Procedury instrumentalne do oceny elastyczności behawioralnej u szczurów

Podsumowanie

Zdolność do oceny funkcji wykonawczych, takich jak elastyczność behawioralna u szczurów, jest przydatna do badania neurobiologii funkcji poznawczych zarówno u nienaruszonych zwierząt, jak i w modelach chorób. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowane zadania do oceny zmiany strategii i odwróconego uczenia się, które są szczególnie wrażliwe na zakłócenia w sieciach kory przedczołowej.

Streszczenie

Funkcje wykonawcze składają się z wielu procesów poznawczych wysokiego poziomu, które napędzają generowanie reguł i selekcję zachowań. Emergentną właściwością tych procesów jest zdolność do dostosowywania zachowania w odpowiedzi na zmiany w otoczeniu (tj. elastyczność behawioralna). Procesy te są niezbędne do normalnego zachowania człowieka i mogą być zakłócone w różnych stanach neuropsychiatrycznych, w tym schizofrenii, alkoholizmie, depresji, udarze i chorobie Alzheimera. Zrozumienie neurobiologii funkcji wykonawczych zostało znacznie posunięte naprzód dzięki dostępności zadań na zwierzętach do oceny dyskretnych składników elastyczności behawioralnej, w szczególności zmiany strategii i uczenia się odwróconego. Chociaż opracowano kilka rodzajów zadań, większość z nich jest niezautomatyzowana, pracochłonna i pozwala na testowanie tylko jednego zwierzęcia na raz. Niedawny rozwój zautomatyzowanych, opartych na instrumentach zadań do oceny elastyczności behawioralnej usprawnia testowanie, standaryzuje prezentację bodźców i rejestrację danych oraz znacznie poprawia przepustowość. W tym miejscu opisujemy zautomatyzowane zadania zmiany i odwrócenia strategii, wykorzystujące komory operacyjne kontrolowane przez specjalnie napisane programy. Korzystając z tych zadań, wykazaliśmy, że przyśrodkowa kora przedczołowa zarządza zmianą strategii, ale nie odwróceniem uczenia się u szczurów, podobnie jak dysocjacja obserwowana u ludzi. Co więcej, zwierzęta z noworodkowym uszkodzeniem hipokampa, neurorozwojowym modelem schizofrenii, są selektywnie upośledzone w zadaniu zmiany strategii, ale nie w zadaniu odwrócenia. Zadanie zmiany strategii pozwala również na identyfikację odrębnych typów błędów wydajności, z których każdy można przypisać odrębnym substratom neuronalnym. Dostępność tych zautomatyzowanych zadań oraz dowody potwierdzające dysocjowalny wkład oddzielnych obszarów przedczołowych sprawiają, że są one szczególnie dobrze przystosowane do badania podstawowych procesów neurobiologicznych, a także odkrywania leków i badań przesiewowych w modelach chorób.

Wprowadzenie

Procesy poznawcze wysokiego poziomu, w tym generowanie reguł, selekcja zachowań i ocena strategii, są zbiorczo określane jako "funkcja wykonawcza" lub "elastyczność behawioralna¹." Takie procesy są kluczowe dla prawidłowych funkcji poznawczych i mogą być upośledzone w tak różnych zaburzeniach jak schizofrenia, alkoholizm, depresja, udar mózgu i choroba Alzheimera^2-7. W regulacji procesów funkcji wykonawczych pośredniczą przede wszystkim obszary kory czołowej, w tym grzbietowo-boczna kora przedczołowa i kora oczodołowo-czołowa u ludzi^8-10.

Opracowanie zadań do oceny funkcji wykonawczych i/lub elastyczności behawioralnej u zwierząt innych niż ludzie, szczególnie u gryzoni, znacznie poszerzyło zrozumienie neurobiologii funkcji poznawczych^11-14. Takie zadania umożliwiły oddzielne mierzenie różnych komponentów elastyczności behawioralnej, w tym zmiany strategii i uczenia się odwróconego. Zmiana strategii odnosi się do zdolności do aktywnego tłumienia wcześniej wyuczonej strategii reagowania przy jednoczesnym nabywaniu nowej, konkurencyjnej strategii, szczególnie w różnych wymiarach bodźca (przesunięcie międzywymiarowe) – np. przejście od dyskryminacji opartej na wzroku (czerwony kontra zielony, gdzie czerwony jest "poprawny", a bodźce dotykowe są nieistotne) do wykonywania dyskryminacji dotykowej (gładki vs. szorstki, gdzie gładkość jest "poprawna", a bodźce wzrokowe są teraz nieistotne). Z drugiej strony, uczenie odwrócone również wiąże się ze zmianą strategii reagowania, ale w tym samym wymiarze bodźca – np. w przykładzie "czerwony kontra zielony", jeśli czerwony był wcześniej poprawny, odwrócenie dyktowałoby, że zielony jest teraz poprawny, podczas gdy bodźce dotykowe pozostałyby nieistotne.

Kilka zadań zostało opracowanych w celu zbadania elastyczności behawioralnej u gryzoni. Zadanie polegające na przechodzeniu przez labirynt wymaga od zwierzęcia najpierw nauczenia się zasady opartej na kierunku (np. "zawsze skręcaj w prawo") lub zasady opartej na wzroku (np. "zawsze skręcaj w kierunku wizualnej wskazówki") do określonego kryterium wydajności. Następnie, zwierzę musi nieoczekiwanie przestawić się albo w poprzek modalności na przeciwną regułę (zmiana strategii, pierwotnie określana jako "zmiana nieodwracalna"¹⁵), albo w obrębie modalności na przeciwną ewentualność (uczenie się odwrócone)^13,14,16. Takie zadania są wrażliwe na zakłócenia w sieciach korowych i podkorowych, obejmujących korę przedczołową, wzgórze i prążkowie^{1,13,14,16-18}. Inny rodzaj zadania polegającego na zmianie nastawienia uwagi (czasami nazywanego zadaniem kopania) wymaga szkolenia zwierząt w rozróżnianiu dwóch pojemników, które różnią się między sobą wzdłuż dwóch lub trzech wymiarów bodźca (podłoże do kopania, zapach i/lub tekstura zewnętrzna). Podobnie jak w przypadku zadania w labiryncie, zwierzęta muszą przemieszczać się między wymiarami (zmiana strategii) lub w obrębie tego samego wymiaru (uczenie się odwrócone), a zadania te są podobnie wrażliwe na manipulacje kory czołowej^11,19. Zaletą tego zadania jest to, że podczas zmiany strategii pozawymiarowej, szczurom prezentowane są nowe zestawy bodźców (wzorce), co zapewnia, że upośledzenie wydajności na tym etapie jest prawdopodobnie spowodowane zakłóceniami w zdolności do przenoszenia uwagi na różne aspekty bodźców złożonych, a nie upośledzoną zdolnością do zaprzestania zbliżania się do określonego bodźca wcześniej związanego z nagrodą. Cecha ta utrudnia jednak również ustalenie specyfiki deficytu podczas ustalonej zmiany.

