Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Streszczenie

Badania dendroekologiczne wykorzystują informacje przechowywane w słojach drzew, aby zrozumieć, jak pojedyncze drzewa, a nawet całe ekosystemy leśne reagowały na zmiany środowiskowe i ostatecznie zrekonstruować takie zmiany. Odbywa się to poprzez analizę zmian wzrostu w czasie i korelację różnych parametrów specyficznych dla rośliny z (na przykład) zapisami temperatury. Włączenie parametrów anatomicznych drewna do tych analiz wzmocniłoby rekonstrukcje, nawet w ujęciu śródrocznym. W związku z tym przedstawiamy protokół dotyczący pobierania próbek, przygotowania i analizy próbki drewnianej do typowych analiz makroskopowych, ale także do późniejszych analiz mikroskopowych. Ponadto wprowadzamy potencjalne rozwiązanie do analizy obrazów cyfrowych generowanych z popularnych małych i dużych próbek w celu wsparcia analiz szeregów czasowych. W protokole przedstawiono podstawowe kroki, jakie obecnie można z nich korzystać. Poza tym istnieje ciągła potrzeba doskonalenia istniejących technik i opracowywania nowych technik w celu rejestrowania i ilościowego określania przeszłych i bieżących procesów środowiskowych. Tradycyjne badania anatomiczne drewna muszą zostać rozszerzone o informacje ekologiczne w tej dziedzinie badań. Wspierałoby to dendronaukowców, którzy zamierzają analizować nowe parametry i opracowywać nowe metodologie, aby zrozumieć krótko- i długoterminowy wpływ określonych czynników środowiskowych na anatomię roślin drzewiastych.

Wprowadzenie

Drzewa, jak również krzewy, krzewy karłowate, a nawet zioła, wykazują różnorodne wzorce reakcji związanych ze zmianami w ich otoczeniu. Wzory te są przedmiotem botaniki i fizjologii roślin od połowy XIX^wieku. W tamtych czasach badania nad roślinami drzewiastymi koncentrowały się głównie na drzewach i opisowej analizie struktury i zmienności słojów rocznych w kontekście ekologicznym¹. Kiedy Andrew Ellicott Douglass wynalazł technikę datowania krzyżowego do badań słojów drzew², ten kontekst ekologiczny został mniej lub bardziej stłumiony przez nową możliwość dokładnego datowania drewnianych znalezisk w archeologii. Datowanie krzyżowe po raz pierwszy umożliwiło dokładne datowanie słojów drzew do roku kalendarzowego i do chwili obecnej jest uważane za podstawę badań słojów drzew we wszystkich dziedzinach ich zastosowania¹.

Równolegle, od końca XIX wieku, anatomia drewna przekształciła się w ważną dyscyplinę badawczą związaną z wieloma innymi dziedzinami nauk przyrodniczych i stosowanych³. Wyodrębniono dwie główne dziedziny: systematyczną anatomię drewna, która jest podstawą identyfikacji drewna w archeologii4, oraz stosowaną anatomię drewna, związaną z technologią, fizjologią, patologią i ekologią^{drewna 3,5}.

W badaniach słojów drzew, dendroekologia jest obecnie definiowana jako temat obejmujący badania związane z słojami drzew, koncentrując się na badaniach środowiskowych, takich jak procesy geomorficzne (dendrogeomorfologia), rekonstrukcje temperatury i opadów (dendroklimatologia), zmiany poziomu wody (dendrohydrologia) czy nawet fluktuacje lodowców (dendroglaciologia)⁶. Jak wskazuje ta definicja, analiza słojów drzew staje się coraz ważniejsza w dziedzinie datowania i rekonstrukcji procesów środowiskowych, takich jak (i) przeszłe warunki klimatyczne poprzez analizę rocznych zmian szerokości słojów^7,8, gęstości drewna⁹ lub izotopów¹⁰ lub (ii) interwały nawrotów procesów geomorficznych¹¹. Te bardzo szczegółowe badania dotyczące zmian szerokości pierścieni i ich zawartości izotopowej wskazują na potrzebę bardziej szczegółowej analizy pierścieni, tj. zbadania budowy anatomicznej pierścieni. Szczegółowe badania cech anatomicznych drewna w obrębie słojów rocznych związanych ze zmianami środowiskowymi są jednak rzadkie^12,13. Chociaż te mikroskopijne cechy są^znane14, rzadko stosowano je na poziomie mikroskopowym do badań dendroekologicznych. Co więcej, dokładny czas tych reakcji wzrostu u naturalnie rosnących drzew, niezbędny do dokładnego datowania, rzadko został ostatnio^{udokumentowany15}.

