Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Podsumowanie

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Tetrarazystroniczne cząstki wirusopodobne zawierające replikację i transkrypcję (trVLP) reprezentują system modelowania cyklu życia, który pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, opierając się wyłącznie na składnikach wirusa Ebola.

Streszczenie

Wirusy Ebola powodują silne gorączki krwotoczne u ludzi i naczelnych, z częstością śmiertelności sięgającą 90%. Nie ma zatwierdzonych szczepionek ani specyficznych metod leczenia choroby wywoływanej przez te wirusy, a praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego, co znacznie ogranicza badania nad tymi wirusami. Systemy modelowania cyklu życia modelują cykl życia wirusa w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2; Jednak do niedawna takie systemy były ograniczone albo do poszczególnych aspektów cyklu życia wirusa, albo do pojedynczego cyklu zakaźnego. Minigenomy tetracistroniczne, które składają się z regionów niekodujących wirusa Ebola, genu reporterowego i trzech genów wirusa Ebola zaangażowanych w morfogenezę, pączkowanie i wnikanie (VP40, GP_1,2 i VP24), mogą być wykorzystywane do wytwarzania kompetentnych do replikacji i transkrypcji cząstek wirusopodobnych (trVLP) zawierających te minigenomy. Te trVLP mogą w sposób ciągły infekować komórki wykazujące ekspresję białek wirusa Ebola odpowiedzialnych za replikację i transkrypcję genomu, co pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2. Co ważne, komponenty wirusowe tego systemu pochodzą wyłącznie od wirusa Ebola, a nie od innych wirusów (jak ma to miejsce na przykład w systemach wykorzystujących wirusy pseudotypowane), a VP40, GP_1,2 i VP24 nie ulegają nadekspresji w tym systemie, co czyni go idealnie nadającym się do badania morfogenezy, pączkowania i wnikania, chociaż inne aspekty cyklu życia wirusa, takie jak replikacja genomu i transkrypcja, mogą być również modelowane za pomocą tego systemu. W związku z tym tetracistroniczny test trVLP stanowi najbardziej wszechstronny system modelowania cyklu życia dostępny dla wirusów Ebola i ma ogromny potencjał do wykorzystania w badaniach biologicznych wirusów Ebola w przyszłości. W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stosowania tego systemu, a także na temat oczekiwanych rezultatów.

Wprowadzenie

Wirusy Ebola są czynnikiem wywołującym ciężką gorączkę krwotoczną u ludzi i naczelnych innych niż ludzie, ze wskaźnikami śmiertelności do 90% w epidemiach u ludzi¹. Chociaż w ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w opracowywaniu szczepionek, jak również specyficznych metod leczenia (omówionych w ^{pkt 2.3}), nie są one zatwierdzone do stosowania u ludzi. Cząsteczki wirusa Ebola mają charakterystyczny nitkowaty wygląd o długości około 1 μm i średnicy od 96 do 98 nm⁴. Nukleokapsyd tworzy rdzeń cząstek wirusa i składa się z 1) niesegmentowanego jednoniciowego genomu RNA o ujemnym sensie, który koduje 7 genów wirusa ebolavirus (ryc. 1), 2) nukleoproteiny NP, która otacza genom, 3) kompleksu polimerazy wirusa składającego się z polimerazy L i jej kofaktora VP35 oraz 4) aktywatora transkrypcji VP30. Ponadto niedawno wykazano, że białko VP24 jest również związane z nukleokapsydami⁴. Nukleokapsyd jest otoczony przestrzenią macierzy, w której znajduje się białko macierzy VP40, odpowiedzialne za morfogenezę i pączkowanie wirionów. Cząsteczki wirusa są dalej otoczone, a w tej otoczce osadzone jest jedyne białko powierzchniowe GP_1,2, które jest odpowiedzialne za przyłączanie i wnikanie wirionu.