Chociaż zadania opisane powyżej zostały dobrze udokumentowane w literaturze, oba mają szereg wad proceduralnych, przede wszystkim czas potrzebny na testowanie zwierząt. Zarówno w zadaniu polegającym na przechodzeniu przez labirynt, jak i w kopaniu, tylko jedno zwierzę może być badane na raz; Co więcej, testy muszą być przeprowadzane w czasie rzeczywistym przez dedykowanego eksperymentatora i mogą trwać do kilku godzin dziennie na zwierzę. Ponadto prezentacja bodźców i rejestrowanie reakcji behawioralnych w obu typach zadań są ręcznie kontrolowane przez eksperymentatora, a tym samym są podatne na błąd ludzki i subiektywną interpretację.

Tutaj opisujemy zautomatyzowaną metodę oceny zmiany strategii i odwrócenia uczenia się u szczura, wykorzystując procedury instrumentalne, które usprawniają kontrolę bodźców i prezentację danych, a także znacznie poprawiają szybkość zbierania danych i przepustowość^20,21. Opisano metody stosowane do kształtowania i szkolenia szczurów, a także elementy składowe samego zadania i analizę uzyskanych danych. Odkryliśmy, że podobnie jak zadania związane z przechodzeniem przez labirynt i kopaniem, te zautomatyzowane zadania są wrażliwe na zakłócenia w obwodach przedczołowych i podkorowych, a także na manipulację neurorozwojową, która modeluje schizofrenię^20-23.

Protokół

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w St. Mary's College of Maryland lub Canadian Council on Animal Care na University of British Columbia.

1. Zwierzęta

1. Użyj dorosłego samca szczura Sprague-Dawley lub dorosłego samca szczura Long-Evans.
   UWAGA: Chociaż różnice w wydajności między tymi dwoma szczepami nie zostały formalnie przetestowane, szczury Long-Evans mają tendencję do nabywania wizualnej dyskryminacji wskazówek (opisanych poniżej) nieco szybciej niż szczury Sprague-Dawley (Floresco, niepublikowane obserwacje).
2. Po przybyciu do kolonii dorosłe szczury trzymane są pojedynczo lub w grupach, w zależności od potrzeb eksperymentu i ograniczeń obiektu. Do eksperymentów, w których zwierzętom ogranicza się dostęp do pokarmu, należy używać pojedynczych pomieszczeń, aby zapewnić lepszą kontrolę nad przyjmowaniem pokarmu. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w kolonii (bez obchodzenia się z nimi lub ograniczeń żywieniowych) przez co najmniej 3 dni po przybyciu.
   UWAGA: Niedawny raport sugeruje, że płeć eksperymentatora może niekorzystnie wpływać na pomiary^{bólu i} zachowań lękowych, co może rozciągać się na inne zachowania wrażliwe na stres, w tym funkcje poznawcze. We wszystkich naszych badaniach nie zaobserwowaliśmy żadnych oczywistych różnic w wydajności u szczurów trenowanych przez samce i samice, chociaż formalnie tego nie oceniliśmy.
3. Ze zwierzętami należy obchodzić się codziennie przez około 3-5 minut przez co najmniej 3 dni przed rozpoczęciem testów behawioralnych. W pierwszym dniu pracy należy uzyskać masę ciała do karmienia każdego szczura. Docelowa waga do ograniczenia żywności, jeśli zostanie zastosowana, wyniesie 85-90% tej wolnej masy. Zanotuj tę wagę docelową, np. w zeszycie laboratoryjnym lub na karcie klatki zwierzęcia. W niektórych przypadkach ograniczenie spożycia pokarmu może nie być wymagane, jeśli zastosowany wzmacniacz jest bardzo smaczny (np. słodzone mleko), chociaż zwierzęta mogą zbyt szybko stać się nasycone przy użyciu takich wzmacniaczy.
4. W każdym z dni obchodzenia się z dzieckiem, po zakończeniu pracy z każdym zwierzęciem, należy umieścić około 10-20 granulek nagrody w klatce domowej zwierzęcia, aby przyzwyczaić szczury (które są zazwyczaj neofobiczne) do wzmocnienia, które zostanie użyte w zadaniu (patrz sekcja 2.1.3 poniżej).
5. W ciągu trzech dni pracy należy stopniowo zmniejszać dzienne spożycie pokarmu przez zwierzęta, aby osiągnąć ich docelową wagę. Pamiętaj, aby wskazać na kartach klatki lub innych dokumentach, że zwierzęta są teraz na diecie o ograniczonym zakresie.
   UWAGA: W szczególności ograniczenie dotyczące żywności wymaga zgody instytucji IACUC lub innego organu regulacyjnego przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur. Poniższe ogólne procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednie agencje instytucjonalne autorów; Pamiętaj, aby zapoznać się z odpowiednimi lokalnymi i/lub krajowymi wytycznymi dotyczącymi dodatkowych wymagań w poszczególnych instytucjach.
6. Ważenie zwierząt co najmniej dwa razy w tygodniu w celu monitorowania stanu zdrowia i upewnienia się, że zwierzęta nie spadają znacznie poniżej masy docelowej. Upewnij się, że woda jest swobodnie dostępna przez cały czas.

