Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jako podtyp leukocytów i protoplasty makrofagów, monocyty biorą udział w wielu ważnych procesach organizmu i często są przedmiotem różnych dziedzin nauk biomedycznych. Opisana poniżej metoda to prosty i skuteczny sposób izolowania mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego.
Szpik kostny z kości udowej i piszczelowej myszy Balb/c jest pobierany przez płukanie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Zawiesina komórkowa jest uzupełniana czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i hodowana na bardzo niskich powierzchniach przylegających, aby uniknąć różnicowania monocytów wywołanego adhezją. Właściwości i różnicowanie monocytów są charakteryzowane w różnych odstępach czasu. Do fenotypowania stosuje się sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), z markerami takimi jak CD11b, CD115 i F4/80. Pod koniec hodowli zawiesina składa się w 45%± 12% z monocytów. Usuwając makrofagi adhezyjne, czystość można zwiększyć do 86%± 6%. Po izolacji monocyty mogą być wykorzystywane na różne sposoby, a jedną z najskuteczniejszych i najpowszechniejszych metod dostarczania in vivo jest dożylne wstrzyknięcie żyły ogonowej.
Ta technika izolacji i zastosowania jest ważna dla badań na modelach mysich, szczególnie w dziedzinie zapalenia lub immunologii. Monocyty mogą być również stosowane terapeutycznie w modelach chorób myszy.
Wprowadzenie
Izolacja monocytów jest ważna i krytyczna dla wielu badań in vitro i in vivo. Komórki te są celem chorób, takich jak choroba tętnic obwodowych, choroba niedokrwienna serca lub inne choroby niedokrwienne, ponieważ wzrost naczyń pobocznych jest silnie napędzany przez miejscowy stan zapalny. Reakcje zapalne obejmują aktywację śródbłonka i miejscową rekrutację leukocytów, głównie monocytów, które następnie dojrzewają do makrofagów i tworzą wysoce tętnicze środowisko poprzez wydzielanie wielu czynników wzrostu w celu wywołania przebudowy tętniczki w funkcjonalną tętnicę poboczną1-3. Monocyty dojrzewają również do komórek dendrytycznych, które są często wykorzystywane do badań immunologicznych4,5 i badań nad rakiem6,7.
Problematyczne w podejściu do izolacji monocytów z krwi obwodowej8 jest duża liczba zwierząt dawców potrzebnych do wyprodukowania wystarczającej ilości monocytów dla większości analiz. Poprzednie protokoły opisują takie metody, jak wirowanie w gradionym gradimencie gęstości i zubożenie komórek za pomocą MACS9 podczas izolowania monocytów; Jednak techniki te mogą zmieniać charakterystykę i funkcjonalność monocytów, co może prowadzić do trudności w interpretacji10,11. Co więcej, metody te są trudne i mogą zmniejszyć odtwarzalność eksperymentalną.
Naszym celem w tym protokole jest dostarczenie prostej i opłacalnej metody generowania dużych ilości monocytów pochodzących ze szpiku kostnego. Ze względu na wysoką wydajność komórek 11 x 106 ± 3 x 106 uzyskanych za pomocą tego protokołu, możemy znacznie zmniejszyć liczbę myszy wymaganych podczas izolacji monocytów pochodzących ze szpiku kostnego. Procedurę można wykonać w minimalnym czasie i bez użycia drogich i skomplikowanych technik, o których mowa powyżej. Tutaj ekstrahujemy monocyty z natywnej zawiesiny szpiku kostnego myszy dawców, hodujemy zawiesinę na ultraniskich płytkach mocujących i uzupełniamy roztwór o 20 ng / ml M-CFS. W 5 dniu inkubacji komórki są zbierane i charakteryzowane w celu potwierdzenia właściwości funkcjonalnych i fenotypowych.
Dla eksperymentów w dziedzinie arteriogenezy, dożylne przeszczepienie tych monocytów pochodzących ze szpiku kostnego do myszy jest skuteczną metodą dostarczania leków ogólnoustrojowych, które mogą być połączone z podwiązaniem tętnicy udowej w powszechnych modelach chorób tętnic obwodowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą landów Saksonia oraz Saksonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden/Halle, zgodnie z sekcją 8 niemieckiej ustawy o ochronie zwierząt (24D-9168.11-1/2008-24).
1 Izolacja komórek
1.1 Przygotowanie kości udowej i piszczelowej
- Zanurzyć mysz w znieczuleniu przy użyciu 5% stężenia izofluranu poprzez odparowanie izofluranu w zamkniętym pojemniku. Po ustaniu ruchów myszy przez 3 sec, przeprowadzić zwichnięcie szyi.