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola musi być wykonywana w laboratorium o maksymalnym stopniu zabezpieczenia, zgodnie z warunkami poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 4, co ogranicza tę pracę do kilku obiektów na całym świecie. Aby zbadać biologię tych wirusów lub opracować nowe terapie w warunkach BSL2, naukowcy polegają albo na rekombinowanej nadekspresji białek wirusa Ebola, albo na systemach modelowania cyklu życia, z którymi można pracować przy braku zakaźnego wirusa Ebola. Rekombinowaną ekspresję białek wirusa Ebola uzyskuje się z plazmidów ekspresyjnych lub wektorów wirusowych. Szczególnym przypadkiem tej strategii jest wytwarzanie wirionów lub cząstek wirusopodobnych na bazie wirusów innych niż wirusy Ebola (najczęściej retrowirusy lub wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej) w obecności rekombinacyjnie eksprymowanego GP_1,2, co prowadzi do generowania pseudotypowanych cząstek, które można wykorzystać do badania procesu wnikania filowirusów i badań przesiewowych w kierunku inhibitorów wniknięcia⁵. Alternatywnie, rekombinowane wirusy (np. wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej), które kodują wirusa Ebola GP_1,2 zamiast własnej glikoproteiny, mogą być generowane i wykorzystywane do badania wnikania wirusa w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2⁶.

Systemy modelowania cyklu życia są formami systemów genetyki odwrotnej wykorzystujących skrócone analogi genomu wirusa Ebola (minigenomy), które są początkowo produkowane z cDNA, a następnie replikowane i transkrybowane przez białka wirusa Ebola dostarczane w trans. Pierwszy system minigenomu dla wirusa Ebola został opracowany ponad 15 lat temu⁷ i od tego czasu jest używany do badania replikacji i transkrypcji genomu wirusa Ebola (przegląd w ^8,9). W tym systemie monocistroniczny minigenom składający się z pojedynczego genu reporterowego otoczonego końcowymi niekodującymi regionami genomu wirusa Ebola (zwanymi liderem i przyczepą) (Figura 1) ulega ekspresji w komórkach ssaków (zwykle przez transkrypcję przy użyciu polimerazy RNA T7) wraz z białkami wirusowymi L, VP35, VP30 i NP. Minigenom jest enkapsynowany przez NP, a następnie replikowany i transkrybowany przez inne białka nukleokapsydu przy użyciu sygnałów cis-działających zlokalizowanych w liderze i przyczepie, co prowadzi do aktywności reporterowej, która odzwierciedla te dwa aspekty cyklu życia wirusa (ryc. 2).

W celu modelowania dodatkowych etapów cyklu życia wirusa, opracowano systemy cząsteczek wirusopodobnych kompetentnych do transkrypcji i replikacji (trVLP), które są oparte na klasycznych systemach minigenomu, ale zawierają dodatkową ekspresję innych białek wirusowych VP24, VP40 i GP_1,2 z plazmidów ekspresyjnych^10,11. Obecność VP40 prowadzi do powstawania trVLP, które na swojej powierzchni noszą GP_1,2, a wewnątrz przenoszą nukleokapsyd zawierający minigenom. Te trVLP mogą być używane do infekowania komórek docelowych, które albo zostały wstępnie transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla L, VP35, VP30 i NP, w celu ułatwienia replikacji i transkrypcji minigenomów wprowadzonych do komórek docelowych w trVLPs¹¹, albo są naiwnymi komórkami docelowymi (tj. bez ekspresji białek wirusa Ebola sterowanej plazmidem)¹⁰. Powoduje to aktywność reporterową w komórkach docelowych, która odzwierciedla replikację minigenomów w komórkach produkcyjnych, morfogenezę i pączkowanie trVLP, ich wejście do komórek docelowych, oraz 1) w przypadku pretransfekowanych komórek docelowych również replikację genomu i wtórną transkrypcję (tj. transkrypcję przez białka wirusowe wytwarzane w komórkach docelowych) w komórkach docelowych, lub 2) w przypadku naiwnych komórek docelowych również transkrypcja pierwotna (tj. transkrypcja przez białka wirusowe wprowadzone do komórek docelowych w trVLP) (ryc. 3). Co ważne, systemy te zostały wykorzystane tylko do modelowania pojedynczego cyklu zakaźnego i opierają się na nadekspresji wszystkich białek wirusowych, co w przypadku VP24 i VP40 jest szczególnie problematyczne, ponieważ wykazano, że białka te są silnymi negatywnymi regulatorami replikacji i transkrypcji genomu w przypadku nadekspresji z plazmidów^12,13. Co więcej, preparaty trVLP wytwarzane w tych systemach zawierają wysoki odsetek cząstek niezakaźnych, co stanowi wyzwanie dla analizy biochemicznej zakaźnych trVLP¹⁴.