2. Sprzęt i oprogramowanie

1. Do tych zadań używaj komór operacyjnych wyposażonych w (co najmniej) dwie wysuwane dźwignie, dwie lampki stymulacyjne, światło domowe i dozownik wzmocnienia.
   1. Umieść dźwignie po obu stronach centralnego obszaru dostarczania wzmocnienia z jednym bodźcem umieszczonym nad każdą dźwignią.
   2. Upewnij się, że lampa domowa oświetla całą komorę, nie przeszkadzając jednocześnie w wykrywaniu świateł stymulacyjnych, np. umieść lampę domową na ścianie naprzeciwko dźwigni i świateł stymulacyjnych.
   3. Do wzmocnienia należy użyć smacznego pokarmu (np. granulek sacharozy^20,21 lub roztworów sacharozy²⁵). Wszędzie tam, gdzie jest to wskazane w celu "wzmocnienia zwierzęcia" poniżej, należy dostarczyć jeden granulat sacharozy 45 mg lub jedną przepisaną ilość roztworu sacharozy.
2. Kontroluj prezentację bodźców, obsługę dźwigni i gromadzenie danych za pomocą interfejsu z komputerem. Skontaktuj się z autorami, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat programów zadań napisanych za pomocą oprogramowania MED-PC, programu zaprojektowanego specjalnie do testowania behawioralnego i zbierania danych.
   UWAGA: Kluczową cechą programów używanych do testów behawioralnych jest rejestrowanie kluczowych zmiennych na zasadzie próba po próbie, w tym pozycja światła sygnałowego, dźwignia wybrana przez zwierzę, to, czy zwierzę odpowiedziało poprawnie, nieprawidłowo lub nie odpowiedziało (pominięcie) oraz opóźnienie w dokonaniu wyboru. Dane te mają kluczowe znaczenie dla oceny konkretnych typów błędów popełnianych podczas różnych części sekwencji wyboru, co zostanie opisane poniżej.
3. Na początku treningu wstępnego przypisz każde zwierzę do komory operacyjnej, gdzie będzie testowane każdego dnia przez cały czas trwania eksperymentu. Badane zwierzęta mniej więcej o tej samej porze dnia przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Komory operacyjne należy czyścić regularnie (co najmniej raz w tygodniu) wodą z mydłem i/lub roztworem przeciwdrobnoustrojowym.

3. Trening wstępny

UWAGA: Gdy zwierzęta osiągną swoją docelową wagę, mogą zacząć kształtować się w komorach operacyjnych. Procedury przedtreningowe trwają zwykle około 10-20 dni, ze znaczną zmiennością między szczurami. Rysunek 1C przedstawia przegląd procedur.