Jeśli chodzi o skutki globalnego ocieplenia¹⁶, konieczne jest ulepszenie istniejących i opracowanie nowych technik rejestrowania i ilościowego określania przeszłych i trwających procesów środowiskowych, szczególnie w zakresie badań nad wpływem klimatu¹¹. Rozszerzając tradycyjne badania anatomiczne drewna na anatomię drewna opartą na ekologii¹⁷, naukowcy zajmujący się dendro mogą analizować nowe parametry i opracowywać nowe metodologie, aby zrozumieć krótko- i długoterminowy wpływ określonych czynników środowiskowych na anatomię roślin drzewiastych¹⁸. Szczegółowa wiedza na temat zmian różnych parametrów komórkowych w obrębie poszczególnych słojów związanych z określonymi czynnikami (np. siłami mechanicznymi, zmianami klimatu) jest podstawowym wymogiem zrozumienia zmienności powstawania słojów drzew. W porównaniu ze zwykłymi pomiarami szerokości pierścienia, identyfikacja różnic anatomicznych drewna wymaga bardziej złożonych i ekspansywnych technik przygotowania, które wymagają dużo pracy i czasu. Szczegółowe procedury cięcia, barwienia i zatapiania próbek są wielorakie i zawsze zależą od celu badania¹⁹.

Do makroskopowej analizy szerokości pierścieni w drzewach iglastych lub nawet struktur pod kątem liczby, rozmiaru lub rozmieszczenia naczyń w twardym drewnie, powierzchnia próbki jest zwykle polerowana za pomocą drobnego papieru ściernego lub specjalnych szlifierek²⁰. Wadą tej procedury jest wypełnienie poszczególnych komórek pyłem, który uniemożliwia dalszą półautomatyczną analizę mikroskopową²¹. Najlepsze wyniki w makroskopowym przygotowaniu próbki uzyskuje się, gdy powierzchnia próbki jest cięta za pomocą żyletki lub innego ostrego noża.

Podczas gdy dla małych próbek, żyletki są doskonałym narzędziem; większe próbki jako rdzenie wymagają cięcia płaskich powierzchni na całej długości rdzeni. W przeciwieństwie do szlifowania, komórki nie są wypełniane pyłem, co umożliwia późniejsze przygotowanie do kolejnej analizy obrazu. Ponadto światło otwartej komórki, prawidłowo przecięte ściany komórkowe i płaska powierzchnia całej próbki umożliwiają zastosowanie densytometrii wysokiej częstotliwości²² na całej długości rdzenia. W przypadku analiz obrazowych powierzchnię próbek (ściany komórkowe) można zabarwić ciemnym tuszem, a światło otwartej komórki można następnie wypełnić białą kredą w celu zwiększenia kontrastu między ścianą komórkową a obszarem światła^19,23. Ta dość prosta technika umożliwia podstawową makroskopową ocenę większych struktur komórkowych w celu pomiaru wielkości naczyń.

Te techniki cięcia płaskich powierzchni są wystarczające do analiz makroskopowych. W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy anatomicznej drewna (tj. mikroskopowej) mikroskopia w świetle przechodzącym jest najczęstszą metodą stosowaną w naukach o dendro. Komórki ksylemu różnicują się w złożonych procesach obejmujących określanie typu komórki, podział komórek, różnicowanie komórek i programowaną śmierć komórki²⁴. Ponieważ czas i szybkość, z jaką zachodzą te procesy, determinują charakterystykę anatomiczną komórki, warunki środowiskowe wpływające na te procesy mogą generować odchylenia anatomiczne w strukturze pierścienia. Ważnym warunkiem wstępnym tych analiz jest przygotowanie mikroskrawków za pomocą mikrotomu¹⁹. Podczas przygotowywania próbek do przekroju kluczowe znaczenie ma widoczność kierunku tchawicy lub włókien. Do wycinania mikroprzekrojów zaleca się stosowanie mikrotomów przesuwnych z napędem ręcznym, ponieważ technika ta ułatwia tworzenie wysokiej jakości przekrojów w zależności od potrzeb do analiz obrazowych¹⁹. W zależności od konkretnego celu danego badania, mikroprzekroje są cięte prostopadle lub równolegle do podłużnej rozciągłości komórek. Skrawki te są następnie fotografowane pod mikroskopem, a wymiary komórek mierzone za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu.

Do niedawna możliwość przygotowania mikrosekcji była ograniczona tylko do małych rozmiarów próbek (około 1 cm x 1 cm). Jest to dopuszczalne do analizowania pojedynczych zdarzeń jako zakłóceń w określonych latach, ale technika ta nie pozwala na rozszerzoną analizę szeregów czasowych potrzebną do rekonstrukcji środowiska. Wysiłek ten można zrealizować jedynie poprzez opracowanie nowych, wydajnych i ekonomicznych procedur przygotowawczych i technik analitycznych. W ostatnich latach członkowie laboratorium słojów drzew w Szwajcarskim Federalnym Instytucie Badawczym WSL w Szwajcarii rozpoczęli intensywne prace nad tym tematem. W rezultacie opracowano nowe urządzenia i techniki analizy, które wspierają ideę integracji cech anatomicznych drewna z szerokim zakresem tematów badań środowiskowych.

