Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Streszczenie

Jako podtyp leukocytów i protoplasty makrofagów, monocyty biorą udział w wielu ważnych procesach organizmu i często są przedmiotem różnych dziedzin nauk biomedycznych. Opisana poniżej metoda to prosty i skuteczny sposób izolowania mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego.

Szpik kostny z kości udowej i piszczelowej myszy Balb/c jest pobierany przez płukanie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Zawiesina komórkowa jest uzupełniana czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i hodowana na bardzo niskich powierzchniach przylegających, aby uniknąć różnicowania monocytów wywołanego adhezją. Właściwości i różnicowanie monocytów są charakteryzowane w różnych odstępach czasu. Do fenotypowania stosuje się sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), z markerami takimi jak CD11b, CD115 i F4/80. Pod koniec hodowli zawiesina składa się w 45%± 12% z monocytów. Usuwając makrofagi adhezyjne, czystość można zwiększyć do 86%± 6%. Po izolacji monocyty mogą być wykorzystywane na różne sposoby, a jedną z najskuteczniejszych i najpowszechniejszych metod dostarczania in vivo jest dożylne wstrzyknięcie żyły ogonowej.

Ta technika izolacji i zastosowania jest ważna dla badań na modelach mysich, szczególnie w dziedzinie zapalenia lub immunologii. Monocyty mogą być również stosowane terapeutycznie w modelach chorób myszy.

Wprowadzenie

Izolacja monocytów jest ważna i krytyczna dla wielu badań in vitro i in vivo. Komórki te są celem chorób, takich jak choroba tętnic obwodowych, choroba niedokrwienna serca lub inne choroby niedokrwienne, ponieważ wzrost naczyń pobocznych jest silnie napędzany przez miejscowy stan zapalny. Reakcje zapalne obejmują aktywację śródbłonka i miejscową rekrutację leukocytów, głównie monocytów, które następnie dojrzewają do makrofagów i tworzą wysoce tętnicze środowisko poprzez wydzielanie wielu czynników wzrostu w celu wywołania przebudowy tętniczki w funkcjonalną tętnicę poboczną^1-3. Monocyty dojrzewają również do komórek dendrytycznych, które są często wykorzystywane do badań immunologicznych^4,5 i badań nad rakiem^6,7.

Problematyczne w podejściu do izolacji monocytów z krwi obwodowej⁸ jest duża liczba zwierząt dawców potrzebnych do wyprodukowania wystarczającej ilości monocytów dla większości analiz. Poprzednie protokoły opisują takie metody, jak wirowanie w gradionym gradimencie gęstości i zubożenie komórek za pomocą MACS⁹ podczas izolowania monocytów; Jednak techniki te mogą zmieniać charakterystykę i funkcjonalność monocytów, co może prowadzić do trudności w interpretacji^10,11. Co więcej, metody te są trudne i mogą zmniejszyć odtwarzalność eksperymentalną.

Naszym celem w tym protokole jest dostarczenie prostej i opłacalnej metody generowania dużych ilości monocytów pochodzących ze szpiku kostnego. Ze względu na wysoką wydajność komórek 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ uzyskanych za pomocą tego protokołu, możemy znacznie zmniejszyć liczbę myszy wymaganych podczas izolacji monocytów pochodzących ze szpiku kostnego. Procedurę można wykonać w minimalnym czasie i bez użycia drogich i skomplikowanych technik, o których mowa powyżej. Tutaj ekstrahujemy monocyty z natywnej zawiesiny szpiku kostnego myszy dawców, hodujemy zawiesinę na ultraniskich płytkach mocujących i uzupełniamy roztwór o 20 ng / ml M-CFS. W 5 dniu inkubacji komórki są zbierane i charakteryzowane w celu potwierdzenia właściwości funkcjonalnych i fenotypowych.

Dla eksperymentów w dziedzinie arteriogenezy, dożylne przeszczepienie tych monocytów pochodzących ze szpiku kostnego do myszy jest skuteczną metodą dostarczania leków ogólnoustrojowych, które mogą być połączone z podwiązaniem tętnicy udowej w powszechnych modelach chorób tętnic obwodowych.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą kraju związkowego Saksonia i Saksonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden/Halle, zgodnie z sekcją 8 niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt (24D-9168.11-1/2008-24).