Aby przezwyciężyć te problemy, niedawno opracowaliśmy tetracistroniczny system minigenomu, który oprócz genu reporterowego zawiera również geny kodujące VP40, GP_1,2 i VP24 (Rysunek 1). Podobnie jak klasyczny monocytroniczny system minigenomu, system ten prowadzi do produkcji trVLP, które mogą infekować komórki docelowe (Figura 4)¹⁵. Jednak w przeciwieństwie do klasycznego systemu minigenomu, VP40, GP_1,2 i VP24 są wytwarzane po transkrypcji genomu wirusa, a nie ulegają nadekspresji z plazmidów. W rezultacie, kinetyka i poziomy ekspresji tych białek znacznie bardziej naśladują te znalezione podczas cyklu życia wirusa, a w konsekwencji stosunek zakaźnych do niezakaźnych trVLP jest w tym systemie zwiększony około 500-krotnie15. Co więcej, przy użyciu tego systemu możliwe było ciągłe przechodzenie tetracistronicznych trVLP zawierających minigenom, modelowanie wielu cykli zakaźnych. W związku z tym tetracistroniczne trVLP są obecnie najbardziej wszechstronnym systemem modelowania cyklu życia dostępnym do badania biologii wirusa Ebola w warunkach BSL2. W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stosowania tego systemu, a także na temat oczekiwanych rezultatów.

Protokół

1. Podział komórek produkcyjnych do początkowej produkcji trVLP

1. Usuń pożywkę z 80-90% zlewających się 293 komórek hodowanych w 75 cm² kolbach w zmodyfikowanej pożywce Eagle's o wysokiej zawartości glukozy Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą i 1x wstrzykiwaczem/paciorkowcami (DMEM10). Umyj komórki dwukrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), uważając, aby nie usunąć komórek, i dodaj do komórek 2 ml trypsyny-EDTA.
2. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej, aż komórki wykażą znaczne zaokrąglenie, gdy zostaną zaobserwowane pod mikroskopem (około 30 sekund). Usunąć komórki, stukając w kolbę, i dodać 8 ml DMEM10. Dokładnie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż do momentu, gdy zaobserwuje się zawiesinę pojedynczej komórki podczas oglądania pod mikroskopem.
3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć komórki do 2 x 10⁵ komórek na ml w DMEM10. Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na dołek do płytek 6-dołkowych (4 x 10⁵ komórek na studzienkę).
4. Inkubować płytki w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

2. Transfekcja komórek produkcyjnych do początkowej produkcji trVLP

1. 24 godziny po podziale komórek (patrz Rysunek 5 w celu zapoznania się z czasem eksperymentu), należy pobrać pipetę plazmidu DNA¹⁵ (ilości patrz Tabela 1) do sterylnego kriowialu o pojemności 2 ml za pomocą przefiltrowanych końcówek. Dodać 100 μl OptiMEM na studzienkę do DNA. Krótko zmieszaj mieszaninę i delikatnie odwiruj rurki za pomocą mikrofuge. Jeśli kilka studzienek ma być transfekowanych identycznymi plazmidami, można wykonać mastermix dla kilku studzienek.
2. Przed użyciem należy krótko przemieszać fiolkę z Transit LT1. Dodać 7,5 μl Transit LT1 na studzienkę do rozcieńczonego DNA. Delikatnie zwirować mieszaninę, uważając, aby nie zebrać płynu w pokrywie kriowialu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Delikatnie wymieszać kompleks transfekcyjny, pipetując w górę i w dół. Dodać kroplami 100 μl kompleksów transfekcyjnych do każdej studzienki. Kołysz płytką do przodu/do tyłu i z boku na bok, aby rozprowadzić kompleksy transfekcji. Nie należy obracać płytki, ponieważ spowoduje to nierównomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcyjnych.
4. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
5. Po 24 godzinach usunąć supernatant z komórek. Dodaj 4 ml DMEM z 5% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1x długopis/paciorkowiec (DMEM5) do komórek. Ten krok można wykonać dla maksymalnie 3 studzienek jednocześnie bez suszenia studzienek, zakładając, że studzienki zawierają identyczne próbki (w przeciwnym razie, ze względu na samowzmacniający się charakter trVLP w tym systemie, zanieczyszczenie krzyżowe może stać się problemem i ten krok należy wykonywać pojedynczo).
6. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.