1. Kształtuj zwierzęta, aby nacisnąć dźwignię.
   1. Trenuj zwierzęta zgodnie ze schematem zbrojenia o stałym współczynniku (FR)-1, tj. do każdej naciśnięcia dźwigni dostarczane jest jedno zbrojenie. Kształtowanie może być prowadzone albo z wysuniętymi obiema dźwigniami (naciśnięcie jednej z nich jest wzmocnione), albo na jednej dźwigni na raz (np. jedna dźwignia dziennie) z kolejnością (lewa/prawa) zrównoważoną w zależności od zwierząt i/lub warunków doświadczalnych.
      1. W przypadku modelowania z wysuniętymi obiema dźwigniami, kontynuuj sesje kształtowania (jedna 30-minutowa sesja dziennie), aż zwierzęta spełnią minimalne kryterium co najmniej 50-60 naciśnięć na sesję przez dwa kolejne dni. Zwykle trwa to około 3-6 dni.
      2. Aby kształtować każdą dźwignię z osobna, kontynuuj sesje na pierwszej dźwigni, aż zwierzęta zareagują co najmniej 50-60 razy na pierwszą przedstawioną dźwignię. Kolejne sesje kształtowania powinny używać przeciwnej dźwigni, aż szczur ponownie osiągnie to kryterium. Zazwyczaj to drugie kryterium jest szybko nabywane po tym, jak szczury nauczą się naciskać pierwszą dźwignię.
         UWAGA: Kształtowanie jednej dźwigni na raz zajmie więcej czasu (zwierzę musi spełnić kryterium dwa razy, raz dla każdej dźwigni), ale zapewni, że zwierzęta zdobędą doświadczenie w reagowaniu na dwie dźwignie i naprzemiennie między nimi, co jest krytycznym elementem zadań opisanych poniżej.
2. Daj zwierzętom sesje treningowe z wysuwaną dźwignią, aby zapoznać je z wysuwaniem i chowaniem dźwigni oraz upewnić się, że szczury popełniają stosunkowo niewiele pominięć (zwykle <5) do czasu, gdy przejdą do głównych faz testowych zadania.
   1. Podczas każdej próby określ, którą dźwignię należy wysunąć. Naprzemiennie przedłużaj dźwignię w kolejności pseudolosowej, tak aby było 45 prób lewej dźwigni i 45 prób prawej dźwigni, ale nie więcej niż dwie kolejne próby przedłużania tej samej dźwigni.
   2. Wysuń wybraną dźwignię. Wzmocnij zwierzę do naciśnięcia tej dźwigni w ciągu 10 sekund, po czym dźwignia zostanie cofnięta.
   3. Jeśli zwierzę nie zareaguje w ciągu 10 sekund, cofnij dźwignię i zapisz pominięcie.
   4. Rozpocznij próby co 20 sekund przez cały czas trwania sesji.
      UWAGA: Podczas treningu z wysuwaną dźwignią, wstępna ekspozycja na światła stymulacyjne (podświetlenie zarówno lewej, jak i prawej lampki stymulacyjnej przy każdym przedłużeniu dźwigni) może być zastosowana w celu zmniejszenia nowości i istotności świateł panelu, a tym samym zwiększenia trudności późniejszego zadania zmiany zestawu²⁰. Zastosowanie tej procedury znacznie zwiększy liczbę prób wymaganych do osiągnięcia wyników kryterium dyskryminacji wskazówek wizualnych opisanej poniżej, a zwierzęta mogą potrzebować wielu dni, aby nauczyć się tej reguły w tych warunkach.
   5. Kontynuuj sesje treningowe z wysuwaną dźwignią (jedna 30-minutowa sesja dziennie) przez ustaloną liczbę dni lub do momentu, gdy zwierzęta spełnią kryterium co najmniej pięciu lub mniej pominięć przez dwa kolejne dni. Zwykle trwa to około 5-10 dni.
      1. W przypadku badań z użyciem ostrych manipulacji (np. testów na obecność narkotyków) należy stosować stałą liczbę dni (np. 5 dni), aby zapewnić, że wszystkie szczury są podobnie narażone na dźwignie.
3. Oceniaj zwierzęta pod kątem preferencji pobocznych.
   1. Testy preferencji bocznych należy przeprowadzić bezpośrednio po ostatniej sesji treningu z wysuwaną dźwignią (tego samego dnia; patrz rysunek 1C). Zadanie preferencji pobocznej składa się z siedmiu prób, z których każda składa się z od dwóch do ośmiu prób cząstkowych oddzielonych ustalonym 20-sekundowym interwałem międzypróbnym (ITI).
   2. W każdej próbie cząstkowej wysuń obie dźwignie do komory na 10 sekund lub do momentu uzyskania odpowiedzi na naciśnięcie dźwigni. Nie zapalaj lampek stymulacyjnych podczas tej fazy treningu.
   3. Wzmocnij odpowiedź na dowolną dźwignię w pierwszej próbie podrzędnej każdej próby i zapisz ją jako "początkową odpowiedź".
      1. Nie należy wzmacniać odpowiedzi na tej samej dźwigni w kolejnych badaniach cząstkowych w ramach tego samego badania. Zezwalaj na maksymalnie sześć kolejnych odpowiedzi na tej samej dźwigni z próbą, po czym przeprowadź wymuszoną próbę podrzędną. Wymuszona próba podrzędna polega tylko na tym, że przeciwległa dźwignia jest wysuwana na 10 sekund lub do momentu udzielenia odpowiedzi.
   4. Po początkowej odpowiedzi w każdej próbie wzmocnij pierwszą odpowiedź na przeciwnej dźwigni, a następnie zakończ tę próbę. W związku z tym w ramach każdej próby (składającej się z maksymalnie ośmiu prób cząstkowych) zwierzę musi odpowiedzieć co najmniej raz na każdą dźwignię.
   5. Zdefiniuj preferencję boczną każdego zwierzęcia jako stronę, po której wystąpiła większość początkowych reakcji (co najmniej cztery z siedmiu prób).
   6. Jeśli jednak zwierzę nieproporcjonalnie reaguje na jedną dźwignię podczas sesji (zdefiniowaną jako stosunek większy niż 2:1), zapisz tę stronę jako preferencje zwierzęcia.
   7. Rozpocznij badanie następnego dnia po teście preferencji ubocznych.
      UWAGA: Z naszych doświadczeń wynika, że większość zwierząt nie wykazuje silnych preferencji pobocznych. Dla tych, którzy to robią, wymaganie od nich naciskania dźwigni w kierunku przeciwnym do ich uprzedzeń podczas treningu dyskryminacji odpowiedzi gwarantuje, że uczą się konkretnych ewentualności reakcji i nagrody związanych z tą dźwignią, a nie tylko reagują na preferowaną dźwignię.

4. Testowanie

UWAGA: Zwierzęta mogą być testowane w jednej z trzech sekwencji, z których każda obejmuje dwa różne zadania. Zmiana strategii jest oceniana za pomocą (1) zmiany ustawienia od wskazówki do odpowiedzi i/lub (2) zmiany ustawienia od odpowiedzi do odpowiedzi; uczenie się odwrócone jest oceniane za pomocą (3) Odwrócenia odpowiedzi. (Czwarta możliwa sekwencja, Odwrócenie Cue, nie jest zalecana z powodów omówionych poniżej.)

