Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

Podsumowanie

Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.

Streszczenie

Ruchliwość powierzchni bakterii, taka jak rój, jest powszechnie badana w laboratorium za pomocą testów płytkowych, które wymagają określonych stężeń agaru, a czasami włączenia określonych składników odżywczych do podłoża wzrostowego. Przygotowanie takich wyraźnych pożywek i warunków wzrostu powierzchni służy zapewnieniu sprzyjających warunków, które umożliwiają nie tylko wzrost bakterii, ale także skoordynowaną ruchliwość bakterii na tych powierzchniach w cienkich warstwach cieczy. Odtwarzalność testów płytek roju i innych płytek ruchliwości powierzchni może być poważnym wyzwaniem. Szczególnie w przypadku rojów o bardziej "umiarkowanym klimacie", które wykazują ruchliwość tylko w zakresach agaru 0,4%-0,8% (wag./obj.), niewielkie zmiany w protokole lub środowisku laboratoryjnym mogą znacznie wpłynąć na wyniki testów roju. "Zwilżalność", czyli zawartość wody na granicy faz ciecz-ciało stałe-powietrze w tych testach płytkowych, jest często kluczową zmienną, którą należy kontrolować. Dodatkowym wyzwaniem w ocenie roju jest ilościowe określenie obserwowanych różnic między dowolnymi dwoma (lub więcej) eksperymentami. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wszechstronny dwufazowy protokół przygotowania i testów roju obrazów. Dołączamy wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem pożywek do testów roju i kwantyfikacją danych z tych testów. W szczególności demonstrujemy naszą metodę przy użyciu bakterii, które wyrażają fluorescencyjne lub bioluminescencyjne reportery genetyczne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), lucyferazy (operon luksów) lub barwienia komórkowe, aby umożliwić poklatkowe obrazowanie optyczne. Dalej demonstrujemy zdolność naszej metody do śledzenia konkurujących ze sobą gatunków rojowych w tym samym eksperymencie.

Wprowadzenie

Wiele bakterii porusza się po powierzchniach za pomocą różnych środków napędu. Niektóre fenotypy ruchliwości można badać w laboratorium za pomocą testów płytkowych, na które wpływa środowisko ciekłe związane ze składem testu półstałego. Podzbiór użytecznych testów ruchliwości powierzchni płytek dodatkowo obejmuje fazę gazową - zwykle powietrze w pomieszczeniu. W związku z tym wynik każdego konkretnego testu ruchliwości powierzchni wymaga starannej kontroli granicy faz trzech faz: lokalnej powierzchni ciała stałego, środowiska ciekłego i właściwości środowiska gazowego.

Najczęściej badany tryb ruchliwości w takim trójfazowym teście jest znany jako rój. Ruchliwość roju to skoordynowany ruch grupowy komórek bakteryjnych, które są napędzane przez wici przez cienkie ciekłe warstwy na powierzchniach¹. Zwykle jest badany w laboratoriach przy użyciu testów półstałych płytek zawierających 0,4%-0,8% (wag./obj.) agaru¹. Szereg ludzkich patogenów wykorzystuje to zachowanie ruchliwości do eksploracji i kolonizacji ludzkiego gospodarza. Na przykład Proteus mirabilis wykorzystuje ruchliwość roju, aby przemieszczać się w górę cewki moczowej, docierając i kolonizując pęcherz moczowy i nerki². Ruchliwość roju jest ogólnie uważana za etap prekursorowy do tworzenia biofilmu, głównej przyczyny patogenezy wielu patogenów u ludzi³.

Fenotyp roju jest bardzo zróżnicowany wśród gatunków bakterii; sukces eksperymentalny i powtarzalność zależą od takich czynników, jak skład składników odżywczych, rodzaj i skład agaru, protokół sterylizacji (np. autoklawowanie), utwardzanie półstałych pożywek i wilgotność otoczenia (np. zmiany pór roku), między innymi^3-5. Zmienność reakcji na ruchliwość powierzchni podkreśla wyzwania napotkane w tych badaniach oraz znaczący wpływ, jaki mogą wywierać media i środowisko. W przypadku niektórych gatunków rojowych, takich jak Pseudomonas, ruchliwość roju może wystąpić na różnych składach pożywki, chociaż obserwowany fenotyp i towarzyszące mu tempo ekspansji roju będą się znacznie różnić³. W połączeniu czynniki te mogą sprawić, że badania ruchliwości powierzchni będą niezwykle trudne. Sezonowa zmienność w laboratorium może wpływać na te trójfazowe testy: testy mogą działać lepiej w wilgotnym powietrzu latem i gorzej w suchym powietrzu zimą. Poniżej przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące obejścia niektórych z najbardziej zauważalnych wyzwań podczas wykonywania badań ruchliwości powierzchni płyt.