3. Przygotowanie komórek docelowych

1. Podzielić 293 komórki zgodnie z opisem w sekcji 1, wysiewając 4 x 10⁵ komórek w 2 ml DMEM10 na dołek płytki 6-dołkowej.
2. 24 godziny po rozszczepieniu komórek docelowych i 24 godziny przed zakażeniem, transfekować komórki docelowe zgodnie z opisem w sekcji 2, wykorzystując ilości DNA w tabeli 1 i 4,5 μl tranzytu LT1 na basenik.

4. Zakażenie komórek docelowych i pobieranie komórek produkcyjnych

1. Przenieść supernatanty z komórek producenta do probówek o pojemności 15 ml. Usunąć i wyrzucić pozostały sklarowany osad za pomocą węża próżniowego. Dodać 250 μl buforu do lizy glo lizy do komórek.
2. Odwirować supernatant przez 5 minut przy 800 x g i temperaturze pokojowej w celu oczyszczenia próbek z resztek komórkowych.
3. Usunąć supernatant z jednego dołka komórek docelowych. Ostrożnie dodać 3 ml oczyszczonego supernatantu z komórek produkcyjnych do komórek docelowych, używając najmniejszej prędkości pipety. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki, aby uniknąć uszkodzenia monowarstwy komórek. Ten krok należy wykonywać dobrze po drugim.
4. Po przeniesieniu wszystkich próbek należy zwrócić komórki docelowe do inkubatora, aby umożliwić sedymentację trVLP i zakażenie komórek docelowych.
5. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej w buforze do lizy glo należy ponownie zawiesić komórki produkcyjne w buforze do lizy za pomocą mikropipety ustawionej na 150 μl i przenieść próbkę do kriowialu o pojemności 2 ml. W tym momencie lizaty można zamrozić w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio zmierzyć, jak opisano w sekcji 6.
6. 24 godziny po zakażeniu usunąć supernatant z komórek docelowych. Dodać 4 ml DMEM5 na dołek do komórek. Ten krok można wykonać dla maksymalnie trzech studzienek jednocześnie, jeśli studzienki zawierają identyczne próbki (w przeciwnym razie, ze względu na samowzmacniający się charakter trVLP w tym systemie, zanieczyszczenie krzyżowe może stać się problemem i ten krok należy wykonywać pojedynczo).

5. Pobieranie komórek docelowych dla infekcji w jednym cyklu

1. Jeśli ma być oceniany tylko jeden cykl zakaźny, po 72 godzinach od zakażenia usuń supernatant z komórek docelowych za pomocą węża próżniowego.
2. Zebrać komórki w 250 μl buforu do lizy glo lity, jak opisano w sekcji 4 dla komórek produkcyjnych.

6. Pobieranie komórek docelowych i ciągłe przechodzenie trVLP

1. Jeśli trVLP mają być pasażowane w sposób ciągły, należy przygotować nowy zestaw komórek docelowych zgodnie z opisem w sekcji 3, tak aby były one gotowe do zakażenia 72 godziny po zakażeniu pierwszego zestawu komórek docelowych (patrz rycina 5).
2. Zakażony nowy zestaw komórek docelowych zgodnie z opisem w sekcji 4 (przy użyciu pierwszego zestawu komórek docelowych zamiast komórek produkcyjnych).
3. Powtarzaj te kroki co 72 godziny.

7. Analiza aktywności reportera

1. Jeśli lizaty komórkowe zostały zamrożone, rozmrozić je w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki osiągnęły temperaturę pokojową przed pomiarem.
2. Rozmrozić wymaganą ilość (40 μl na próbkę) buforu do oznaczania Renilla Glo (najlepiej zamrożonego w podwielokrotnościach) w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że bufor osiągnął temperaturę pokojową przed pomiarem.
3. Dodać 1/100^objętości substratu Renilla Glo do buforu testowego Renilla Glo w celu otrzymania odczynnika Renilla Glo i wymieszać przez wirowanie. Pobrać pipetą 40 μl odczynnika Renilla Glo do białej płytki 96-dołkowej.
4. Dodać 40 μl próbki do odczynnika Renilla-Glo. Odczekaj 10 minut, a następnie zmierz próbki w luminometrze, używając czasu całkowania wynoszącego 1 sekundę.