Protokół

1. Techniki pobierania próbek

1. Próbkowanie rdzenia
   1. Aby pobrać próbki pni drzewa, należy wydobyć co najmniej dwa rdzenie za pomocą rdzenia przyrostowego z każdej łodygi, aby przeanalizować jej rozwój wzrostu. Zmieniaj położenie pobierania próbek w zadaniu badawczym, np. w przypadku typowych rekonstrukcji klimatycznych należy ułożyć rdzenie równolegle do zbocza. Podczas pracy z gatunkami tropikalnymi weź co najmniej trzy lub więcej rdzeni.
   2. Użyj zaostrzonego rdzenia przyrostowego (o średnicy 5, 10 lub 12 mm) i umieść rdzeń prostopadle do rosnącej osi łodygi.
      UWAGA: Aby mieć kontrolowaną i stabilną pozycję rdzenia, użyj popychacza, aby uniknąć ruchów rdzenia innych niż jego obrót podczas wiercenia go w drzewie. Wwiercić się w łodygę aż do rdzenia i przez niego. Do rdzeniowania bardzo gęstego drewna (tj. gatunków tropikalnych) należy używać specjalnych, przekonfigurowanych korpusów pił łańcuchowych z adapterem rdzeni przyrostowych, które pozwalają na rdzeniowanie nawet gęstego drewna jako Diospyrus ebenum (Heban).
   3. Użyj ekstraktora i usuń powstały rdzeń z drzewa. Wykręć rdzeń i usuń go z łodygi.
   4. Dodaj określony identyfikator do wyodrębnionego rdzenia za pomocą miękkiego ołówka, pisząc na taśmie, która jest następnie umieszczana bezpośrednio na rdzeniu. Powtórz procedurę po przeciwnej stronie łodygi.
   5. Przechowuj dwie próbki drzewa w plastikowych lub papierowych tubach lub specjalnych pudełkach, aby zapobiec uszkodzeniom.
      UWAGA: Słomki papierowe są korzystne szczególnie w środowiskach tropikalnych, ponieważ zapobiegają pleśnieniu rdzeni.
   6. Na koniec zamontuj rdzenie (w kierunku włókien pionowo) na drewnianych belkach nośnych. Użyj kleju do drewna odpornego na zimną wodę i pozwól im wyschnąć.
      UWAGA: Nigdy nie montuj rdzeni na drewnianych wspornikach, jeśli celem badania jest dalsza analiza chemiczna, izotopowa lub gęstości. W tym celu należy zamocować rdzenie w otwartych kanałach kablowych lub jednolicowej tekturze falistej.
2. Próbkowanie mikrordzeniowe
   1. Użyj specjalnego urządzenia do wykrawania lub igły z otworem 2 mm. W zależności od grubości kory użyj dłuta, aby usunąć niezbędną część kory.
   2. Umieść urządzenie prostopadle do osi wzrostu na łodydze, jak opisano powyżej, i za pomocą młotka wbij się w ksylem łodygi na głębokość około 2 cm.
   3. Obróć igłę, aby złamać powstały mikrordzeń wewnątrz narzędzia i usuń go z trzpienia. Przechowuj mikrordzenie w fiolkach do mikrowirówek i oznacz je.
3. Pobieranie próbek z płyty
   1. W szczególnych przypadkach (a zwłaszcza w tropikach), np. podczas pobierania próbek z pni i powalonych drzew lub w miarę możliwości, należy pobrać tarcze (przekroje prostopadłe do osi wzrostu) za pomocą piły łańcuchowej. Po prostu oznacz płyty i przechowuj je do dalszej analizy.
      UWAGA: Ta procedura pobierania próbek jest najczęściej stosowana w przypadku wszystkich suchych martwych, historycznych, archeologicznych i subfopalnych materiałów, a także bardzo gęstego drewna liściastego, które nie pozwala na użycie rdzeni przyrostowych.

2. Przygotowanie próbki

1. Tarcze szlifierskie
   1. Umieść tarcze na szlifierce i przeszlifuj powierzchnię za pomocą sekwencji coraz drobniejszych materiałów ściernych, zaczynając od papieru ściernego o ziarnistości 80, a następnie o ziarnistości 120, 220, 300. Końcowe polerowanie papierem o ziarnistości 400 jest wystarczające dla większości drzew iglastych. W przypadku drewna liściastego, a zwłaszcza gatunków tropikalnych, należy użyć grysu ściernego o grubości do 1 200 mm, aby odróżnić granice słojów.
2. Cięcie płaskich powierzchni na rdzeniach
   1. Zamocuj rdzenie inkrementacyjne w uchwycie rdzenia nowo opracowanego mikrotomu rdzeniowego, umożliwiając cięcie płaskich powierzchni rdzeni na całej ich długości.
      UWAGA: Skoryguj orientację rdzenia w uchwycie, aby kierunek włókien próbki był pionowy, czyli pod kątem prostym do noża mikrotomu.
   2. Podnieś rdzeń, aż lekko dotknie ostrza. Pociągnij ostrze, które jest zamocowane na prowadnicy na łożysku kulkowym, po długości rdzenia, aby odciąć pierwszą część góry.
   3. Wepchnąć nóż za gilzę, podnieść uchwyt próbki z rdzeniem o około 10 μm i powtórzyć procedurę cięcia. Rób to, aż około jedna trzecia średnicy rdzenia zostanie odcięta, co spowoduje powstanie ciągłej płaskiej powierzchni.
3. Przygotowanie mikro przekrojów poprzez dodanie roztworu skrobi kukurydzianej.
   1. W celu szczegółowej analizy obrazu struktury anatomicznej należy utrwalić rdzenie lub inne próbki oddzielone od krążków w uchwycie mikrotomu. Umieść ostrze mikrotomu, prowadzone przez łożysko kulkowe nowo opracowanego mikrotomu saneczkowego, na górnej krawędzi próbki i pociągnij nad nim.
   2. Popchnij ostrze, aby podnieść próbkę o około 20 do 30 μm i ponownie przeciągnij ostrze nad próbką. Powtarzaj tę procedurę, aż zostanie utworzona ciągła powierzchnia na wierzchu próbki.
   3. Przykryj powstałą powierzchnię roztworem skrobi kukurydzianej (10 g skrobi kukurydzianej, 8 ml wody i 7 g 100% glicerolu) za pomocą zwykłej szczotki.
      UWAGA: Ziarna skrobi wypełniają otwarte komórki próbki, aby ustabilizować strukturę przed późniejszym cięciem cienkich odcinków.
   4. Podnieś próbkę o 15 μm, umieść szczotkę na powierzchni próbki i powoli pociągnij ostrze w kierunku próbki, zaczynając odcinać cienki odcinek (poniżej szczotki). Podczas cięcia powstała sekcja ślizga się po ostrzu prowadzonym przez szczotkę.
   5. Po przecięciu całej sekcji usuń mikrosekcję z ostrza za pomocą szczotki i wody (w celu zmniejszenia tarcia) i umieść sekcję na szklanym szkiełku w celu dalszego przygotowania. Aby zapobiec ich wysuszeniu, przykryj je niewielką ilością glicerolu (33% = jedna część 100% glicerolu i dwie części wody).