Dla niektórych badań nad ruchliwością powierzchni, rozwój określonych fenotypów jest bardzo interesujący. Większość, ale nie wszystkie, opublikowane badania mające na celu zbadanie roju P. aeruginosa pokazują tworzenie się wąsów lub fraktali promieniujących z centrum inokulacji^3-9. Różnice między szczepami P. aeruginosa zostały udokumentowane^5,8, ale wiele z obecności lub braku wąsów można przypisać specyficznemu pożywce i protokołowi stosowanemu w tych testach ruchliwości roju. Tutaj zamieszczamy szczegółowe informacje o tym, jak promować roje tworzące wąsy dla P. aeruginosa. Ponieważ P. aeruginosa jest tylko jedną z wielu bakterii rojowych, dołączamy również szczegóły naszej metody badania roju Bacillus subtilis i ślizgania się Myxococcus xanthus. Podobnie jak w przypadku P. aeruginosa, obecne badania nad B. subtilis i M. xanthus obejmują szereg tematów, ponieważ naukowcy pracują nad rozpoznaniem aspektów sporulacji, ruchliwości, reakcji na stres i zachowań przejściowych^1,10. Istnieje potrzeba ilościowego określenia wzorców i dynamiki określonych zachowań dla tych komórek w grupach roju.

Akwizycja, analiza i interpretacja danych dotyczących ruchliwości powierzchni może być kłopotliwa i jakościowa. Opracowaliśmy protokół szczegółowej analizy makroskopowej rojów bakterii, który oprócz morfologii i wielkości strefy roju (np. średnicy) dostarcza ilościowych informacji dynamicznych dotyczących szybkości ekspansji roju oraz rozkładu gęstości bakterii lub bioproduktów⁷. Co więcej, metoda ta może wykorzystywać dostępne białka fluorescencyjne, luminescencję i barwniki, aby uzyskać kompleksowy obraz interakcji bakteryjnych⁸, a także śledzić syntezę bioproduktów (np. P. aeruginosa rhamnolipid ^7,8) w roju.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki do oznaczania roju i inokulacja^4,5,7,8,11

1. Przygotowanie podłoża
   UWAGA: Opisany poniżej skład pożywki ma zastosowanie do badań nad tworzeniem się wąsów P. aeruginosa. Proszę zapoznać się ze specyfikacjami pożywek w tabeli 1 dla testów ruchliwości powierzchni P. aeruginosa, B. subtilis i M. xanthus.
   1. Wymieszać 200 ml pożywki rojowej FAB-minus (NH₄)₂SO₄ (tabela materiałów), 0,9 g agaru szlachetnego i 0,2 g kwasów Casamino (tabela 1), mieszając z mieszadłem magnetycznym. Używaj małych objętości (100-300 ml), aby poprawić spójność między eksperymentami.
   2. Autoklawować mieszaninę agaru i pożywki o pojemności 200 ml, stosując czas ekspozycji 22 minuty, temperaturę ekspozycji 121,1 °C i opcję szybkiego odpowietrzania. Ustawienia autoklawu pozwolą na prawidłową sterylizację i stopienie agaru, ale zapobiegną karmelizacji agaru.
      UWAGA: Agar szlachetny jest podatny na karmelizację; Ruchliwość bakterii jest zmieniona na karmelizowanym agarze .
   3. Natychmiast po zakończeniu cyklu sterylizacji zamknij nakrętkę butelki z pożywką, aby zapobiec utracie wody przez parowanie. Należy jednak pamiętać, że szczelne zamknięcie może spowodować efekt podobny do "uszczelniania próżniowego" na butelce.
   4. Schłodzić podłoże do temperatury 50 °C, mieszając w temperaturze pokojowej (RT) i dodać 2 ml sterylnego 1,2 M glukozy. Alternatywnie, umieścić pożywkę w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze 60 °C do momentu, gdy będzie gotowa do użycia (do 15 godzin później) i postępować zgodnie ze wskazaniami. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w pożywce, dokładnie wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego; Bąbelki na powierzchni agaru zapobiegną równomiernemu rojeniu.
      UWAGA: W przypadku innych testów, na tym etapie dodać składniki wrażliwe na ciepło, których nie można sterylizować w autoklawie, takie jak dodatkowe składniki odżywcze lub barwniki, w razie potrzeby (np. dodanie 8 μl barwnika Invitrogen Syto 63 na 100 ml stopionego agaru w celu zobrazowania M. xanthus, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach poniżej). Dodanie niektórych barwników może wpływać na wyjściowe zachowanie roju, które należy sprawdzić w porównaniu z kontrolą bez barwnika.
   5. W okapie laboratoryjnym podamy 7,5 ml sterylnego podłoża na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 60 mm i utrzymywać płytki w jednej warstwie (nie ułożone w stos). W przypadku większej powierzchni roju należy podać 25 ml pożywki na szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Ważne jest, aby napełniać naczynia na równej poziomej powierzchni. Użyj poziomicy byka, aby sprawdzić, czy powierzchnia jest wyrównana.
      UWAGA: W przypadku testów P. aeruginosa użycie określonej objętości pożywki na płytkę poprawi spójność i odtwarzalność. W przypadku testów B. subtilis i M. xanthus nalewanie ręczne daje wyniki porównywalne z podwielokrotnościami objętości właściwej.
2. Utwardzanie płyt
   1. W przypadku małych płytek (60 mm) pozwól stopionej pożywce agarowej utwardzić się (zarówno ustawionej na półpłynną, jak i suchej nadmiarowej cieczy) w okapie bez przykrycia (tj. bez pokrywek) przez 30 minut. Większe płytki (100 mm) wymagają dłuższego czasu utwardzania (patrz Dyskusja).
      UWAGA: Alternatywnie, niektóre testy mogą wymagać utwardzania płytek na blacie stołu przez noc (20-24 godziny) przykrytych (tj. z pokrywkami) w jednej warstwie (Tabela 1). Rój jest wrażliwy zarówno na nadmiar, jak i nieodpowiednią wilgotność. Wilgotność, przepływ powietrza i temperatura w danym laboratorium mogą wymagać zmian w utwardzaniu płytki, aby zapewnić optymalne rozprzestrzenianie się bakterii.
   2. Zaszczepić płytki natychmiast po zakończeniu okresu suszenia. Nie przechowuj płytek do dalszego użytku.
      1. Wykonaj "test rozprzestrzeniania się atramentu", nakrapiając płytkę testową mieszaniną 10 μl 0,50% (obj./obj.) wodoodpornego czarnego atramentu indyjskiego Higginsa i inokulum^{bakteryjnego 11}. Jeśli mieszanina tuszu i inokulum łatwo się rozprowadza (tj. nie zachowuje postaci kropel) na powierzchni podłoża, podłoże będzie potrzebowało dodatkowego czasu na wyschnięcie.
         UWAGA: W przypadku gatunków, które są szczególnie wrażliwe na wilgoć (np. P. aeruginosa), należy wykonać szybki "test rozprowadzania atramentu"¹¹, aby określić, czy płytki są wystarczająco suche.
3. Inokulacja testem roju
   1. Zaszczepić 6 ml pożywki bulionowej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1) wyizolowaną kolonią ze świeżej (< 5-dniowej kultury bulionowej (LB) na płytce bulionu lizogenicznego (LB). Inkubować kultury bulionowe przez noc (≤18 godz.) w temperaturze 30 °C lub 37 °C z wytrząsaniem poziomym (240 obr./min).
   2. Zaszczepić płytki roju przez plamienie 1-5 μl nocnej kultury bulionowej lub przez "nakłucie" agaru sterylną wykałaczką lub drucianą igłą do zaszczepiania.
      UWAGA: Preferujemy tę drugą metodę, ponieważ zmniejsza ona prawdopodobieństwo rozpryskiwania inokulum i zapobiega dodawaniu dodatkowej wilgoci do powierzchni roju.
4. Inkubacja testu roju
   1. W przypadku testu ogólnego inkubować płytki do oznaczania roju w temperaturze 30 °C lub 37 °C (lub nawet 42 °C w przypadku B. subtilis; Tabela 1)—Jest to specyficzne dla bakterii. Podczas inkubacji należy odwrócić płytki, aby nadmiar wilgoci skondensował się na pokrywce, a nie na agarze
      UWAGA: Temperatura może wpływać zarówno na fenotyp, jak i na kinetykę. W przypadku rojów P. aeruginosa inkubacja w temperaturze 37 °C prowadzi do szybszego wzrostu i ekspansji roju niż inkubacja w temperaturze 30 °C; Jednak morfologia tych rojów często różni się wraz z tą zmianą temperatury.
   2. W przypadku obrazowania poklatkowego należy inkubować płytki roju w odpowiedniej temperaturze przed przeniesieniem do stacji obrazowania (szczegóły w Tabeli 1).
      UWAGA: Ta inkubacja przed obrazowaniem pozwala rojom rozpocząć rozwój i zadomowić się przed przeniesieniem do nowego środowiska, które może, ale nie musi, być optymalne dla ruchliwości roju.