1 Izolacja komórek

1.1 Przygotowanie kości udowej i piszczelowej

1. Znieczulij mysz za pomocą 5% stężenia izofluranu, odparowując izofluran w zamkniętym pojemniku. Po tym, jak mysz przestanie się poruszać na 3 sekundy, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
2. Zdezynfekuj tylne kończyny etanolem (96%). Usuń skórę i mięśnie i oddziel kości sterylnym skalpelem.
   1. Zacznij od pachwinowego nacięcia skóry i przedłuż nacięcie w kierunku kostki przyśrodkowej i wykonaj okrężną sekcję skóry wokół dolnej części łydki. Całkowicie usuń skórę nóg, obierając ją proksymalnie.
   2. Odłącz mięsień czworogłowy uda od kości udowej ostrym skalpelem, usuń zarówno przednią część mięśnia strzałkowego, jak i mięśnie brzuchatego łydki i rozłącz nogę w stawie biodrowym, lokalizując i preparując więzadła.
   3. Zacznij od przodu i omijaj staw, ostrożnie obracając nogę i przecinając więzadła, rozczłonkowując w ten sposób staw
   .
3. Myj kość udową i piszczelową 96% etanolem przez co najmniej 90 sekund, aby zagwarantować aseptyczne przygotowanie komórek. Kontynuuj proces mycia sterylnym PBS, aby spłukać pozostały etanol.
   Uwaga: Wszystkie kolejne kroki muszą być sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia.

1.2 Pobieranie szpiku kostnego

1. Przetnij bliższy i dalszy koniec każdej kości za pomocą cienkich nożyczek, aby uzyskać dostęp do trzonów kości udowej i piszczelowej. Bądź ostrożny na tym kroku, ponieważ te kości bardzo łatwo się łamią.
2. Przepłukać kości ciepłym podłożem (M199 + 10% płodowa surowica cielęca (FCS), + 1% penicylina/streptomycyna). Do płukania należy użyć sterylnej igły 28 G, strzykawki o pojemności 1 ml i 10-15 ml podłoża na kość.
3. Przytrzymaj kość cienkimi kleszczami i płucz jeden po drugim, aż stanie się półprzezroczysta. Ostrożnie docisnąć końcówkę tłoka strzykawki, aby zminimalizować naprężenie komórek.
4. Przefiltrować szpik kostny przez wstęgę nylonową o grubości 70 μm i zebrać filtrat. Aby pobrać maksymalną ilość szpiku kostnego, należy kilkakrotnie przepłukać dystalny i proksymalny koniec.
5. Przepłukać sito PBS i zebrać filtrat. Ostrożnie usunąć zanieczyszczenia i konglomeraty komórkowe, delikatnie mieszając i pipetując.

1.3 Uprawa

1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w około 25 ml pożywki. Powtórz raz.
2. Ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki po drugim etapie płukania. Zmieszać 50 μl roztworu komórkowego z 50 μl błękitu trypanowego. Policz komórki w komorze liczącej pod mikroskopem świetlnym. Oblicz liczbę komórek w roztworze, korzystając z tego wzoru:
   
3. Wysiewaj komórki na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyleganiu, aby zapobiec trwałemu przyleganiu do dna płytki. Użyj stężenia 10-6 komórek na ml z maksymalnie 6 ml na studzienkę.
4. Uzupełnij zawiesinę o 20 ng/ml M-CSF, aby pobudzić różnicowanie komórek.
5. Hodować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla i obserwować codziennie.

1.4 Pobieranie komórek

Uwaga: Te kroki powinny być wykonywane na lodzie. Postępuj zgodnie z 1.4.1 lub 1.4.2.

1. W tym momencie zbierz całą kulturę, w tym zróżnicowane makrofagi, które będą przylegać do płytek hodowlanych, nawet jeśli są to płytki o bardzo niskiej przyczepności.
   1. Zebrać całą kulturę, delikatnie pipetując i odłączając roztworem o temperaturze 4 °C PBS, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA. Powtarzaj, aż płytki będą wolne od pozostałych przylegających komórek - potwierdź pod mikroskopem, jeśli nie masz pewności.
2. Alternatywnie, należy wyrzucić przylegające makrofagi, zbierając supernatant z komórkami w zawiesinie, które zawierają głównie monocyty.
   1. Zbierz nieprzylegające komórki roztworem PBS wolnego od EDTA i 0,5% BSA. Nie należy stosować zbyt dużej siły, aby uniknąć przemieszczenia się łagodnie przylegających makrofagów.