3. Przygotowanie mikropreparatów

1. W celu późniejszego przygotowania preparatów stałych należy najpierw zmyć glicerol z mikrosekcji za pomocą pipety i wody.
2. Przykryj mokry odcinek kilkoma kroplami Safraniny (1 g proszku Safraniny + 100 ml wody) i Astrablue (0,5 g niebieskiego proszku Astra + 2 ml 100% kwasu octowego + 100 ml wody), aby odróżnić struktury zdrewniałe od niezdrewniałych, ale także zwiększyć kontrast do późniejszej analizy obrazu.
3. Pozostaw sekcję na 5 minut przykrytą barwnikiem, a następnie ponownie zmyj ją pipetą i wodą.
4. Jak tylko nadmiar barwnika zostanie usunięty, odwodnić sekcję pipetami, myjąc je sekwencją 75% rozcieńczonego, 96% i na koniec 100% etanolu.
5. Zamiast umieszczać próbki w kąpieli w kąpieli, należy używać pipet do płukania próbek na szkiełku podstawowym, aby skrócić czas przetwarzania do około dwóch do 3 minut w całym procesie odwadniania.
   UWAGA: Odwodnienie etanolem zapobiega pękaniu delikatnych próbek.
6. Następnie spłucz skrawek 100% ksylolem.
   UWAGA: Ksylen jest rakotwórczy i podczas jego stosowania w laboratorium obowiązkowa jest wentylacja. Istnieją inne produkty zastępujące ksylol, ale jeśli istnieje zamiar przechowywania próbek przez dłuższe okresy czasu (lata, dekady) w celu potencjalnej ponownej analizy, balsam kanadyjski (krok 3.5.2) jest jedynym podłożem do zatapiania, które pozostaje przezroczyste bez zmiany koloru w czasie. Niestety balsam kanadyjski musi być stosowany w połączeniu z ksylolem.
7. Dopóki ksylol zmieni kolor na mleczny (białawy), powtórz proces odwadniania, ponieważ nie jest wystarczająco odwodniony.
8. Gdy tylko ksylol pozostanie czysty, przykryj sekcję kroplą 100% balsamu kanadyjskiego i przykryj ją szkłem nakrywkowym o rozmiarze co najmniej równym rozmiarowi sekcji.
   UWAGA: Należy pamiętać o usuwaniu pęcherzyków powietrza poprzez delikatne dociśnięcie szkła nakrywkowego.
9. Umieść powstałą mikroszkiełko między dwoma paskami żaroodpornych tworzyw sztucznych i umieść je na metalowej płycie. Umieść ciężarek (np. magnes) na górze szkiełka, aby go docisnąć, aby sekcja była płaska podczas następnego procesu suszenia.
10. Umieść szkiełka w piekarniku nagrzanym do 60 °C na około 12 godzin. Po 12 godzinach wyjmij szkiełka z piekarnika i umieść je na półce, aby ostygły do temperatury RT (około 20 °C). Po ostygnięciu usuń ciężarek i plastikowy pasek i wyczyść szkiełko za pomocą żyletek, aby usunąć nadmiar balsamu kanadyjskiego.