1. Ogólne informacje o zadaniach i sekwencjach.
   1. Każdą sekwencję przeprowadzaj w kolejnych dniach. Każda sekwencja zajmie co najmniej dwa dni (początkowa nauka rozróżniania, a następnie przesunięcie lub odwrócenie).
   2. W jednym zadaniu można użyć maksymalnie od 150 do 200 prób, w zależności od charakteru eksperymentu. (Należy pamiętać, że użycie większej liczby badań z pewnością wydłuży całkowity czas sesji do 60 minut lub więcej, co może być czynnikiem branym pod uwagę w przypadku testów farmakologicznych z użyciem związków o krótszym czasie działania).
   3. Dla każdej sekwencji przetestuj zwierzęta w jednym zadaniu ("Zestaw"), a następnie w drugim zadaniu ("Przesunięcie" lub "Odwrócenie"). Zwierzęta doświadczalne przez maksymalnie 3 dni (tj. 450-600 prób) nad każdym zadaniem, łącznie przez maksymalnie 6 dni.
      1. Z doświadczenia należy usunąć zwierzęta, które nie spełnią kryterium w ciągu 3 dni od wykonania pierwszego zadania ("Zestawu").
      2. W przypadku zwierząt, które nie osiągną kryterium w ciągu 3 dni od wykonania drugiego zadania ("Przesunięcie" lub "Odwrócenie"), należy przypisać maksymalną liczbę punktów za próby do kryterium, które reprezentuje liczbę przeprowadzonych prób (tj. 450 prób przez 3 dni po 150 prób każde).
      3. Jeśli parametry zadania zostały zmodyfikowane tak, aby zwierzęta kontrolne mogły osiągnąć wydajność kryterialną w ciągu jednego dnia, zmodyfikuj zadanie tak, aby wszystkie szczury miały tylko jedną sesję testową, a tym, które nie osiągnęły kryterium w wyznaczonej liczbie prób, przyznaj maksymalną punktację (150-200 prób, w zależności od tego, jak zadanie zostało skonfigurowane).
      4. Podczas zadania zmiany lub odwrócenia, niech zwierzęta albo rozpoczną sesję, musząc natychmiast wykonać nową regułę, albo dadzą im 20 prób "przypominających", w których wykonują zadanie przy użyciu reguły poznanej podczas pierwszej fazy treningu, a następnie reguła zmienia się podczas sesji²².
         UWAGA: Ta ostatnia procedura jest szczególnie przydatna w eksperymentach oceniających potencjalne związki prokognitywne, które mogą poprawić elastyczność, ponieważ może być wykorzystana do wyjaśnienia, czy lepsza wydajność podczas zmiany/odwrócenia wynika konkretnie ze zwiększonej elastyczności lub upośledzonego odzyskiwania poprzedniej reguły, co może ułatwić uczenie się nowej reguły podczas zmiany.
2. Set-shifting: Zadanie sygnalizacji do zadania odpowiedzi.
   1. Rozpocznij testowanie zwierząt w zadaniu Cue (patrz Rysunek 1A), które wzmacnia zwierzęta do reagowania na dźwignię poniżej podświetlonego światła bodźca (cue). Zadanie Cue jest zadaniem "Set" w tej sekwencji.
      1. Rozpocznij każdą próbę ze schowanymi obiema dźwigniami.
      2. Zapal lewe lub prawe światło bodźca na 3 sekundy, a następnie wysuń obie dźwignie do komory na 10 sekund lub do momentu wystąpienia odpowiedzi.
      3. Wzmacniaj tylko prawidłową reakcję na sygnalizowanej dźwigni. Po odpowiedzi na którąkolwiek dźwignię wycofaj dźwignie.
      4. Rozpocznij próby co 20 sekund przez całą sesję. Pseudolosowo określ kolejność prób w taki sposób, aby nie więcej niż dwie kolejne próby wystąpiły z tym samym oświetlonym światłem bodźca (po lewej lub prawej stronie).
      5. Kontynuuj próby do momentu, gdy zwierzę spełni kryterium (ukończy 10 kolejnych prawidłowych odpowiedzi) i ukończy co najmniej 30 prób lub dopóki nie zostanie zakończonych 150-200 prób bez spełnienia kryterium.
      6. Jeśli kryterium nie zostanie spełnione pierwszego dnia, przetestuj zwierzę ponownie w zadaniu Cue drugiego dnia, ale zlikwiduj wymóg wykonania co najmniej 30 prób. Jeżeli kryterium nie zostanie spełnione w drugim dniu, należy poddać zwierzę badaniu w trzecim dniu, zgodnie z tą samą procedurą.
   2. Następnego dnia po osiągnięciu kryterium w zadaniu Cue, przenieś zwierzęta do zadania Response (patrz Rysunek 1B), które wzmacnia zwierzęta do reagowania na dźwignię przeciwną do ich preferencji bocznych, niezależnie od oświetlenia światłem bodźca (cue). Zadanie Odpowiedź jest zadaniem "Zmiana" w tej sekwencji.
      1. Rozpocznij każdą próbę ze schowanymi obiema dźwigniami.
      2. Zapal lewe lub prawe światło bodźca na 3 sekundy, a następnie wysuń obie dźwignie do komory na 10 sekund lub do momentu wystąpienia odpowiedzi. (Zauważ, że położenie światła bodźca nie ma znaczenia dla tego zadania).
      3. Wzmacniaj reakcję tylko na prawej dźwigni pozycji (lewej lub prawej, przeciwnej do preferencji bocznych zwierzęcia). Po odpowiedzi na którąkolwiek dźwignię wycofaj dźwignie.
      4. Rozpocznij próby co 20 sekund przez całą sesję. Pseudolosowo określ kolejność prób w taki sposób, aby nie więcej niż dwie kolejne próby wystąpiły z tym samym oświetlonym światłem bodźca (po lewej lub prawej stronie).
      5. Kontynuuj próby do momentu, gdy zwierzę spełni kryterium (udzieli 10 kolejnych prawidłowych odpowiedzi) lub dopóki nie zostanie zakończonych 150 prób bez spełnienia kryterium.
      6. Jeśli kryterium nie zostanie spełnione w pierwszym dniu, przetestuj zwierzę w zadaniu Odpowiedź ponownie w drugim dniu. Jeżeli kryterium nie zostanie spełnione w drugim dniu, należy poddać zwierzę badaniu w trzecim dniu, zgodnie z tą samą procedurą.