1.5 Analiza FACS (opcjonalnie)

Uwaga: Możliwe jest zmniejszenie zawiesiny komórek macierzystych i progenitorowych CD117⁺ za pomocą MACS. W tej procedurze należy użyć protokołów producenta.

1. Zebrać komórki zgodnie z krokami 1.4.1 lub 1.4.2.
2. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i powtórzyć ten krok ponownie.
3. Ponownie zawiesić co najmniej 250 000 komórek w 300 μl bufora FACS na sondę.
4. Przenieść roztwór komórek na 96-dołkową płytkę (30 μl na studzienkę).
5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Usunąć supernatant i dodać 25 μl przeciwciała do każdej studzienki (użyć rozcieńczenia producenta).
7. Wybarwić komórki przeciwciałami (zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi fenotypowania komórek po krokach 1.5.1-1.5.6. Powszechnie stosowane markery do identyfikacji monocytów / makrofagów obejmują CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2) i Gr-1.
   Uwaga: W celu dalszego opisu roztworów komórkowych zaleca się stosowanie markerów takich jak CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCII., Ly6C, Ly6G i CD192. Cechy komórkowe zostały wcześniej opisane¹².
8. Inkubować sondy przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
9. Odwirować sondy przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić z 200 μl buforu FACS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
10. Przenieś sondy do probówek FACS i wykonaj analizę FACS¹².
11. Wykonaj analizę FACS¹² w dniach 0, 3 i 5, aby przeanalizować różnicowanie komórek.

2. Iniekcja żyły ogonowej

2.1 Przygotowanie

1. Ogrzewaj zwierzęta na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C przez około 10 minut. Obserwuj zwierzęta podczas ogrzewania, aby rozpoznać oznaki przegrzania.
2. Zawiesić monocyty, wyizolowane w krokach 1.1-1.4, w 150 μl NaCl i załadować komórki do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 30G. Przed załadowaniem strzykawki należy lekko rozprowadzić roztwór w wirze, aby upewnić się, że wszystkie monocyty zostały wstrzyknięte. Zawsze dotykaj komórek na lodzie, aby uniknąć przyczepiania się i aktywacji monocytów za pośrednictwem ciepła.

2.2 Ograniczanie

1. Unikaj przeszkadzania innym myszom w klatce przy wyborze myszy do wstrzyknięcia dożylnego.
2. Umieść mysz w ograniczniku. Unikaj zbyt dużego nacisku i uważaj na tylne kończyny. (Rysunek 4)
   Uwaga: Alternatywnie należy zastosować znieczulenie ogólne, aby zagwarantować bezstresowe obchodzenie się ze zwierzętami.
3. Upewnij się, że mysz ma miejsce do oddychania przed zamknięciem ogranicznika.

2.3 Wtrysk

1. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia środkiem dezynfekującym. Spryskaj ogon myszy i odstaw na co najmniej 1 minutę.
2. Zatrzymać przepływ krwi żylnej przez ogon, wywierając delikatny nacisk na boczną stronę ogona powyżej miejsca wstrzyknięcia, aby uzyskać lepszą widoczność żył.
3. Obrócić ogon o 90 stopni przed wstrzyknięciem. (Rysunek 5)
4. Wstrzykiwać pod kątem 45 stopni. Wstrzykiwać powoli, nie więcej niż 5 μl na g, aby uniknąć szkody dla zwierząt.
5. W przypadku pojawienia się pęcherza, który jest oznaką nieudanego wstrzyknięcia, należy natychmiast przerwać wstrzykiwanie i powtórzyć wstrzyknięcie bardziej proksymalnie.
6. Krwawienie należy zatamować po stronie wstrzyknięcia, delikatnie uciskając przez około 1 minutę.
7. Pod koniec zabiegu otwórz zwijacz i umieść mysz w klatce.
8. Obserwuj mysz przez 20 minut, aby upewnić się, że zwierzę nie zostało uszkodzone w wyniku wstrzyknięcia i czy utrzymuje się pozycja leżąca mostka. Wydłuż czas obserwacji, aż mysz odzyska wystarczającą przytomność. Przywróć mysz do towarzystwa innych zwierząt dopiero po całkowitym wyzdrowieniu.