4. Wizualizacja zawartości komórek

1. Przygotuj roztwór Nawashin²⁵.
   1. Przygotować roztwór (A) z 5 g kwasu chromowego, 50 ml 96% kwasu octowego i 320 ml wody dejonizowanej. Przygotować inny roztwór (B) z 200 ml formaliny ze 175 ml wody dejonizowanej.
   2. Wymieszaj roztwór A i roztwór B w stosunku 1:1, aby uzyskać roztwór Nawashin.
2. Aby uwidocznić zawartość komórki, utrwal próbkę roztworem Nawashin przez 10 minut, aby zatrzymać wszystkie procesy degradacji w komórce.
   UWAGA: Utrwalenie zachowuje jądra komórkowe, pozwalając na oszacowanie długowieczności komórki (długowieczność komórki = jądra obecne / jądra nieobecne; obecność lub brak jądra wskazuje, czy komórka jest żywa, czy martwa).
3. Po utrwaleniu należy przemyć skrawki wodą, aby całkowicie usunąć roztwór Nawashin, a następnie zabarwić je błękitem Safranin-Astra, a przed dodatkowym zabarwieniem błękitem pikrynowo-anilinowym (1 część nasyconego rozpuszczalnego w wodzie błękitu anilinowego + 4 części 10% kwasu pikrynowego).
4. Ostrożnie podgrzać próbkę do temperatury około 80 °C (w każdym przypadku poniżej temperatury wrzenia), aby przyspieszyć proces barwienia. W przypadku dehydratacji i zatapiania próbek należy postępować zgodnie z krokami protokołu 3.4 do 3.8.

5. Przygotowanie cyfrowych obrazów cech anatomicznych

1. Twórz cyfrowe obrazy powierzchni rdzeni do analizy zbiorników.
   1. Wytnij płaszczyznę powierzchni rdzenia za pomocą mikrotomu rdzeniowego i zabarwij powstałą powierzchnię na czarno za pomocą markera filcowego.
   2. Jak tylko barwnik wyschnie, przetrzyj powierzchnię rdzenia białą kredą. Dociśnij kredę w komórkach, po prostu pocierając kredę po powierzchni palcem. W ten sposób usuń również nadmiar kredy.
      UWAGA: W rezultacie ściany komórkowe są czarne, a części świetlne naczyń są białe. Ten kontrast jest warunkiem wstępnym automatycznej analizy obrazu.
   3. Przygotowany rdzeń należy umieścić pod mikroskopem dwuokularowym wyposażonym w kamerę cyfrową. Wykonaj sekwencję lekko nakładających się na siebie (ok. 10%) obrazów, zaczynając od jednej strony rdzenia, aż do uchwycenia całej powierzchni. Złącz pojedyncze obrazy, aby utworzyć pełny obraz powierzchni rdzenia.
2. Tworzenie obrazów cyfrowych z mikroslajdów
   1. Umieść oczyszczone mikropreparaty pod mikroskopem i wykonuj nakładające się obrazy z całego przekroju.
   2. Zdefiniuj konkretne powiększenie w zależności od struktur, które mają być analizowane, w zakresie od 40X do 1,000X.
   3. Złącz pojedyncze obrazy, aby utworzyć jeden kompletny obraz sekcji. Aby uniknąć ewentualnych zniekształceń podczas procesu szycia, należy używać soczewek obiektywowych typu "plan" z mikroskopem.

6. Kwantyfikacja cech anatomicznych

1. Aby wykryć komórki i granice pierścieni za pomocą narzędzia do analizy obrazu ROXAS18 lub podobnego oprogramowania, należy załadować pełny obraz mikroprzekroju i związaną z nim kalibrację przestrzenną, aby uzyskać wyniki ilościowe w jednostkach metrycznych. Obliczyć kalibrację przestrzenną, mierząc liczbę pikseli między skalami obrazów ze stolika mikrometrycznego wykonanych w tym samym powiększeniu i dzieląc uzyskaną wartość przez odstępy między podziałkami w jednostkach metrycznych (np. 1 000 μm).
2. Z podanej listy (dołączonej do oprogramowania) należy wybrać odpowiednią konfigurację przed rozpoczęciem automatycznej części analizy.
   UWAGA: Konfiguracja to wcześniej zoptymalizowany zestaw ustawień programu, który na przykład uwzględnia kolor barwienia próbki oraz zakres rozmiaru i kształtu komórek, które mają być wykryte. Dostosowane konfiguracje pozwalają zatem na uzyskanie optymalnych wyników rozpoznawania dla różnych gatunków i jakości obrazu.
   1. Wybierz dalsze opcje, takie jak użycie obszarów na obrazie, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone, aby uniknąć np. pustych marginesów obrazu lub pęknięć w próbce, jeśli jest to wymagane.
3. Rozpocznij analizę, naciskając przycisk Analizuj. Jeśli ta opcja jest wybrana, zdefiniuj obszary obrazu, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone, za pomocą narzędzia wielokąta, prostokąta lub koła. Poniższa analiza automatyczna wykorzystuje elastyczne algorytmy do korygowania niektórych wad obrazu (np. słabego kontrastu) i poprawy kontrastu w zależności od jakości obrazu.

Wyniki

Wszystkie analizy dendroekologiczne zależą od dokładnych próbek, bez względu na to, czy pobierane są krążki, rdzenie czy mikrordzenie. W tym celu urządzenia muszą być w idealnym stanie (dokładnie naostrzone), aby uniknąć mikropęknięć w drewnianej próbce. Podczas przygotowywania powierzchni na rdzeniach inkrementacyjnych niezbędne jest użycie mikrotomu rdzeniowego. Zdolność do posiadania otwartych komórek, które mogą być dalej poddawane obróbce w celu zwiększenia kontrastu podczas analiz obrazów i pomiarów wielkości naczyń (ryc. 1), jest pierwszym ważnym krokiem w kierunku adaptacji struktur anatomicznych do analiz szeregów czasowych. Czasami gęstość próbki drewna liściastego uniemożliwia użycie mikrotomu. W takim przypadku najlepszym rozwiązaniem jest odpowiednie wypolerowanie, a następnie usunięcie nadmiaru trocin z naczyń za pomocą kompresora lub odkurzacza.