Rysunek 1: Zadania dyskryminacyjne stosowane w sekwencji zmiany zestawu. Na tym rysunku wyświetlane są zadania wykonywane w sekwencji Cue-to-Response; Zauważ, że zadania są takie same, tylko w odwrotnej kolejności, w sekwencji Response-to-Cue. (A) Podczas uczenia się rozróżniania wskazówek wizualnych, zwierzęta są wzmacniane do reakcji na dźwignię pod wpływem oświetlonego światła bodźca. (B) Podczas uczenia się dyskryminacji reakcji, zwierzęta są wzmacniane do reagowania na jedną dźwignię (po lewej lub prawej stronie), niezależnie od położenia światła bodźca. (C) Schemat blokowy przedstawiający sekwencję faz treningu dla typowego eksperymentu zmiany strategii, od treningu wstępnego do testowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Set-shifting: Odpowiedź na Cue.
   UWAGA: Ta sekwencja jest tą, która najbardziej korzysta z dodania warunku światła wizualnego przed ekspozycją do treningu^{wstępnego 20,21} (patrz krok 3.2.4 powyżej). Wcześniejsze badania wykazały, że wstępne wystawienie szczurów na działanie świateł podczas treningu z wysuwaną dźwignią sprawia, że zmiana reakcji na sygnał jest trudniejsza i zależna od przyśrodkowej kory przedczołowej. I odwrotnie, inaktywacje przedczołowe nie upośledzają tego typu przesunięcia, jeśli te procedury przedtreningowe nie są stosowane²⁰.
   1. Rozpocznij testowanie na zwierzętach w zadaniu Reakcja, które wzmacnia zwierzęta do reagowania na dźwignię przeciwną do ich preferencji bocznych, niezależnie od oświetlenia światłem bodźca (cue). Zadanie Odpowiedź jest zadaniem "Ustaw" w tej sekwencji.
      1. Kontynuuj testowanie zgodnie z opisem w kroku 4.2.2 (Zadanie odpowiedzi) powyżej.
      2. Niech zwierzęta ukończą co najmniej 30 prób w tym zadaniu, ponieważ jest to zadanie "Zestaw".
   2. Następnego dnia po osiągnięciu kryterium w zadaniu Odpowiedź, przenieś zwierzęta do zadania Cue, które wzmacnia zwierzęta do reagowania na dźwigni poniżej podświetlonego światła bodźca (cue). Zadanie Cue jest zadaniem "Shift" w tej sekwencji.
      1. Kontynuuj testowanie zgodnie z opisem w kroku 4.2.1 (Zadanie Cue) powyżej. Minimum 30 ukończonych prób nie jest wymagane, gdy to zadanie jest zadaniem "Zmiana".
4. Odwrócenie odpowiedzi.
   1. Rozpocznij testowanie na zwierzętach w zadaniu Reakcja, które wzmacnia zwierzęta do reagowania na dźwignię przeciwną do ich preferencji bocznych, niezależnie od oświetlenia światłem bodźca (cue). Zadanie Odpowiedź jest zadaniem "Ustaw" w tej sekwencji.
      1. Kontynuuj testowanie szczegółowo opisane w kroku 4.2.2 (Zadanie odpowiedzi) powyżej.
      2. Niech zwierzęta ukończą co najmniej 30 prób w tym zadaniu, ponieważ jest to zadanie "Zestaw".
   2. Następnego dnia po osiągnięciu kryterium w zadaniu Odpowiedź, testuj zwierzęta na odwróceniu zadania Odpowiedź, które wzmacnia zwierzęta do reagowania na przeciwnej dźwigni niż w pierwszym zadaniu, tj. dźwigni odpowiadającej ich pierwotnym preferencjom bocznym. To nowe zadanie Odpowiedź jest zadaniem "Odwrócenie" w tej sekwencji.
      1. Kontynuuj badanie zgodnie z opisem w kroku 4.2.2 powyżej, z wyjątkiem sytuacji, gdy wzmocniona pozycja dźwigni jest teraz równa pierwotnym preferencjom bocznym zwierzęcia.

5. Miary behawioralne

1. Rejestruj próby do kryterium zarówno w zadaniu "Zestaw", jak i w zadaniu "Przesunięcie". Próba do kryterium jest główną miarą dokładności, definiowaną jako liczba prób wymaganych do ukończenia 10 kolejnych prób, w tym tych 10 prób. Należy zauważyć, że liczba pominięć powinna być wyłączona z tej miary (np. jeśli szczur potrzebuje 100 prób, aby spełnić kryterium i popełni 10 pominięć, rzeczywiste próby spełnienia kryterium wynoszą 90).
2. Policz liczbę błędów popełnionych przed osiągnięciem kryterium zarówno w zadaniu "Zestaw", jak i w zadaniu "Przesunięcie". Błędy według kryterium to uzupełniająca miara dokładności, która może być bardziej czuła niż próby według kryterium i nie ma na nią wpływu zwiększona liczba pominięć.
3. W przypadku typów błędów przesunięcia należy dalej analizować typy błędów popełnionych w zadaniu "Przesunięcie" sekwencji zmiany zestawu.
   1. Policz błąd jako "typ perseweratywny/regresywny", gdy zwierzę odpowiada niepoprawnie w zadaniu "Zmiana" zgodnie z regułą, która była poprawna w zadaniu "Ustaw" z poprzedniego dnia. Następnie skorzystaj z poniższych wskazówek, aby podzielić błędy tego typu odpowiednio na perseweratywne i regresywne.
      1. Podziel sesję "Shift" na bloki po 16 kolejnych zakończonych prób (nie uwzględniaj pominiętych prób). W każdym bloku zidentyfikuj, które błędy pasują do definicji tego typu, tj. szczur udzielił nieprawidłowej odpowiedzi, która odpowiada regule zadania "Ustaw". W każdym bloku 16 prób będzie maksymalnie 8 możliwych błędów tego typu.
      2. Oceniaj błędy jako wytrwałe, dopóki nie zostanie popełnionych mniej niż sześć z nich w bloku.
      3. Zaczynając od następnego bloku i kontynuując do końca zadania, oznacz błędy tego typu jako regresywne.
      4. Jeśli zwierzę było testowane w zadaniu "Zmiana" dłużej niż jeden dzień, kontynuuj ocenianie błędów, tak jakby bloki przylegały do siebie.
   2. Policz błąd jako "nigdy nie wzmocniony", gdy zwierzę zareaguje niepoprawnie w zadaniu "Zmiana" odpowiedzią, która nie była poprawna ani w zadaniu "Ustaw", ani "Przesunięcie".
4. W przypadku typów błędów odwrócenia należy dokładniej przeanalizować typy błędów popełnionych w zadaniu "Odwrócenie" sekwencji uczenia się odwrócenia. Błędy odwrócenia dzielą się na dwa wymiary: (1) na błędy perseweratywne i regresywne oraz (2) na błędy dystraktora i odchylenia od dystraktora.
   1. Podziel całkowitą liczbę błędów na perseweratywne i regresywne.
      1. Podziel sesję "Odwrócenia" na bloki 16 kolejnych zakończonych prób. Policz błędy w każdym bloku (możliwe jest maksymalnie 16 błędów).
      2. Oceniaj błędy jako pereweracyjne, dopóki nie zostanie popełnionych mniej niż 10 z nich w bloku.
      3. Zaczynając od następnego bloku i kontynuując do końca zadania, oznacz błędy jako regresywne.
      4. Jeśli zwierzę było testowane w zadaniu "Odwrócenie" dłużej niż jeden dzień, kontynuuj ocenianie błędów tak, jakby bloki przylegały do siebie.
   2. Podziel łączne błędy na dystraktor w kierunku (światło bodźca świeciło się nad niewłaściwą, wciśniętą dźwignią) i z dala od dystraktora (światło bodźca świeciło się nad właściwą, niewciśniętą dźwignią).
5. Zapisz liczbę pominiętych badań, aby zapewnić szeroką miarę poziomu motywacji zwierzęcia.
   1. Sprawdzaj wyniki pominięć po każdej codziennej sesji testowej, aby wykluczyć awarię sprzętu, na którą mogą wskazywać wysokie wyniki pominięć.
   2. W przypadku braku nieprawidłowego działania sprzętu należy wykluczyć dane dotyczące pominięć u zwierząt z nienormalnie dużą liczbą pominięć (zazwyczaj ≥3 odchylenia standardowe powyżej średniej) w którymkolwiek z zadań.
6. Rejestruj opóźnienia odpowiedzi, mierząc czas, jaki upłynął między wysunięciem dźwigni a reakcją. Opóźnienia stanowią przybliżoną miarę funkcji motorycznej i/lub szybkości przetwarzania.