2. Makroskopowe obrazowanie testów ruchliwości powierzchni^7,8

1. W przypadku obrazowania poklatkowego, po okresie inkubacji przed obrazowaniem należy umieścić płytki testowe roju na przezroczystej płytce obrazowej wewnątrz komercyjnej stacji obrazowania in vivo. Obraz do sześciu płyt o średnicy 60 mm lub czterech płyt o średnicy 100 mm jednocześnie. Ponieważ kamera rejestruje obrazy spod płaszczyzny obrazowania, należy odwrócić płytki, aby ścieżka optyczna nie była zasłonięta⁸. Alternatywnie, inkubować w temperaturze 30 °C lub 37 °C (tabela 1) przez czas trwania doświadczenia i wyjmować z inkubatora płytki do obrazowania w ustalonych odstępach czasu.
2. Umieść pokrywki szalek Petriego pionowo na wierzchu talerza, na którym znajdują się zaszczepione pożywki. Napełnij pokrywki szalek Petriego wodą, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu podczas obrazowania, i zamknij cały zestaw za pomocą innej przezroczystej tacy, aby utrzymać wilgotność przez cały czas trwania eksperymentu.
3. Korzystając z oprogramowania do obrazowania molekularnego (MI)¹², uruchom test (testy) w temperaturze pokojowej, korzystając z ustawień obrazowania opisanych w Tabeli 2. W przypadku obrazowania poklatkowego skonfiguruj protokół z niezbędnymi krokami i specyfikacjami.