Do bardziej szczegółowych analiz mniejszych struktur komórkowych, takich jak tracheidy wczesnego drewna i późnego drewna w drzewach iglastych, potrzebne są wysokiej jakości mikrosekcje. W tym przypadku należy unikać potencjalnych artefaktów, takich jak wtórne ściany komórkowe, które są usuwane ze ściany pierwotnej (rysunek 2). Jeśli artefakty te wystąpią na obrazach cyfrowych, automatyczna analiza wymiarów komórki nie jest już możliwa. Artefakty muszą być następnie ręcznie korygowane, co jest czasochłonne i w większości przypadków skutkuje nieprawidłowymi pomiarami wymiarów komórek. Proste nałożenie płynu nienewtonowskiego, tj. roztworu skrobi kukurydzianej, na wierzch próbki wspomaga stabilność struktury, jednocześnie redukując występowanie artefaktów do minimum (ryc. 2)²⁶. Takie zastosowanie skrobi kukurydzianej, odpowiedniej dla wszystkich próbek drewnianych, w tym gatunków tropikalnych, sprawia, że zastosowanie procedury zatapiania do próbek przed cięciem jest zbędne.

Mikrosekcje umożliwiają pewniejsze określanie słojów rocznych. Dotyczy to zwłaszcza drzew iglastych rosnących na ich naturalnych granicach, tj. na linii drzew na obszarach wysokogórskich. Ekstremalnie wąskie pierścienie są częste i trudne do wykrycia makroskopowo (ryc. 3). W skrajnych przypadkach słoje składają się z jednego lub dwóch rzędów komórek wczesnego drewna i jednego rzędu spłaszczonych komórek późnego drewna, które nie mają (w przeciwieństwie do zwykłych komórek późnego drewna) pogrubionych ścian komórkowych. W tym celu są one lepiej lub nawet widoczne tylko przy użyciu mikrosekcji. Co więcej, fluktuacje gęstości można wyraźniej odróżnić od granic pierścieni, co upraszcza wykrywanie słojów rocznych, zwłaszcza w basenie Morza Śródziemnego i tropikach (ryc. 3).

Podczas analizy obrazów w powiększeniu 40X lub wyższym, widoczne są pojedyncze komórki, a grubość ich ścian komórkowych jest również wykrywalna. Oprogramowanie do analizy półautomatycznej umożliwia pomiar określonych parametrów wzdłuż zdefiniowanych ścieżek zgodnie z kierunkiem ich czasowego i przestrzennego rozwoju (rys. 4). Dzięki temu można określić zmiany pojedynczych parametrów, takich jak światło komórki lub grubość ściany komórkowej na całej długości pierścienia rocznego (rysunek 4). Można to zrobić dla wszystkich pierścieni widocznych na obrazie, co w pełni potwierdza potrzebę rozszerzonej analizy szeregów czasowych.

Analizy obrazów mogą być również używane do określania faz rozwojowych słojów rocznych w okresie wegetacji (Rysunek 5). Analizując obraz przekroju wybarwionego Safraniną i Astrą-niebieskim przy użyciu światła spolaryzowanego, widoczne stają się nawet różne etapy zdrewnienia, rozpoczynające się w najbardziej zewnętrznych rogach ścian komórkowych aż do pełnego zdrewnienia wtórnej ściany komórkowej. Dzieje się tak, ponieważ zdrewniałe (dojrzałe) ściany komórkowe świecą w spolaryzowanym świetle (ryc. 5). Szczegółowe informacje można odnieść do danych środowiskowych udokumentowanych dla danego okresu wegetacji, aby określić na przykład bardziej szczegółową zależność między klimatem a wzrostem.

