z prędkością linii w zakresie od 0,02 linii/s do 0,05 linii/sek. W związku z tym, przy 512 punktach danych zebranych na l...

Dyskusja

KPFM został wykorzystany jako nowatorska technika uzyskiwania danych elektrycznych powierzchni. Jest powszechnie stosowana jako metoda badania rozkładu ładunków w chemii i dopiero niedawno zaczęła być stosowana do badania układów biologicznych w skali mikro i nano. Na podstawie zebranych danych stwierdziliśmy, że drobnoustroje nie wydają się łatwo przyczepiać do czystych powierzchni ze stali nierdzewnej i złota, nawet po 3 godzinach inkubacji statycznej. Powierzchnie funkcjonalizowane poli-L-lizyną wykazywały szybkie prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop sił atomowych 5500ILM	Agilent Technologies	#N9435S
Metalowe dyski do próbek AFM/STM	TED PELLA, INC.	#16219	Tarcze do pobierania próbek ze stali nierdzewnej
DPE (Low-Noise) Przewodzące sondy SPM	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	W każdym chipie znajdują się 4 wsporniki pokryte Pt. Do eksperymentów wykorzystaliśmy wspornik B.
Metalowe dyski do próbek AFM/STM pokryte złotem PELCO	TED PELLA, INC.	#16218-G	Złote dyski z próbkami
Oprogramowanie PicoView	Agilent Technologies	#N9797B	Oprogramowanie do obrazowania mikroskopu sił atomowych 5500ILM
Oprogramowanie do obrazowania obrazu Pico (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Mikroskop sił atomowych oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Scilogex D3024 Mikrowirówka o dużej prędkości	Thomas Scientific	#91201513	Wirówka stosowana na etapach mycia komórek w celu oddzielenia komórek (osadów) od podłoża
Tryptykaza Agar sojowy z 5% krwią owczą	BD	#221261	Gotowe talerze
Tryptyczny bulion sojowy	BD	#257107	Występuje w postaci suchego proszku. Instrukcja, jak zrobić na pojemniku.