3. Przetwarzanie i interpretacja danych^7,8

1. Przetwarzanie obrazu
   1. Użyj oprogramowania MI, aby wsadowo eksportować obrazy jako 16-bitowe pliki TIFF: Plik > Eksportuj lub Eksportuj wiele > Wybierz plik(i) do eksportu i lokalizacji eksportu.
   2. Użyj ImageJ, aby otworzyć pojedynczy obraz lub zaimportować serię poklatkową:
      1. Otwieranie pojedynczego obrazu: Plik > Otwórz
      2. Importuj sekwencję obrazów poklatkowych: Plik > Importuj sekwencję i wybierz "Sortuj nazwy numerycznie".
         1. W przypadku większych plików poklatkowych wybierz opcję "Użyj wirtualnego stosu" w oknie "Importuj sekwencję", aby ułożyć wyeksportowane obrazy w odpowiednie kategorie (np. GFP, RFP itp.).
   3. W razie potrzeby zmień obrazy z plików 16-bitowych na pliki 8-bitowe: Typ > obrazu > 8-bit
      UWAGA: Niektóre narzędzia ImageJ wymagają obrazów 8-bitowych.
   4. Określ, czy sygnał intensywności obrazu lub sekwencji poklatkowej musi zostać odwrócony. Umieść kursor w jasnym miejscu na obrazie (np. fluorescencyjnie oznaczony wzrost) i zanotuj intensywność sygnału "Wartość" z paska narzędzi ImageJ. Następnie umieść kursor w ciemnym miejscu poza obszarem płyty i zanotuj intensywność sygnału. Jeśli intensywność sygnału dla ciemnej plamki jest większa niż intensywność dla jasnej plamy, intensywność sygnału obrazu musi zostać odwrócona (wykonaj podkroki 1-2 poniżej).
      1. Odwróć sygnały intensywności: Edytuj > Odwróć
      2. Odwracanie tabeli przeglądowej: Obraz > Tabele przeglądowe > Odwróć LUT
   5. Odejmij tło: Przetwarzaj > odejmij tło i użyj "promienia toczącej się kuli" z promieniem piksela równym połowie jednego wymiaru obrazu (np. 1 000 pikseli dla obrazu o wymiarach 2 000 x 2 000 pikseli).
   6. Sztucznie pokoloruj obraz lub sekwencję poklatkową: Obraz > tabele przeglądowe, a następnie wybierz odpowiedni kolor z opcji listy.
   7. W przypadku filmów z dwoma lub więcej kanałami należy scalić i zrównoważyć kolory przed zapisaniem jako filmu (Przetwarzanie obrazu, krok 8). Aby scalić obrazy, otwórz wszystkie stosy obrazów w ImageJ, a następnie wybierz opcję Obraz > Kolor > Scal kanały i przypisz każdy stos do kanału koloru.
   8. Zapisz sekwencję poklatkową jako film AVI lub QuickTime: Plik > Zapisz jako, a następnie wybierz żądany format i specyfikacje.
2. analiza danych
   1. Pozyskiwanie powierzchni powierzchni bakterii w celu ilościowego określenia szybkości ekspansji
      1. Otwórz obraz(y) w ImageJ
      2. Aby obliczyć średnicę płytki w pikselach, narysuj linię w poprzek środka płytki testowej za pomocą narzędzia "Prosty" z i zmierz jej długość: Analizuj > mierz
      3. Domyślną jednostką miary w ImageJ jest piksel. Współczynnik konwersji należy uzyskać, dzieląc średnicę płytki oznaczającej (np. 60 dla płytki o średnicy 60 mm) przez długość piksela uzyskaną w poprzednim kroku.
      4. Zmień jednostkę miary z piksela na mm: Właściwości > obrazu
         1. Zmień "Jednostkę długości" na "mm", a "Szerokość pikseli", "Wysokość piksela" i "Głębokość wokseli" na współczynnik konwersji obliczony w poprzednim kroku. Zaznacz pole "Globalne", aby zachować ten współczynnik konwersji dla wielu obrazów.
            UWAGA: Jeśli ImageJ zostanie zamknięty i ponownie otwarty lub pole widzenia obrazu zostanie zmienione (np. jeden obraz zostanie powiększony bardziej niż inny), należy ponownie obliczyć współczynnik konwersji. Alternatywnie, wykonaj wszystkie analizy w pikselach, a następnie przekonwertuj je na mm.
      5. Dla każdej klatki prześledź i zmierz obszar roju za pomocą narzędzia "Zaznaczenia odręczne" na pasku narzędzi, aby prześledzić kontur roju i zmierzyć obszar za pomocą: Analizuj > Mierz. Spowoduje to wygenerowanie dziennika pomiarów, który można zapisać do dalszej analizy w programie Microsoft Excel lub podobnych programach: Plik > Zapisz jako
   2. Pozyskiwanie intensywności wzrostu powierzchni bakterii w celu ilościowego określenia tempa wzrostu powierzchni
      1. Po odjęciu tła (Przetwarzanie obrazu, Krok 5) użyj ostatniej klatki sekwencji, aby określić maksymalny obszar roju (Analiza danych, Krok 1).
      2. Użyj narzędzia do zaznaczania "Owal" z paska narzędzi, aby narysować ramkę wokół wzrostu powierzchni bakterii.
      3. Ustaw średni pomiar intensywności pikseli w polu za pomocą: Analizuj > Ustaw pomiary i wybierz "Średnia wartość szarości".
      4. Aby uzyskać pomiary intensywności sygnału dla każdej klatki w sekwencji poklatkowej, natomiast na pierwszej klatce sekwencji przejdź do: Analizuj > mierz. Spowoduje to wygenerowanie dziennika pomiarów, który można zapisać do dalszej analizy w programie Microsoft Excel lub podobnych programach: Plik > Zapisz jako
   3. Alternatywa do poprzedniej sekcji (Analiza danych, Krok 2). Użyj wtyczki ImageJ Macros, aby skonfigurować i uruchomić skrypt pomiaru intensywności wzrostu powierzchni Macros.
      1. Skonfiguruj automatyczny skrypt pomiarowy, aby analizować wiele klatek jednocześnie: Wtyczka > Nowe makro >, a następnie wklej dostarczony skrypt (poniżej) w polu i zapisz jako plik tekstowy makr ImageJ: Plik > Zapisz i zapisz w folderze aplikacji ImageJ w folderze "macros".
         liczbaRamek = N
         for(i=0; i< liczbaOfFrames; i++){
         run('Miara');
         run('Następny plasterek [>]');
         }
         UWAGA: W tym przypadku zmienna "N" jest przeznaczona dla nieokreślonej liczby klatek.
      2. Edytuj wartość "numberOfFrames" we wtyczce Macros dla każdego eksperymentu, aby odzwierciedlić liczbę klatek w sekwencji obrazu przed uruchomieniem skryptu. Użyj: Wtyczka > Makra > Edytuj, wpisz odpowiednią liczbę klatek w sekwencji i zapisz (Plik > Zapisz).
      3. Wykonaj kroki podrzędne 1-3 w Analiza danych-Krok 2 i będąc w pierwszej klatce sekwencji, uruchom wtyczkę Makra: Plugin > Macros > Run. Spowoduje to wygenerowanie dziennika pomiarów, który można zapisać do dalszej analizy w programie Microsoft Excel lub podobnych programach: Plik > Zapisz jako