Rysunek 1. Przykłady mikroprzekroju i przygotowanej płaskiej powierzchni dębu wraz z pomiarami szerokości słojów i wielkości naczynia. Po lewej: najbardziej zewnętrzna część rdzenia z drewna dębowego. Rdzeń o średnicy 5 mm został wycięty za pomocą mikrotomu rdzeniowego. Powierzchnia została następnie zabarwiona na czarno za pomocą markera filcowego, a komórki wypełniono białą kredą po wyschnięciu plamy. Po prawej: wykres przedstawia pomiary szerokości pierścienia i wielkości naczynia wykonane na powierzchni rdzenia pokazanej po lewej stronie. Do wykonania tych pomiarów nie były potrzebne żadne mikrosekcje ze względu na przezroczystą powierzchnię utworzoną przez mikrotom rdzeniowy (zmodyfikowaną po²¹). Dół: Mikrosekcja odcięta rdzeń przyrostowy, poplamiona, odwodniona i utrwalona w balsamie kanadyjskim. Grubość: 20 μm, długość: 25 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Obrazy mikroprzekrojów ciętych bez stabilizacji w porównaniu z przekrojami ciętymi przy użyciu roztworu skrobi kukurydzianej. Po lewej: Sekcja mikro pokazująca artefakty tnące w tchawicach wczesnego drewna iglastego. Próbka została wycięta bez osadzania, w wyniku czego dość cienkie ścianki wtórne komórek wczesnego drewna zostały oddzielone od ściany pierwotnej (niebieskie strzałki). Po prawej: Przekrój mikro bez żadnych artefaktów w tchawicach wczesnego drewna iglastego. Ten odcinek (ta sama próbka, jak pokazano po lewej stronie) został przecięty po nałożeniu roztworu skrobi kukurydzianej pędzlem na powierzchnię próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przykłady trudno wykrywalnych rocznych granic pierścieniowych. Po lewej: Mikroprzekrój rdzenia przyrostowego (tutaj: Larix decidua) pokazujący granicę pierścienia (strzałka) wskazywaną przez pojedynczy rząd spłaszczonych komórek późnego drewna bez pogrubienia ścian komórkowych. Pierścień ten nie byłby widoczny makroskopowo. Po prawej: Wewnątrzroczne wahania zagęszczenia (biała strzałka) są powszechne u gatunków śródziemnomorskich (przekrój mikro: Quercus ilex). Stopniowa zmiana struktury komórkowej w kierunku późnego drewna i z powrotem do wczesnej struktury drewna (biała strzałka) pozwala na różnicowanie wahań gęstości od rzeczywistych granic pierścienia (strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Ilustracja pomiarów powierzchni światła i grubości ścianki w pierścieniu rocznym drzewa iglastego. U góry: Wycięty obraz przedstawiający przykładowe wyniki analizy ROXAS w słojach drzew Pinus sylvestris (sosna zwyczajna). Obramowania pierścieni są pokazane na żółto, a kontury tchawicy lumina na niebieskozielonym. Dla jednego pliku radialnego (niebieska tracheid lumina) zmierzone grubości ścian komórek są reprezentowane przez czerwone kółka. podziałka = 100 μm. Dół: Śródroczne zmiany powierzchni światła tchawicy i grubości ścianki komórkowej tchawicy dla całego pierścienia rocznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Przykład formującego się pierścienia rocznego. Obraz został wykonany pod mikroskopem świetlnym ze spolaryzowanym światłem z mikroprzekroju barwionego na niebiesko Safranina i Astry uzyskanego z mikrordzenia pobranego 7 lipca 2007 r. z Larix decidua rosnącego w Lötschental na wysokości 1300 m n.p.m. W tym mikroprzekroju rozpoznawalne są komórki kambium, komórki w fazie powiększenia, komórki w fazie pogrubienia ściany i komórki dojrzałe. Szerokość styczna obrazu obejmuje ~1 mm przekroju ksylemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyzwania związane z udaną i zrównoważoną integracją anatomii drewna z badaniami dendroekologicznymi, oprócz wielorakich problemów analitycznych, wynikają głównie z aspektów technicznych. Wyzwania te obejmują zarówno podstawowe podejścia do pobierania próbek, jak i tworzenie wysokiej jakości mikroprzekrojów i ich późniejszą analizę¹⁹.

Na pierwszy rzut oka próbkowanie rdzeni, a nawet dysków to prosta procedura znana już od wielu lat. Jest wiele rzeczy, które można zrobić źle, a niewielka niedokładność w pobieraniu próbek może spowodować poważne problemy podczas kolejnych faz przygotowania i analizy. Drobne niedokładności, takie jak rdzeniowanie, które nie jest dokładnie prostopadłe do osi trzpienia lub użycie nieidealnie naostrzonego rdzenia, nie stanowią problemu, jeśli cel badania ogranicza się do pomiarów szerokości pierścienia. Jednak w przypadku dążenia do analizy mikroskopowej próbek, nieprawidłowy kierunek pobierania próbek może skutkować zniekształceniami optycznymi ścian komórkowych, podczas gdy użycie rdzeni powoduje mikropęknięcia w rdzeniu. W rezultacie, przy próbie cięcia mikro odcinków tych rdzeni, cienkie sekcje po prostu się rozpadają i nie jest już gwarantowane skuteczne przygotowanie. To samo dotyczy próbkowania mikrordzeniowego. końcówka spowoduje wysokie ciśnienie, gdy dziurkacz zostanie wbity w drewno łodygi. W konsekwencji warstwa kambium zostanie ściśnięta. Komórki kambium (ryc. 5) są w konsekwencji ściskane i nie można ich analizować.

Pobieranie próbek z dysku jest rzeczywiście najlepszą strategią podczas analizy zmian wzrostu w celu powiązania ich ze zmianami środowiskowymi. Niestety, po prostu niemożliwe jest pobranie krążków ze wszystkich drzew przeznaczonych do pobrania próbek do dalszych analiz. Niemniej jednak, szczególnie w przypadku dendrochronologii tropikalnej, potrzebna jest pewna ilość krążków macierzystych w połączeniu z rdzeniami przyrostowymi. Dyski są używane jako podstawa do definiowania granic pierścienia i w tym celu do obsługi granic zdefiniowanych na podstawie analizy rdzeni przyrostowych^12,27,28.