Wyniki

Roztwór komórkowy wyekstrahowany z mysiego szpiku kostnego składa się z różnych typów komórek. Głównymi typami komórek są limfocyty, granulocyty i monocyty. Typy komórek można oszacować na podstawie wielkości i ziarnistości, co pokazano na rysunku 1 zarówno dla zawiesin natywnych, jak i komórek zebranych po 5 dniach różnicowania. Zwróć uwagę na zmieniający się skład komórkowy podczas uprawy. Jednak dokładna klasyfikacja populacji musi opierać się na charakterystycznej ekspresji markerów komórkowych.

...

Dyskusja

Opisujemy prostą i opłacalną metodę izolowania dużych ilości mysich monocytów ze szpiku kostnego. W porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi krew obwodową, które uzyskują wydajność monocytów⁵ z 1,4 x10⁶, jesteśmy w stanie uzyskać wyższą wydajność 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ monocytów od jednej myszy dawcy.

Rozważając wyzwania związane z tą metodą, należy wspomnieć o możliwości zanieczyszczenia podczas pracy w warunkach niesterylnych. Jeśli płukanie i ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-dołkowa płytka o bardzo niskim mocowaniu	Corning Incorporated, NY, USA		6-dołkowa płytka o bardzo niskim mocowaniu, z nasadką, sterylna
8-12 tygodniowa, samiec, myszy balb/c	Charles River, Sulzfeld, Niemcy
96-dołkowa płytka	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Niemcy
Niebieskie barwienie martwych komórek	Life technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy
Albumina surowicy bydlęcej	GE Healthcare, Freiburg, Niemcy		Frakcja V, pH 7,0
Kanule	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Naczynie do hodowli komórkowych	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy		Z nakrętką, sterylną
wirówką	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Niemcy		Allegra® Wirówka X-15R
Krem do depilacji	Veet, Mannheim, Niemcy
Środek dezynfekujący	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Niemcy		Kodan Tinktur forte
Skalpel jednorazowy nr 10	Maszynka do golenia z piór Co.Ltd, Osaka, Japonia
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy
Etanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Niemcy
Jednostka ekstrakcyjna Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Niemcy
F4/80	AbD Serotec, Dü sseldorf, Niemcy	MCA497APC
bufor FACS	Produkowane przez naszą grupę z pojedynczych komponentów		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS Becton	, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Lampy		BD FACS Canto II
FACS	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone
Falcon® pipeta	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Surowica cielęca płodu	Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy
Cienkie kleszcze	Rubis, Stabio, Szwajcaria
Rękawiczki	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Niemcy
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Płyta grzewcza	Labotect GmbH, Gö ttingen, Niemcy		Inkubator Hot Plate 062
	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Niemcy		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Niemcy
Mikroskop świetlny	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Niemcy		Axiovert 40 ° C
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów	Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy	SRP3110
Wytrząsarka mechaniczna	IKA, Staufen, Niemcy		minishaker ms2
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem
Mikroprobówki	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy
Mikrobiologiczny stół roboczy	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Niemcy		Hera bezpieczny
bufor do płukania Monocyte	Produkowane przez naszą grupę z pojedynczych komponentów		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Ogranicznik myszy	Różne
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Niemcy
NaN3 (kwas sodu)	Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy
Komora licząca Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Sitko komórkowe, 70 i mikro; m rozmiar oczek
Penicylina/Streptomycyna	Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Life technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy		pH 7,4, sterylne
Pipety	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy		10µ L/100&Micro; L/200&MIKRO; l/1,000&mikro; l
Głowice pipetujące	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy
Pipeta serologiczna	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy		Cellstar 5 ml, 10 ml
Jednostka ssąca	Integra bioscience, Fernwald, Niemcy		Vacusafe comfort
Nożyczki chirurgiczne	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Strzykawka	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy		1 ml Strzykawka insulinowa Omnifix® -F
Probówki z nakrętką	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Niemcy		15 ml/50 ml Rurki
Cellstar Kąpiel w ciepłej wodzie	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Niemcy		Julabo SW22