Wyniki

Różnice w przygotowaniu płytek mogą w znacznym stopniu wpływać na ruchliwość rojową (swarming). Czas utwardzania lub suszenia po wylaniu stopionego podłoża agarowego wpływa na cienki film ciekły obecny w testach ruchliwości powierzchniowej oraz na ruchliwość bakterii w czasie. Zmiany w składzie składników odżywczych również wpływają na swarming u wielu bakterii. Rycina 1A przedstawia krótkotrwały efekt czasu suszenia na rozprzestrzenianie się tuszu indyjskiego oraz rozprzestrzenianie się początkowego inokulum Bacillus subtilis¹¹. Rycina 1B pokazuje wpływ czasu suszenia, a Rycina1C przedstawia wpływ siarczanu amonu [(NH₄)₂SO₄] na późniejszy rozwój wypustek (tendrils) podczas swarmingu P. aeruginosa⁵.

Ilościowe dane można uzyskać z obrazów końcowych ruchliwości powierzchniowej, stosując wiele strategii obrazowania. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne wyniki wzrostu powierzchniowego dla swarmingu P. aeruginosa oraz powiązany z nim obraz fluorescencji GFP; swarmingu B. subtilis oraz powiązany z nim obraz bioluminescencji; oraz wzrostu powierzchniowego Myxococcus xanthus i powiązany z nim obraz czerwonej fluorescencji komórek barwionych SYTO 64.

Rozszerzenie zakresu pozyskiwania danych poza samą inspekcję i obrazowanie wyników końcowych umożliwia badanie dynamicznych zachowań bakterii rosnących na powierzchni. Rysunek 3⁷ przedstawia przykład rojenia P. aeruginosa (obrazowanie komórek ekspresyjnych GFP) oraz powiązaną z nim produkcję ramnolipidów (obrazowanie przy użyciu barwnika lipidowego Nile Red) — przedstawiono również kwantyfikację danych z tych obrazów, aby ukazać tempo ekspansji rojenia P. aeruginosa. Wideo 1 pokazuje nagranie time-lapse rojenia B. subtilis obrazowane z wykorzystaniem luminescencji szczepu ekspresyjnego lux. Wideo 2⁸ przedstawia nagranie time-lapse P. aeruginosa (kolor zielony — ekspresja GFP) oraz Salmonella enterica serovar Typhimurium (kolor czerwony — ekspresja lux) w konkurencyjnym teście rojenia.

Rycina 1: Przykłady czynników w przygotowaniu testu ruchliwości powierzchniowej, które wpływają na wynik analizy. Wpływ (A) czasu schnięcia agaru na wilgotność powierzchni agaru i rozprzestrzenianie się inokulum B. subtilis (Ref⁸), (B) czasu schnięcia agaru na ruchliwość swarmingową P. aeruginosa (powtórzone z Ref⁵ za zgodą autora) oraz (C) obecności lub braku siarczanu amonu na ruchliwość swarmingową i tworzenie wypustek przez P. aeruginosa.

Rysunek 2: Alternatywne podejścia do obrazowania wzrostu powierzchniowego i ruchliwości bakterii przy użyciu stacji obrazowania Bruker. Zestawienie obrazu z kamery (po lewej) i obrazu z systemu Bruker (po prawej), przedstawiających (A) P. aeruginosa wyrażający GFP—obrazowany przy użyciu ustawień zielonej fluorescencji, (B) *B. subtilis* ekspresja luks reporter bioluminescencyjny — obrazowany przy użyciu ustawień luminescencji, i (C) M. xanthus barwione SYTO 64 — obrazowane przy użyciu ustawień Red Fluorescence II. Patrz Tabela 2 w celu uzyskania szczegółowych ustawień.

Rycina 3: Jakościowa i ilościowa analiza testu ruchliwości powierzchniowej. (A) Analiza time-lapse rozkładu gęstości komórek, produkcji ramnolipidów (barwienie lipidów Nile Red obrazowane przy użyciu ustawień Red Fluorescence I; pasek skali = 15 mm) oraz (B) ilościowe określenie szybkości ekspansji na podstawie obrazów rozkładu gęstości komórek w kolonii P. aeruginosa. (Przedrukowano z Ref⁶ za zgodą autora.)