Wyniki

Transfekcja komórek producentów 293 plazmidami ekspresyjnymi kodującymi białka nukleokapsydu wirusa Ebola NP, VP35, VP30 i L, tetracistronicznym minigenomem oraz pomocniczą polimerazą T7 prowadzi do replikacji i transkrypcji minigenomu oraz aktywności reporterowej, która jest łatwo wykrywalna po 72 hr (Rysunek 6). Co istotne, obserwowana aktywność reporterowa (10^5.6 względnych jednostek luminescencji (RLU)) przekracza o ponad 2 logarytmy aktywność kontroli negatywnej, w której z transfekcji pominięto plazmid ekspresyjny kodujący L (10³ RLU). Niski poziom aktywności obserwowany nawet w przypadku braku L wynika najprawdopodobniej z obecności kryptycznego promotora w plazmidzie z minigenomem. Komórki docelowe zainfekowane trVLP z supernatantu komórek producentów wykazują w rzeczywistości nieco wyższe poziomy aktywności reporterowej w porównaniu z komórkami producentów, a wartości te osiągają od 10⁶ do 10⁷ RLU, w zależności od pasażu. W przeciwieństwie do tego, gdy supernatant z kontrolnych komórek producentów –L jest przenoszony na komórki docelowe (wyrażające wszystkie białka nukleokapsydu, w tym L), aktywność reporterowa nie przekracza poziomu szumu tła luminometru (około 10² RLU).

Test tetracistroniczny trVLP może być wykorzystany do badania cyklu życiowego wirusów Ebola. Na przykład zakażenie komórek 293 trVLP zależy od obecności czynników adhezyjnych, takich jak Tim-1 ¹⁶, który w tych komórkach musi zostać dostarczony in trans. W konsekwencji w teście tetracistronicznym trVLP w przypadku braku Tim-1 obserwuje się około 100-krotny spadek aktywności reportera w komórkach docelowych (Rysunek 7A). Rola specyficznych białek (wirusowych lub komórkowych) w cyklu życiowym wirusa może być również oceniana przy użyciu technologii RNAi w połączeniu z tym podejściem. Przykładowo, wywołana przez RNAi downregulacja białka L skutkuje około 100-krotnym spadkiem aktywności reportera, co odzwierciedla kluczową rolę białka L w replikacji i transkrypcji (Rysunek 7B)⁷. Ponadto możliwe jest bezpośrednie manipulowanie minigenomem w celu oceny wpływu mutacji na cykl życiowy wirusa. Przykładowo, gdy ekspresja VP24 z minigenomu zostaje zniesiona poprzez wprowadzenie 3 kodonów stop bezpośrednio za kodonem start, aktywność reportera w komórkach producentach nie ulega znaczącej zmianie; jednakże aktywność reportera w komórkach docelowych jest zredukowana około 20-krotnie po jednym pasażu i 400-krotnie po dwóch pasażach, co wskazuje na rolę VP24 w produkcji zakaźnych trVLP (Rysunek 7C)¹⁵.

Rycina 1. Struktura genomu wirusa Ebola oraz monocistronowe i tetracistronowe minigenomy. Regiony kodujące białka wirusa Ebola przedstawiono jako pola czerwone (NP, VP35, VP30 i L), żółte (VP40 i VP24) lub niebieskie (GP_1,2). Regiony niekodujące (NCRs) zaznaczono na zielono, z wyszczególnieniem regionów lidera i trailera. Indeks dolny wskazuje, który wirusowy NCR został użyty do połączenia regionów kodujących. Region kodujący białko reporterowe (rep) przedstawiono na fioletowo.

Rysunek 2. Monocistronowy test minigenomu. Komórki są transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla białek nukleokapsydu wirusa Ebola (NP, VP35, VP30, L), monocistronowym minigenomem (mg) oraz polimerazą T7. Minigenom jest początkowo przepisywany przez polimerazę T7 (a) na nieenkapsydowane RNA minigenomu o tej samej orientacji co genom wirusa (vRNA), które następnie ulega enkapsydacji przez NP (b). To enkapsydowane vRNA jest replikowane poprzez pośrednie komplementarne RNA minigenomu (cRNA) (c), a następnie przepisywane na reporterowe mRNA (d), które są tłumaczone na białko reporterowe (e).

Rycina 3. Test trVLP z monocistronicznym minigenomem. Komórki są transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla komponentów testu minigenomu (białkami nukleokapsydu wirusa Ebola NP, VP35, VP30, L, monocistronicznym minigenomem oraz polimerazą T7), a także białkami VP40, GP_1,2 i VP24. Prowadzi to do powstania trVLP, które zawierają nukleokapsydy z minigenomem (f). trVLP te mogą następnie infekować komórki docelowe (g), które są albo uprzednio transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla NP, VP35, VP30 i L (góra), co skutkuje replikacją i transkrypcją wtórną (d) prowadzącą do ekspresji reportera (e), albo są naiwnymi komórkami docelowymi (dół), co skutkuje transkrypcją pierwotną minigenomów (h), również prowadzącą do ekspresji reportera (e).