Wyniki

Ostra, odwracalna inaktywacja kory przedczołowej może być dokonana poprzez infuzję miejscowo znieczulającego chlorowodorku bupiwakainy (0,75%, 0,5 μl) do obszaru przedlimbicznego za pomocą chirurgicznie wszczepionej kaniuli infuzyjnej²⁰ około 10 minut przed badaniem. Co więcej, efekty inaktywacji zarówno podczas pierwszego zadania ("Zestaw"), jak i drugiego zadania ("Przesunięcie" lub "Odwrócenie") mogą być oceniane w celu zbadania możliwego ogólnego wpływu na uczenie się. Rysunek 2 ilustruje wyniki takich inaktywacji na zwierzętach wykonujących sekwencję zmiany strategii od Cue-to-Response. Inaktywacja przedczołowa pierwszego dnia, zadanie Cue/"Set", nie pogorszyła wydajności (Figura 2A), co sugeruje, że przyśrodkowa kora przedczołowa nie jest niezbędna do początkowego uczenia się dyskryminacji. Jednak inaktywacja przedczołowa w drugim dniu, zadanie Response/"Shift", znacznie pogorszyła wydajność, ponieważ zwierzęta wymagały znacznie większej liczby prób, aby osiągnąć wydajność kryterialną (Figura 2B). Kiedy kora przedczołowa była dezaktywowana, zwierzęta popełniały więcej błędów podobnych do perseweracyjnych niż nigdy nie wzmocnionych błędów w zadaniu Shift (Ryc. 2C). Odkrycia te powielają wcześniejsze dane dotyczące znaczenia przyśrodkowej kory przedczołowej dla zmiany strategii, a w szczególności dla tłumienia wcześniej wyuczonej strategii^13,20.

Na odwrót, zwierzęta wyszkolone w sekwencji odwrócenia odpowiedzi nie wykazywały tej zależności przedczołowej. Zwierzęta, u których inaktywowano korę przedczołową w dniu "odwrócenia", nie różniły się od zwierząt, którym podawano sól fizjologiczną, ani pod względem początkowej dyskryminacji odpowiedzi (Figura 3A), ani późniejszego odwrócenia (Figura 3B)²⁰. Odkrycia te są zgodne z wcześniejszymi badaniami pokazującymi, że kora oczodołowo-czołowa, a nie przyśrodkowa kora przedczołowa, reguluje odwrócone uczenie się w różnych zadaniach^12,19,26, w tym w zadaniu instrumentalnym podobnym do opisanego tutaj²⁷.

Rysunek 2. Dezaktywacja kory przedczołowej upośledza zmianę strategii. ZA, Próby kryterium początkowego zadania dyskryminacji sygnałów ("Zestaw") przez szczury otrzymujące wlewy soli fizjologicznej lub bupiwakainy (Bupi) do przyśrodkowej kory przedczołowej w ustalonym dniu. Inaktywacja przedczołowa nie miała wpływu na początkową akwizycję. Ur, Próby mające na celu kryterium przejścia do zadania odpowiedzi ("Zmiana") po przyśrodkowych wlewach przedczołowych soli fizjologicznej lub bupiwakainy w dniu zmiany. Dezaktywacja kory przedczołowej upośledzała zmianę strategii na zadanie reagowania. C, Rodzaje błędów popełnianych przez zwierzęta w dniu zmiany. Inaktywacja przedczołowa przed zadaniem zmiany (grupa "sal-bupi") doprowadziła do wzrostu błędów podobnych do perseweracji. *, p < 0,05 w porównaniu z solą fizjologiczną. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Floresco i wsp.²⁰ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Dezaktywacja kory przedczołowej pozostawia nienaruszone odwrócenie uczenia się. A, Próby kryterium podczas treningu dyskryminacji początkowej odpowiedzi przez szczury, które następnie otrzymałyby wlewy soli fizjologicznej lub bupiwakainy (Bupi) do przyśrodkowej kory przedczołowej przed treningiem odwrócenia. Nie zaobserwowano żadnych różnic. Ur, Próby kryterium podczas odwrócenia dyskryminacji odpowiedzi, po przyśrodkowych wlewach przedczołowych soli fizjologicznej lub bupiwakainy. Inaktywacja przedczołowa nie upośledzała uczenia się odwróconego. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Floresco i wsp.²⁰