- Zdezynfekować kończyny tylne etanolem (96%). Usunąć skórę oraz mięśnie i oddzielić kości za pomocą sterylnego skalpela.
- Rozpocząć od nacięcia skóry w pachwinie, przedłużyć nacięcie w kierunku kostki przyśrodkowej i przeprowadzić okrężną dyssekcję skóry wokół dolnej części łydki. Całkowicie usunąć skórę z nóg poprzez odwarstwianie jej w kierunku proksymalnym.
- Oddzielić mięsień czworogłowy uda od kości udowej ostrym skalpelem, usunąć grupy mięśni strzałkowych przednich oraz mięsień brzuchaty łydki i zwichnąć nogę w stawie biodrowym poprzez zlokalizowanie i przecięcie więzadeł.
- Rozpocząć od strony przedniej i obejść staw, ostrożnie obracając nogę i przecinając więzadła, w ten sposób zwichnąć staw.
- Przemyć kość udową oraz piszczel 96% etanolem przez minimum 90 sec, aby zagwarantować aseptyczne przygotowanie komórek. Kontynuować proces płukania sterylnym PBS w celu usunięcia pozostałego etanolu.
Uwaga: Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w warunkach sterylnych, aby uniknąć kontaminacji.
1.2 Pobieranie szpiku kostnego
- Odciąć końce proksymalne i dystalne każdej kości za pomocą precyzyjnych nożyczek, aby uzyskać dostęp do trzonów kości udowej i piszczelowej. Należy zachować ostrożność podczas tego etapu, ponieważ kości te bardzo łatwo pękają.
- Przepłukać kości ciepłym medium (M199 + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), + 1% penicyliny/streptomycyny). Do płukania użyć sterylnej igły 28-G, strzykawki 1 ml oraz od 10-15 ml medium na każdą kość.
- Przytrzymać kość precyzyjną pincetą i płukać jedną po drugiej, aż staną się półprzezroczyste. Ostrożnie naciskać tłok strzykawki, aby zminimalizować stres komórkowy.
- Przefiltrować szpik kostny przez nylonową siatkę o oczkach 70 µm i zebrać filtrat. Aby wyekstrahować maksymalną ilość szpiku kostnego, należy wielokrotnie płukać końce dystalne i proksymalne.
- Przepłukać sito roztworem PBS i zebrać filtrat. Ostrożnie usunąć zanieczyszczenia i konglomeraty komórkowe poprzez delikatne mieszanie i pipetowanie.
1.3 Hodowla
- Odwiruj zawiesinę komórkową z prędkością 250 x g przez 10 min w RT. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w około 25 ml pożywki. Powtórz czynność raz.
- Po drugim etapie przemywania resuspenduj komórki w 6 ml pożywki. Wymieszaj 50 µl roztworu komórek z 50 µl błękitu trypanu. Policz komórki w komorze licznikowej pod mikroskopem świetlnym. Oblicz liczbę komórek w roztworze, korzystając z następującego wzoru:
- Wysiej komórki na płytki 6-dołkowe z powierzchnią ultra-low-attachment, aby zapobiec trwałemu przyleganiu do dna płytki. Stosuj stężenie 106 komórek na ml, do 6 ml na dołek.
- Uzupełnij zawiesinę o 20 ng/ml M-CSF, aby wspomóc różnicowanie komórek.
- Kulturować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, prowadząc codzienną obserwację.
1.4 Zbieranie komórek
Uwaga: Poniższe kroki należy wykonywać w lodzie. Należy przejść do etapu 1.4.1 lub 1.4.2, w zależności od potrzeb.
- Na tym etapie należy zebrać całą kulturę, w tym zróżnicowane makrofagi, które przylegają do płytek hodowlanych, nawet jeśli są to płytki o powierzchni ultra-niskiego przywierania.
- Całą kulturę należy zebrać poprzez delikatne pipetowanie i odrywanie komórek za pomocą roztworu PBS w temperaturze 4 °C z dodatkiem 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA. Czynność tę należy powtarzać do momentu, aż na płytkach nie będzie pozostałych przylegających komórek – w razie wątpliwości należy to potwierdzić pod mikroskopem.
- Alternatywnie można odrzucić przylegające makrofagi, zbierając nadsącz z komórkami w zawiesinie, w których przeważają monocyty.