Rycina 4. Analiza trVLP z wykorzystaniem tetracistronowego minigenomu. Komórki są transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla białek nukleokapsydu wirusa Ebola (NP, VP35, VP30, L), tetracistronowym minigenomem (mg) oraz polimerazą T7. Transkrypcja pierwotna (a), enkapsydacja (b), replikacja genomu (c) i transkrypcja (d) oraz translacja (e) przebiegają analogicznie jak w analizie z minigenomem monocistronowym. Jednakże, oprócz mRNA reporterowego, z tetracistronowego minigenomu są transkrybowane również mRNA dla VP40, GP_1,2 i VP24, co prowadzi do powstania trVLP (f). Te trVLP infekują komórki docelowe, które zostały uprzednio transfekowane plazmidami ekspresyjnymi dla białek nukleokapsydu NP, VP35, VP30 i L, a także komórkowym czynnikiem przyczepiania wirusa Ebola Tim-1, co skutkuje replikacją i transkrypcją genomu oraz produkcją trVLP, które mogą być wykorzystane do infekcji nowych komórek docelowych.

Rycina 5. Harmonogram tetracistronicznego testu trVLP dla 3 kolejnych pasażów. Dni wysiewu komórek (s), transfekcji komórek (t), infekcji komórek (i), wymiany pożywki (c) oraz zbioru komórek i trVLP (h) są zaznaczone dla trzech kolejnych pasażów (wskazane strzałkami).

Rycina 6. Typowe poziomy aktywności reportera obserwowane w tetracistronicznym teście trVLP. Tetracistroniczny test trVLP przeprowadzono w ciągu 5 pasażów zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym manuskrypcie. Jako kontrolę negatywną z transfekcji komórek producentów p0 pominięto plazmid ekspresyjny kodujący L (-L). Komórki docelowe w pasażach od p1 do p5 przetransfekowano plazmidami ekspresyjnymi dla wszystkich białek nukleokapsydu, w tym L. Szum tła luminometru zaznaczono linią przerywaną. Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe z 4 powtórzeń biologicznych z 3 niezależnych eksperymentów.

Rysunek 7. Ocena wpływu różnych czynników wirusowych i komórkowych na cykl życiowy wirusa z wykorzystaniem tetracistronicznych trVLP. (A) Tim-1 jako czynnik przylegania. Komórki docelowe, które uprzednio przetransfekowano plazmidami ekspresyjnymi kodującymi białka nukleokapsydu oraz z plazmidem kodującym Tim-1 lub bez niego (opisane w ¹⁵), zainfekowano tetracistronicznymi trVLP. Aktywność reporterową w komórkach docelowych p1 określono 72 h po infekcji. Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe z 4 powtórzeń biologicznych z 4 niezależnych eksperymentów. (B) Efekt wyciszenia genu L za pomocą RNAi na replikację i transkrypcję genomu. Komórki docelowe, które uprzednio przetransfekowano plazmidami ekspresyjnymi dla komponentów nukleokapsydu, Tim-1 oraz miRNA skierowanymi przeciwko L (anti-L) lub przeciwko niespokrewnionemu białku (anti-GFP) (opisane w ¹⁵), zainfekowano tetracistronicznymi trVLP. Aktywność reporterową w komórkach docelowych p1 określono 72 h po infekcji. Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe z 5 powtórzeń biologicznych z 2 niezależnych eksperymentów. (C) Wpływ mutacji w minigenomie na zakaźność trVLP. Przeprowadzono test tetracistronicznego trVLP z użyciem minigenomu typu dzikiego (4cis-WT) lub minigenomu, w którym wprowadzono 3 kodony stop bezpośrednio po kodonie start VP24, co zniosło ekspresję tego białka, wprowadzając jedynie minimalne zmiany w minigenomie pod kątem długości, składu kwasów nukleinowych, struktur drugorzędowych itp. Aktywność reporterową w p0, p1 i p2 zmierzono 72 h po transfekcji / infekcji. Przedstawiono średnie i odchylenia standardowe z 3 powtórzeń biologicznych z 3 niezależnych eksperymentów.