Często omawiane są zalety i wady szlifowania w porównaniu z cięciem^1,11,21. Jak wspomniano powyżej, najlepsza procedura zawsze zależy od pytania badawczego i parametrów, które mają być analizowane (makroskopowe lub mikroskopowe). Jeżeli analizy izotopowe lub chemiczne są projektowane w dalszym etapie roboczym, niezwykle ważne jest, aby pył ścierny powstały podczas szlifowania, który może wypełnić luminę komórki na całej próbce, został starannie usunięty przez odkurzanie lub sprężone powietrze.

Wycinanie mikroskrawków jest dla wszystkich analiz mikroskopowych najwłaściwszym sposobem przygotowania próbek do dalszych analiz. W pierwszej kolejności odcinana jest próbka, którą następnie można zachować bez żadnych zanieczyszczeń do ewentualnych dalszych analiz. Po drugie, sekcje te pozwalają na pomiary parametrów pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości. Co więcej, unikanie czasochłonnej techniki zatapiania poprzez użycie roztworu skrobi kukurydzianej²⁶ do stabilizacji komórek jest dużą zaletą w mikrosekcjach.

Wadą mikroprzekroju jest nadal ograniczona wielkość próbki, co skutkuje długim czasem przygotowania. W przypadku analiz szeregów w czasie rzeczywistym sięgających w czasie na przestrzeni wieków, a nawet tysiącleci, istnieje potrzeba dalszego rozwoju istniejących urządzeń tnących^17,19, ale także przetwarzania i analizy obrazu¹⁸. Pierwszym krokiem w tym kierunku jest opracowanie mikrotomu^{rdzeniowego 21}, początkowo produkowanego do cięcia płaskich powierzchni rdzeni (ilustracja 1). Ostatnie testy wykazały możliwość wycinania mikrosekcji całych rdzeni za pomocą tego urządzenia (ilustracja 1).

Wysokiej jakości mikrosekcje stanowią podstawową zasadę skutecznej analizy obrazu. Wykonywanie zdjęć pod mikroskopem jest powszechną procedurą¹⁹ , ale ich skuteczna analiza jest nadal zadaniem, które wymaga dalszego rozwoju¹⁷ . Wszystkie istniejące systemy analizy obrazu są półautomatyczne, tzn . muszą być mniej lub bardziej intensywnie kontrolowane przez technika. W wielu przypadkach obrazy muszą zostać skorygowane, a nawet konieczne jest wykonanie nowych obrazów w celu zwiększenia kontrastu w celu lepszej rejestracji struktur przez oprogramowanie bez zmiany grubości ściany komórkowej w obrazie.

Specjalistyczne narzędzia do analizy obrazu, takie jak ROXAS¹⁸, WinCell lub specjalne skrypty dla ImageJ²⁹, są w stanie dostarczyć podstawowych danych anatomicznych, takich jak liczba komórek, wymiary komórek, grubość ściany komórkowej i położenie komórki w pierścieniu rocznym. Na podstawie tych podstawowych pomiarów można obliczyć wiele dodatkowych wskaźników anatomicznych, które są istotne w kontekście dendroekologicznym, takich jak rozmiar największych przewodów, rozkład rozmiarów przewodów, rozmiar wczesnego drewna lub pierwszego rzędu przewodów, gęstość drewna (optycznego), śródroczne profile wielkości przewodu i grubości ścianki komórkowej oraz wzorce grupowania przewodów (pojedyncze, wielokrotności itp.).

Korzystając z oprogramowania ROXAS¹⁸, kontury luminy przewodu (tj. ogniwa przewodzącego wodę) i obramowania pierścienia rocznego są automatycznie rozpoznawane i wizualnie przedstawiane jako nakładki na oryginalny obraz. Algorytmy wykrywania przewodów są oparte na informacjach o kolorze, rozmiarze i kształcie, a algorytmy wykrywania granic pierścieniowych na lokalnym kontekście każdego kanału. Przybornik pozwala nam ręcznie poprawić te wyniki poprzez bezpośrednią edycję elementów nakładki, tj. usuwanie, dodawanie i modyfikowanie obramowań pierścieni i konturów przewodów. Po edycji końcowe dane wyjściowe, w tym grubość ścianki komórki (drzewa iglaste), są automatycznie generowane i zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym. W pełni zautomatyzowane systemy nie są obecnie dostępne, nawet dla drzew iglastych o stosunkowo prostej budowie, ale jest to cel na przyszłe rozwój. Zdecydowanie przemawiałoby to za pełną integracją parametrów anatomicznych drewna w analizach szeregów czasowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przyrost rdzenia			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article & id=57& Itemid=88& lang=pl
Core-Microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory Mikrotom			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor mikrordzeń			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
roztworem			Dziesięć części 1% kwas chromowy, cztery części 4% formaldehyd i jedna część kwasu octowego
		anilinowy Pikry-Jedna	część nasyconego błękitu anilinowego i cztery części Trinitrofenolu rozpuszczone w 95% etanolu
Safranina			Wzór empiryczny (notacja Hilla) C20H19ClN4
Astra-blue			Wzór empiryczny (notacja Hilla) C47H52CuN14O6S3
Etanol			Wzór liniowy CH3CH2OH
Ksylol (ksylen)			Wzór liniowy C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Embedding solution do mikroskopii
Oprogramowanie			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
Oprogramowanie			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/