- Komórki nieprzylegające należy zebrać za pomocą roztworu PBS bez EDTA i 0,5% BSA. Nie należy używać zbyt dużej siły, aby uniknąć oderwania słabo przylegających makrofagów.
1.5 Analiza FACS (opcjonalnie)
Uwaga: Możliwe jest usunięcie z zawiesiny komórkowej komórek macierzystych i progenitorowych CD117+ przy użyciu metody MACS. W celu przeprowadzenia tej procedury należy stosować protokoły producenta.
- Zebrać komórki zgodnie z krokiem 1.4.1 lub 1.4.2.
- Odwirować komórki z prędkością 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, a następnie powtórzyć ten krok.
- Resuspendować co najmniej 250 000 komórek w 300 µl buforu FACS na jedną próbę.
- Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę 96-dołkową (30 µl na dołek).
- Odwirować zawiesinę komórkową z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Usunąć nadsącz i dodać 25 µl przeciwciał do każdego dołka (stosując rozcieńczenie zalecane przez producenta).
- Przebarwić komórki przeciwciałami (postępując zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi fenotypowania komórek po krokach 1.5.1-1.5.6. Powszechnie stosowane markery do identyfikacji monocytów / makrofagów obejmują CD11b, F4/80 (Rycina 3), CD115 (Rycina 2) oraz Gr-1.
Uwaga: W celu dokładniejszej charakterystyki zawiesin komórkowych zaleca się stosowanie markerów takich jak CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G oraz CD192. Charakterystyka komórkowa została opisana wcześniej12. - Inkubować próby przez 20 min w temperaturze 4 °C.
- Odwirować próby z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i resuspendować w 200 µl buforu FACS. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
- Przenieść próby do probówek do FACS i przeprowadzić analizę FACS12.
- Przeprowadzić analizę FACS12 w dniu 0, 3 i 5 w celu analizy różnicowania komórek.
2. Iniekcja do żyły ogonowej
2.1 Przygotowanie
- Ogrzewaj zwierzęta na płycie grzejnej w temperaturze 37 °C przez około 10 min. Obserwuj zwierzęta podczas ogrzewania, aby rozpoznać oznaki przegrzania.
- Resuspenduj monocyty, wyizolowane w krokach 1.1- 1.4, w 150 µl NaCl i pobierz komórki do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 30G. Przed pobraniem do strzykawki lekko wymieszaj roztwór na wirówce typu vortex, aby upewnić się, że wszystkie monocyty zostały wstrzyknięte. Zawsze manipuluj komórkami w lodzie, aby uniknąć indukowanego ciepłem przylegania i aktywacji monocytów.
2.2 Unieruchamianie
- Należy unikać niepokojenia pozostałych myszy w klatce podczas wyboru zwierzęcia do iniekcji dożylnej.
- Umieść mysz w restrainerze. Unikaj nadmiernego nacisku i zachowaj ostrożność przy kończynach tylnych. (Rycina 4)
Uwaga: Alternatywnie można zastosować znieczulenie ogólne, aby zagwarantować obsługę zwierząt bez stresu. - Przed zamknięciem restrainera upewnij się, że mysz ma przestrzeń do oddychania.
2.3 Iniekcja
- Zdezynfekuj miejsce iniekcji za pomocą środka dezynfekującego. Spryskaj ogon myszy i pozostaw na co najmniej 1 min.
- Aby zwiększyć widoczność żył, zatrzymaj przepływ krwi żylnej w ogonie, wywierając delikatny nacisk na boczną stronę ogona powyżej miejsca iniekcji.
- Przed iniekcją obróć ogon o 90 stopni. (Rycina 5)
- Wykonaj iniekcję pod kątem 45 stopni. Wstrzykuj powoli i nie więcej niż 5 µl na g, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
- Jeśli pojawi się pęcherz, co świadczy o niepowodzeniu iniekcji, natychmiast przerwij procedurę i powtórz iniekcję bardziej proksymalnie.
- Zatrzymaj krwawienie w miejscu iniekcji, wywierając delikatny nacisk przez około 1 min.
- Po zakończeniu procedury otwórz rozwieracz i umieść mysz w klatce.