	Komórki producenta (p0)	Komórki docelowe (p1 i wyższe)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1,000	1,000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

Tabela 1. Ilości DNA do transfekcji. Ilość każdego plazmidu wymagana do transfekcji komórek producentów i komórek docelowych jest podana w ng na dołek płytki 6-dołkowej. Wszystkie plazmidy zostały opisane w pracy Watt et al¹⁵.

Dyskusja

Tetracistroniczny test trVLP opisany w tym manuskrypcie umożliwia modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w kilku cyklach zakaźnych. Co ważne, trVLP wytwarzane w tym systemie nie zawierają informacji genetycznej dla białek nukleokapsydu NP, VP35, VP30 i L, które razem stanowią prawie 60% genomu wirusa Ebola i są niezbędne do replikacji wirusa. Białka te muszą być raczej dostarczane do komórek docelowych w plazmidach trans z ekspresji, a każda infekcja komórek, które nie wyrażają wszystkich 4 z tych białek, jest nieudana. Co ważne, nie ma dowodów na rekombinację genetyczną filowirusów i nie ma regionów homologicznych wspólnych dla minigenomu tetracistronicznego i plazmidów ekspresyjnych dla białek nukleokapsydu. W związku z tym nie ma żadnych praktycznych dowodów ani żadnych podstaw teoretycznych, które mogłyby zapewnić możliwość generowania pełnej długości genomów wirusa Ebola, które mogłyby następnie potencjalnie doprowadzić do produkcji zakaźnych wirusów Ebola, co czyni ten system bezpiecznym do użytku w warunkach BSL2.

Istnieją dwa krytyczne etapy tetracistronicznego testu trVLP, na które mają wpływ warunki eksperymentalne, tj. produkcja trVLP i zakażenie komórek docelowych tymi trVLP. Produkcja trVLP zależy od wysokiego poziomu replikacji i transkrypcji minigenomu, co z kolei zależy od wysokiej skuteczności transfekcji. Skuteczność transfekcji można łatwo ocenić, włączając kontrolę -L, w której plazmid ekspresyjny na L jest zamieniany na plazmid ekspresyjny kodujący eGFP. Szybkość transfekcji w tych warunkach powinna przekraczać 50% podczas kontroli mikroskopem fluorescencyjnym 24 godziny po transfekcji. Co więcej, komórki muszą być wolne od mykoplazmy, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że zanieczyszczenie mykoplazmą dramatycznie upośledza replikację i transkrypcję minigenomu (dane niepublikowane). Ze względu na wysoką transfekcyjność 293 komórki są linią komórkową z wyboru do testów trVLP; jednak komórki te są stosunkowo słabo podatne (choć nie całkowicie refrakcyjne) na zakażenie wirusem Ebola¹⁶. Ekspresja czynnika przyłączeniowego, takiego jak Tim-1, zwiększa zakażenie 293 komórek trVLP około 100-krotnie i ma kluczowe znaczenie dla sukcesu tego systemu przez kilka pasaży.

Chociaż tetracistroniczne trVLP nie replikują się samoczynnie, są samoreplikujące się w komórkach, które wyrażają białka nukleokapsydu. W związku z tym należy podjąć środki ostrożności w celu uniknięcia zanieczyszczeń krzyżowych między studzienkami zawierającymi różne trVLP (np. z różnymi mutacjami w minigenomie). Z bardziej technicznego punktu widzenia, ze względu na dużą różnicę między sygnałami pozytywnymi i ujemnymi w tym teście (około 4 logarytmy), przesłuch między próbkami podczas pomiaru aktywności lucyferazy może być problemem; Można tego jednak łatwo uniknąć, pozostawiając jedną pustą studzienkę między każdą próbką w 96-dołkowej płytce używanej do pomiaru aktywności lucyferazy.