Wideo 1. Obrazowanie time-lapse roju B. subtilis. B. subtilis wykazujący ekspresję lux, zarejestrowany przy użyciu ustawień luminescencji. Szczegóły ustawień znajdują się w Tabeli 2.

Wideo 2. Wizualizacja konkurencji międzygatunkowej za pomocą obrazowania poklatkowego. Rroje P. aeruginosa (zielone; wykazujące ekspresję GFP, zarejestrowane przy użyciu ustawień fluorescencji zielonej) oraz S. enterica serowaru Typhimurium (czerwone; wykazujące ekspresję lux, zarejestrowane przy użyciu ustawień luminescencji). Szczegóły ustawień znajdują się w Tabeli 2. (Przedrukowano za zgodą z Ref⁷.)

	P. aeruginosa	Badania nad tworzeniem wypustek (tendrils) P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Pożywka do nocnej hodowli w bulionie	FAB plus 30 mM Glucose	FAB plus 30 mM Glucose	LB	CTT
Temperatura inkubacji nocnej hodowli w bulionie	37 °C	37 °C	37 °C	30 hr przy 30 °C
Pożywka do swarmingu	FAB	FAB minus (NH4)2SO4	2% (wt/vol) LB	CTT
Pożywka do swarmingu: dodatkowe składniki	12 mM Glucosea	10% (wt/vol) CAA, 12 mM Glucosea	n/a	SYTO® 64a
Typ agaru	Agar, Noble	Agar, Noble	Agar granulowany	Agar, Noble Affymetrix
Stężenie agaru (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Rozmiar płytki do swarmingu	60 mm	60 mm	100 mm	150 mm
Objętość pożywki na płytkę	7.5 ml	7.5 ml	Wlewanie ręczne	Wlewanie ręczne
Metoda zestalania/suszenia pożywki do swarmingu	Dygestorium; płytki nieprzykryte	Dygestorium; płytki nieprzykryte	Blat laboratoryjny; płytki przykryte	Blat laboratoryjny; płytki przykryte
Czas zestalania/suszenia pożywki do swarmingu	30 min	30 min	Nocnie (20 -24 hr)	Nocnie (20 -24 hr)
Temperatura inkubacji w teście swarmingu	30 lub 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Inkubacja do obrazowania time-lapse	30 °C przez co najmniej 4 hr	30 °C przez co najmniej 4 hr	37 °C przez 2 hr	RT przez 12 hr
Czas trwania rejestracji time-lapse	24 hr	24 hr	10 hr	66 hr
Ustawienia time-lapse	1 klatka/10 min	1 klatka/10 min	1 klatka/6 min	1 klatka/10 min
aDodane po autoklawowaniu.

Tabela 1: Specyfikacje przygotowania testu ruchliwości powierzchniowej. Zawiera specyfikacje przygotowania testu ruchliwości powierzchniowej dla P. aeruginosa, B. subtilis oraz M. xanthus.

Sygnał	Zielona fluorescencja	Czerwona fluorescencja I	Czerwona fluorescencja II	Luminescencja
Białko lub barwnik	Zielone białko fluorescencyjne (GFP)	białko mCherry lub barwnik do ramnolipidów Nile Red	SYTO® 64	Lucyferaza z luks operon
Długość fali wzbudzenia (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Wyłączone
Długość fali emisji (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Bez filtra
Czas ekspozycji (s)	30	60	60	240
f-zatrzymaj	4.0	4.0	2.5	1.1
pole widzenia (mm)	190	190	140	120
Płaszczyzna ogniskowa (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binowanie (piksele)	Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.	2 x 2	Jako że nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych i edukacyjnych JoVE.	8 x 8

Tabela 2: Specyfikacja obrazowania. Specyfikacje stacji obrazowania Bruker dla fluorescencji czerwonej i zielonej oraz obrazowania luminescencyjnego wzrostu powierzchniowego bakterii.

Dyskusja

Osiągnięcie powtarzalnego roju w laboratorium może być wyzwaniem, ponieważ testy roju są bardzo wrażliwe na czynniki środowiskowe, takie jak wilgotność i dostępne składniki odżywcze. Najbardziej krytycznym aspektem testu ruchliwości powierzchni płytki jest wilgoć na powierzchni agaru. Przed inokulacją pożywka roju musi być wystarczająco sucha, aby zapobiec przepływaniu komórek bakteryjnych po cieczy powierzchniowej, ale nie na tyle sucha, aby zahamować ruchliwość roju⁵. Inkubacja powinna odbywać się w wystarczająco wilgotnym środowisku: zbyt mała wilgotność może spowodować wysychanie testu podczas inkubacji, podczas gdy zbyt duża wilgotność może prowadzić do sztucznego lub sztucznego rozprzestrzeniania się powierzchni. Jeśli nie masz pod ręką inkubatora z kontrolowaną wilgotnością, wilgotność w inkubatorze i laboratorium może się znacznie różnić. W związku z tym może być wymagany dodatkowy zbiornik na wodę, nawilżacz lub osuszacz w inkubatorze, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu lub gromadzeniu się nadmiaru wilgoci przy jednoczesnym utrzymaniu wilgotności względnej w pobliżu 80%. Utrzymanie tej idealnej wilgotności może okazać się trudne, jeśli sezonowe zmiany wilgotności są znaczące. W takim przypadku protokół testu roju będzie wymagał pewnych korekt w celu uwzględnienia sezonowych zmian wilgotności. Odkryliśmy, że modyfikacja czasu schnięcia roju jest najprostszym sposobem dostosowania się do sezonowych zmian wilgotności. Zaleca się stałe monitorowanie wilgotności, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz inkubatora. Ponadto zaleca się, aby naukowcy skalibrowali i zwalidowali swoje instrumenty, inkubatory, wagi itp. ponieważ drobne błędy w temperaturze, objętości lub ilości składników pożywki mogą mieć wpływ na odtwarzalność tych testów.