- Obserwuj mysz przez 20 min, aby upewnić się, że zwierzę nie zostało zranione podczas iniekcji i utrzymuje pozycję grzbietową. Przedłuż czas obserwacji do momentu, aż mysz odzyska pełną świadomość. Przywróć mysz do grupy pozostałych zwierząt dopiero po jej całkowitym powrocie do zdrowia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Roztwór komórek wyekstrahowany z szpiku kostnego mysiego składa się z różnych typów komórek. Głównymi typami komórek są limfocyty, granulocyty i monocyty. Typy komórek można oszacować na podstawie wielkości i ziarnistości, co przedstawiono na Rysunku 1 zarówno dla zawiesin natywnych, jak i komórek zebranych po 5 dniach różnicowania. Należy zwrócić uwagę na zmianę składu komórkowego w trakcie hodowli. Jednakże dokładna klasyfikacja populacji musi opierać się na charakterystycznej ekspresji markerów komórk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy prostą i opłacalną metodę izolowania dużych ilości mysich monocytów ze szpiku kostnego. W porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi krew obwodową, które uzyskują wydajność monocytów5 z 1,4 x106, jesteśmy w stanie uzyskać wyższą wydajność 11 x 106 ± 3 x 106 monocytów od jednej myszy dawcy.
Rozważając wyzwania związane z tą metodą, należy wspomnieć o możliwości zanieczyszczenia podczas pracy w warunkach niesterylnych. Jeśli płukanie i ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Niemiecka Fundacja Badawcza) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, wspólne centrum badawcze).
Podziękowania dla Hansa-Holgera Gärtnera, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Niemcy, za wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-dołkowa płytka o bardzo niskim mocowaniu | Corning Incorporated, NY, USA | 6-dołkowa płytka o bardzo niskim mocowaniu, z nasadką, sterylna | |
| 8-12 tygodniowa, samiec, myszy balb/c | Charles River, Sulzfeld, Niemcy | ||
| 96-dołkowa płytka | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Niemcy | ||
| Niebieskie barwienie martwych komórek | Life technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy | ||
| Albumina surowicy bydlęcej | GE Healthcare, Freiburg, Niemcy | Frakcja V, pH 7,0 | |
| Kanule | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy | Z nakrętką, sterylną | |
| wirówką | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Niemcy | Allegra® Wirówka X-15R | |
| Krem do depilacji | Veet, Mannheim, Niemcy | ||
| Środek dezynfekujący | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Niemcy | Kodan Tinktur forte | |
| Skalpel jednorazowy nr 10 | Maszynka do golenia z piór Co.Ltd, Osaka, Japonia | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy | ||
| Etanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Niemcy | ||
| Jednostka ekstrakcyjna Pipetus | Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Niemcy | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü sseldorf, Niemcy | MCA497APC | |
| bufor FACS | Produkowane przez naszą grupę z pojedynczych komponentów | PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3 | |
| FACS Becton | , Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA Lampy | BD FACS Canto II | |
| FACS | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone | ||
| Falcon® pipeta | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Surowica cielęca płodu | Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy | ||
| Cienkie kleszcze | Rubis, Stabio, Szwajcaria | ||
| Rękawiczki | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Niemcy | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Płyta grzewcza | Labotect GmbH, Gö ttingen, Niemcy | Inkubator Hot Plate 062 | |
| Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Niemcy | Incu safe | ||
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Niemcy | ||
| Mikroskop świetlny | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Niemcy | Axiovert 40 ° C | |
| Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów | Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy | SRP3110 | |
| Wytrząsarka mechaniczna | IKA, Staufen, Niemcy | minishaker ms2 | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem | |
| Mikroprobówki | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | ||
| Mikrobiologiczny stół roboczy | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Niemcy | Hera bezpieczny | |
| bufor do płukania Monocyte | Produkowane przez naszą grupę z pojedynczych komponentów | PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Ogranicznik myszy | Różne | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Niemcy | ||
| NaN3 (kwas sodu) | Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy | ||
| Komora licząca Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Sitko komórkowe, 70 i mikro; m rozmiar oczek | |
| Penicylina/Streptomycyna | Sigma Aldrich, Hamburg, Niemcy | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Life technologies GmbH, Darmstadt, Niemcy | pH 7,4, sterylne | |
| Pipety | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | 10µ L/100&Micro; L/200&MIKRO; l/1,000&mikro; l | |
| Głowice pipetujące | Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy | ||
| Pipeta serologiczna | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Jednostka ssąca | Integra bioscience, Fernwald, Niemcy | Vacusafe comfort | |
| Nożyczki chirurgiczne | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Strzykawka | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Niemcy | 1 ml Strzykawka insulinowa Omnifix® -F | |
| Probówki z nakrętką | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Niemcy | 15 ml/50 ml Rurki | |
| Cellstar Kąpiel w ciepłej wodzie | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Niemcy | Julabo SW22 |
Bibliografia
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