Istnieje wiele możliwych zastosowań tetracistronicznych trVLP. Oczywiście, są one dobrze przystosowane do badania wnikania cząstek filowirusa, ponieważ zakaźne trVLP mają typową nitkowatą strukturę zakaźnych filowirusów¹⁴ i zawierają te same składniki wirusowe co cząsteczki filowirusa. Co ważne, nie zawierają one składników innych wirusów, jak ma to miejsce w przypadku stosowania pseudotypowanych wirionów lub cząstek wirusopodobnych, takich jak cząstki retrowirusa zawierające GP_1,2, lub wirusów rekombinowanych, takich jak rekombinowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej wykazujący ekspresję GP_1,2. Wymóg czynników przyłączenia przy użyciu 293 komórek jako komórek docelowych w tym systemie może być wykorzystany do badań przesiewowych i badania roli takich czynników przywiązania, podczas gdy role innych czynników komórkowych, takich jak te zaangażowane w replikację i transkrypcję genomu, a także morfogenezę i pączkowanie, można badać za pomocą technologii RNAi. Można również badać wpływ mutacji w białkach wirusowych na cykl życiowy wirusa, chociaż należy pamiętać, że podczas gdy VP40, GP_1,2 i VP24 ulegają ekspresji po transkrypcji wirusa, ekspresja innych białek wirusowych jest osiągana z plazmidów ekspresyjnych, tak więc należy wziąć pod uwagę skutki wynikające z nadekspresji tych białek. Należy również zwrócić uwagę na to, aby mutacje w minigenomie nie zmieniały znacząco długości minigenomu, ponieważ na aktywność reporterową bezpośredni wpływ ma długość minigenomu¹⁵. Wreszcie, ponieważ minigenomy tetracistroniczne są analogami genomu wirusa, które przenoszą geny wirusa i są replikowane przez kompleks polimerazy wirusa, powinno być również możliwe badanie ewolucji tych genów w odpowiedzi na mutacje w warunkach BSL2. Tak więc, chociaż nadal potrzebne są dalsze badania w tym kierunku, powinno być możliwe, na przykład, wprowadzenie suboptymalnych mutacji w genach w obrębie minigenomu, a następnie pasażowanie trVLP do momentu pojawienia się mutacji uzupełniających.

Jednym z ograniczeń tetracistronicznego testu trVLP, o którym należy pamiętać, jest fakt, że chociaż modeluje on większość cyklu życia wirusa, pierwotna transkrypcja w komórkach docelowych nie jest modelowana przez ten system, ponieważ komórki docelowe muszą wyrażać białka nukleokapsydu w trans, aby trVLP mogły się replikować. Jeśli konieczna jest ocena transkrypcji pierwotnej, możliwe jest użycie naiwnych komórek docelowych¹⁰; jednak w tym przypadku w komórkach docelowych nie zachodzi replikacja genomu i nie są wytwarzane dalsze zakaźne trVLP, co przerywa infekcję. Jest to główny problem, którego nie można przezwyciężyć bez całkowitego samoreplikowania trVLP poprzez włączenie genów białek nukleokapsydu do minigenomu, co de facto przekształciłoby je w zakaźne rekombinowane wirusy Ebola. W rzeczywistości wirusy Ebola wyrażające lucyferazy lub inne reportery zostały wygenerowane i mogą być wykorzystane do oceny i badania replikacji i transkrypcji genomu^17,18; jednak ich zastosowanie jest ograniczone do laboratoriów BSL4. Należy również pamiętać, że chociaż VP40, GP_1,2 i VP24 ulegają ekspresji z analogu genomu wirusa, ich pozycja w minigenomie (^{2., 3}. i 4.^{jednostka transkrypcyjna}) nie jest identyczna z ich pozycją w genomie wirusa (^{3., 4}. i 6.^{jednostka transkrypcyjna}), co może wpływać na ich bezwzględne poziomy ekspresji, a także ich względne poziomy ekspresji w stosunku do siebie.

Ogólnie rzecz biorąc, tetracistroniczny test trVLP stanowi najbardziej wszechstronny system modelowania cyklu życia wirusów Ebola dostępny do tej pory i umożliwia modelowanie replikacji i transkrypcji genomu, morfogenezy i pączkowania cząstek, a także przyłączania i wnikania do komórek docelowych w wielu cyklach zakaźnych. W związku z tym ma ogromny potencjał do wykorzystania w badaniu biologii wirusów Ebola w warunkach BSL2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
75 cm2 Kolba do hodowli komórkowych	Corning
DMEM	Sigma	D6546	rozgrzej do 37 stopni Celsjusza; C przed użyciem
FBS	Life Technologies	26140-079	inaktywacja ciepła 30 min @ 56 ° C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
0,25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
PBS			8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, H2O dodać 1 L; Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej
Płytki 6-dołkowe	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
Bufor do lizy glo lizy	Promega	E2661
System do oznaczania lucyferazy Renilla Glo	Promega	E2720
96-dołkowa płytka testowa (biała)	Costar	3912
Luminometr mikropłytkowy	Turner Microsystems	998-9300