Należy również zauważyć, że rodzaj i rozmiar płytki użytej w teście może wpływać na wilgotność płytki, a tym samym na rojenie się. Hermetyczne płyty nie odprowadzają nadmiaru wilgoci, sprzyjając w ten sposób ruchliwości pływania. Natomiast otwarte płyty pozwalają na ucieczkę zbyt dużej ilości wilgoci. Szalka Petriego zapewnia idealne środowisko, ponieważ odprowadza wystarczającą ilość nadmiaru wilgoci, aby zapobiec gromadzeniu się cieczy, ale zachowuje wystarczającą ilość wilgoci, aby zapobiec wysychaniu podłoża. Metoda ta szczegółowo opisuje protokół oznaczania ruchliwości powierzchni, który pozwala na obrazowanie wysokiej jakości. Aby agar był czysty do obrazowania, szalki o średnicy 60 mm napełnia się 7,5 ml podłoża agarowego. Jeśli szczegółowe obrazowanie nie jest wymagane, objętości do 20 ml mogą również zapewnić powtarzalne wyniki.

Podczas gdy ruchliwość roju można osiągnąć przy szerokiej gamie stężeń agaru, optymalny zakres agaru wymagany do roju zależy od gatunku. Ogólnie rzecz biorąc, wyższe stężenia agaru hamują ruchliwość roju, a w konsekwencji wydłuża się czas potrzebny do wytworzenia roju gotowego do obrazu. P. aeruginosa na ogół roi się przy stężeniach agaru między 0,4-0,7%¹, jednak okazuje się, że optymalne rój występuje w znacznie węższym zakresie (0,4-0,5%). Inne, takie jak B. subtilis i S. enterica , roją się w 0,6% agarze i Vibrio parahaemolyticus w 1,5% agarze¹⁰. Wymagane stężenie agaru zależy również od rodzaju i marki agaru. Agary o wyższej czystości, takie jak agar szlachetny, silnie zwiększają rój się w P. aeruginosa i są preferowane w stosunku do agaru granulowanego^13,14. Jednak te oczyszczone wersje agaru są również bardziej podatne na karmelizację podczas cyklu sterylizacji w autoklawie; w zależności od instrumentu, może być wymagana skrócona/zmodyfikowana sekwencja sterylizacji (w celu ewentualnej zmiany cyklu wydechu, aby zapobiec długotrwałemu narażeniu na ciepło) w celu przygotowania pożywki rojowej przy użyciu agaru Noble.

Skład pożywki również odgrywa rolę w obserwowanym fenotypie^{roju 3}. Badania ruchliwości roju P. aeruginosa są zwykle wykonywane przy użyciu minimalnej ilości pożywek. Preferujemy pożywkę FAB^4,8 (Tabela materiałów ), ale inne media, takie jak M9, LB lub niewielkie odmiany tych popularnych mediów, są z powodzeniem stosowane^9,15,16. Tworzenie wąsów najlepiej osiągnąć na minimalnym pożywce FAB uzupełnionej glukozą jako źródłem węgla i kasaminokwasami (CAA), ale bez dodatkowego źródła azotu (tj. (NH₄)₂SO₄)^6,13. Jeśli tworzenie wąsów lub morfologia nie jest głównym celem badania, wówczas pożywka minimalna FAB (Tabela materiałów ; Tabela 1) pozbawiony CAA jest zalecany, aby można było szczegółowo zbadać wpływ określonych źródeł węgla i/lub dodatkowych składników odżywczych. Inne gatunki, takie jak B. subtilis (prezentowany tutaj), są wszechstronnymi rojami, zdolnymi do rojenia się na LB i granulowanym agarze. Gatunki te roją się łatwo, potrzebując tylko ~10 godzin, aby rozwinąć pełny rój. To szybkie tempo roju sprawia, że śledzenie postępu roju jest potencjalnie trudne, ale nasz protokół sprawia, że takie śledzenie jest bardzo wykonalne. Możliwość wykonywania obrazowania poklatkowego roju zapewnia znaczną łatwość w pozyskiwaniu danych z roju, szczególnie od tak zapalonych rojów.

Wprowadzamy solidny, kompleksowy, dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu poprawę wykonania i odtwarzalności badań ruchliwości powierzchni bakterii, a przede wszystkim położyliśmy nacisk na aspekty ważne dla zbadania roju za pośrednictwem wici. Ten protokół testu roju szczegółowo opisuje ważne aspekty składu pożywek i obchodzenia się z płytkami ruchliwości powierzchni, aby zapewnić większą spójność i odtwarzalność w grupach badawczych i między nimi. Poprawi to podstawę porównań między różnymi badaniami naukowymi. Ponadto przedstawione podejście i protokół zapewniają środki, które mają sprawić, że badania nad rojem i ruchliwością powierzchni będą mniej podatne na zmiany środowiskowe poprzez uświadomienie badaczom, że takie czynniki wpływają na ich pracę i dostarczenie możliwych rozwiązań (np. jak małe zmiany w agarze wpływają na rój^4,5). Co więcej, protokół dostarczony w celu ilościowego określenia makroskopowych aspektów roju daje możliwość zmierzenia wielu atrybutów wzrostu powierzchni bakterii, które wcześniej były niewymierne.

Nie zbadaliśmy wszystkich bakterii ruchliwych powierzchniowo podczas opracowywania tego protokołu. W związku z tym oczekuje się, że w odniesieniu do gatunków, które nie zostały tutaj przedstawione, konieczne będą modyfikacje protokołu. Skuteczność tego protokołu jest ograniczona przez nieodłączne ograniczenia zastosowanego sprzętu i materiałów. Na przykład badania związane z temperaturą nie są jeszcze możliwe w przypadku stacji obrazowania Bruker, ponieważ kontrola temperatury nie jest cechą urządzenia. Ponadto stosowanie barwników (takich jak czerwień nilowa do barwienia ramnolipidów) może mieć ograniczenia kinetyczne i stężenia⁸. Technika ta w dużym stopniu opiera się na przetwarzaniu i analizie obrazów cyfrowych; Ulepszona automatyzacja analizy danych (np. wykorzystanie dodatkowej funkcji skryptu makr w ImageJ) skróciłaby czas potrzebny na analizę i zwiększyłaby użyteczność danych. Wreszcie, ze względu na solidność protokołu obrazowania, przyszłe zastosowania powinny mieć na celu rozszerzenie tej techniki w celu zbadania mniej jednorodnych powierzchni wzrostu, które są bardziej istotne dla powierzchni skolonizowanych przez bakterie środowiskowe i chorobotwórcze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagentsa
FAB Minimal Media:			Przygotuj co ~4 tygodnie. Od góry do 1  L z nanoczystym H2O.
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g. Niestosowany w badaniach nad powstawaniem wąsów P. aeruginosa.
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O roztwór (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O roztwór (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
roztwór metali śladowych (patrz poniżej)	n/d	nie dotyczy	1 ml
Śladowy roztwór metalu:			Uzupełnij do 1 l nanoczystym H2O. Przechowywać w szklanej butelce, mieszając i przykryć folią.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT Podłoże:			Przygotuj w razie potrzeby. Uzupełnić do 100 ml nanoczystym H2O.
Tris-HCl, 1 M roztwór (dostosować do pH 8,0)	Amresco	0234	1 ml. Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystym H2O. Dostosuj pH do 8,0 i sterylizuj filtrem (0,2 i #956; m porów).
K2HPO4, 1 M roztwór (dostosować do pH 7,6)	Sigma-Aldrich	P3786	0,1 ml. Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystym H2O. Dostosuj pH do 7,6 i sterylizuj filtrem (0,2 i #956; m porów).
MgSO4 roztwór	Fisher Scientific	M65	0,8 ml. Przygotować 1 M roztwór podstawowy w nano czystym H2O. Sterylizować filtr (0,2  μ m porów).
Casitone	BD Diagnostics	225930	1 g
Dodatkowe odczynniki:
LB Broth, Lennox	BD Diagnostics	240230	2% (wt/vol)
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM do nocnych kultur bulionowych; 12 mM do pożywek rojowych. Przygotować 1,2 M wysterylizowany roztwór podstawowy z filtrem w nano czystym H2O. Dodać do podłoża po autoklawowaniu.
Casaminokwasy (CAA)	Amresco	J851	0,10% (wag./obj.). Zalecany do badań nad powstawaniem wąsów P. aeruginosa. Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0,45% (wag./obj.). Preferowany agar szlachetny do badań ruchliwości powierzchni P. aeruginosa. Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar, Noble	Affymetrix	10907	1,50% (wag./obj.). Stosowany w badaniach ruchliwości powierzchni M. xanthus. Nie zaleca się stosowania w badaniach ruchliwości P. aeruginosa. Dodaj do podłoża przed autoklawowaniem.
Agar, granulowany	Fisher Scientific	BP1423	0,60% (wag./obj.)
Higgins Wodoodporny atrament	indyjski Higgins	HIG44201	0.50% (obj./obj). Wymieszaj atrament z inokulum, aby przetestować wilgotność powierzchni roju mediów.
SYTO® 64 Czerwony fluorescencyjny barwnik kwasów nukleinowych	Invitrogen	S-11346	Użyj 4 i # 956; l (dla P. aeruginosa) lub 8 μ l (dla M. xanthus) z SYTO® 64 na 100 ml stopionego agaru (dodanego po autoklawowaniu).
Odpowiednie materiały i sprzęt
szalka Petriego, sterylna, 150  mm x 15 mm (śr. x wys.)	VWR	25384-326
Szalka Petriego, sterylna, 100  mm x 15 mm (śr. x wys.)	VWR	25384-342
Szalka Petriego, sterylna, 60 mm x 15 mm (śr. x wys.)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker		Służy do makroskopowego obrazowania badań ruchliwości powierzchni. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
Oprogramowanie MI firmy Bruker			http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
Oprogramowanie ImageJ	NIH		http://imagej.nih.gov/ij/
aZobacz karty charakterystyki odczynników, aby uzyskać informacje na temat obchodzenia się i utylizacji.