Dane przedstawione na rysunku 4 stanowią przykład tego, jak wymaganie od szczurów przeprowadzenia prób "przypominających" przy użyciu starej reguły przed zmianą strategii może pomóc w interpretacji danych. W tym badaniu (Enomotor i Floresco, niepublikowane obserwacje) szczury zostały dopasowane pod kątem wydajności po nabyciu reguły wskazówek wizualnych w dniu 1 (Figura 4A). W dniu 2 szczury otrzymywały podłoże lub 0,2 mg/kg haloperidolu. Na początku sesji testowej Dnia 2 przeprowadzono 20 prób, w których musieli odpowiedzieć za pomocą reguły wskazówek wizualnych nabytej w Dniu 1, po czym reguła zmieniła się w połowie sesji na dyskryminację odpowiedzi. Jak pokazano na rysunku 4B, zabieg ten upośledzał odzyskiwanie reguły wizualnej wskazówki podczas pierwszych 20 prób przypominających sesji. Następnie szczury leczone haloperidolem wymagały mniejszej liczby prób w celu osiągnięcia kryterium (Figura 4C) i popełniały mniej błędów perseweracyjnych (Figura 4D) przy zmianie strategii. Należy zauważyć, że gdybyśmy nie korzystali z prób przypominających przed zmianą, dane te mogłyby zostać zinterpretowane jako poprawa w zakresie zmiany zestawu przez haloperidol. Jednak upośledzenie podczas fazy odzyskiwania reguł sugeruje, że efekty te są lepiej rozumiane jako upośledzenie pamięci dla wcześniej nabytej reguły, co mogło prowadzić do mniejszego konfliktu odpowiedzi, gdy szczury musiały nauczyć się nowej reguły, a tym samym szybszej zmiany.

Rysunek 4. Upośledzone odzyskiwanie reguł i ułatwione przesuwanie ustawień wywołane leczeniem haloperidolem. ZA, Próby mające na celu kryterium dyskryminacji sygnałów wzrokowych u szczurów, które miały otrzymać nośnik (sól fizjologiczna) lub antagonistę dopaminy D2 haloperidol (0,2 mg / kg) przed sekwencją zmiany strategii następnego dnia. Zwierzęta w obu grupach wykazywały porównywalną wydajność przed podaniem leku. Ur, Na początku testów w dniu 2 szczury otrzymały 20 prób przypominających, w których musiały kontynuować reagowanie przy użyciu zasady wskazówek wizualnych od dnia 1. Leczenie haloperidolem znacznie zmniejszyło dokładność podczas tych prób przypominających. C, Po 20 próbach przypomnienia, reguła zmieniła się w połowie sesji na dyskryminację odpowiedzi. Szczury leczone haloperidolem wymagały mniejszej liczby prób w celu osiągnięcia kryterium podczas zmiany. D. Leczenie haloperidolem zmniejszyło również liczbę błędów perseweracyjnych. Chociaż dane te mogą sugerować poprawę wydajności, upośledzenie wyświetlania wyszukiwania reguł w B wskazuje, że pozorna "wzmocniona zmiana strategii" jest bardziej prawdopodobna dzięki zmniejszonej interferencji ze strony poprzednio nabytej reguły. Enomoto i Floresco, obserwacje niepublikowane. *, p < 0,05 w porównaniu z pojazdem.

Manipulacja zmianami w brzusznym hipokampie (NVHL) u noworodków została wykorzystana do modelowania niektórych aspektów schizofrenii u szczurów²⁸, szczególnie zaburzeń poznawczych^29,30. Krótko mówiąc, zmianę ekscytotoksyczną podaje się do hipokampa 7-dniowych szczurów, a testy przeprowadza się u dorosłych (60+ dni po porodzie). Modeluje to hipotetyczną trajektorię rozwoju schizofrenii²⁸. Rysunek 5 ilustruje wydajność NVHL i szczurów kontrolnych na wstępnie naświetlonej wersji sekwencji Set-Shifting: Response to Cue. Szczury NVHL nie są upośledzone w uczeniu się pierwszej reguły (Odpowiedź/"Zestaw", Figura 5A), ale są dramatycznie upośledzone po przejściu na nową regułę (Cue/"Przesunięcie"), jak pokazuje wzrost liczby prób wymaganych do osiągnięcia kryterium (Figura 5B). Co więcej, deficyt ten wynikał przede wszystkim ze wzrostu liczby błędów perseweracyjnych, co ilustruje rysunek 5C, sugerujący nieprawidłowości przedczołowe^20,21. Wyniki te potwierdzają wcześniejsze odkrycia dotyczące upośledzonej zmiany strategii u zwierząt NVHL przy użyciu zadania²⁹ w labiryncie krzyżowym.

Podobnie jak w przypadku danych od zwierząt inaktywowanych przedczołowo pokazanych powyżej, zwierzęta NVHL nie były upośledzone przy odwróconym uczeniu się (Rysunek 6A,B), chociaż reagowały wolniej (Rysunek 6C,D). To negatywne odkrycie sugeruje, że obserwowane deficyty zmiany strategii nie są spowodowane zwykłą niezdolnością do przełączania się między bodźcami²¹.

Rysunek 5. Upośledzona zmiana ustawień w modelu schizofrenii NVHL. Wydajność na wstępnie naświetlanej wersji sekwencji zmiany zestawu (Response-to-Cue) u NVHL i pozorowanych zwierząt kontrolnych. ZA, Zwierzęta NVHL nie były upośledzone w zadaniu Response ("Set"). Ur, Jednak zwierzęta NVHL wymagały znacznie więcej prób niż pozorów, aby osiągnąć kryterium w zadaniu Visual Cue ("Shift"). C, Błędy w dniu "Zmiany". Zwierzęta NVHL popełniały więcej błędów perseweracyjnych niż zwierzęta pozorowane, ale nie różniły się pod względem błędów regresywnych lub nigdy nie wzmocnionych. *, p < .05 vs. pozorne. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Placek et al.²¹

Rysunek 6. Brak upośledzenia NVHL w uczeniu się odwróconym. A, B, NVHL i zwierzęta pozorowane nie różniły się pod względem zdolności do przyswojenia ani początkowego zadania uczenia się odpowiedzi ("zestaw"), ani odwrócenia odpowiedzi. C,D, Zwierzęta NVHL były wolniejsze niż pozorowane, aby reagować zarówno na zadania "Zestaw", jak i "Odwrócenie". Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Placek et al.²¹

Na koniec, testy pilotażowe wykazały, że zwierzęta praktycznie nie są w stanie nauczyć się odwrócenia zadania Cue, tj. naciśnięcia dźwigni naprzeciwko podświetlanego światła bodźca. Pięć z sześciu badanych zwierząt ukończyło 450 prób odwrócenia (3 dni) bez spełnienia kryterium, a szóste zwierzę wymagało 418 prób (Brady, obserwacje niepublikowane; dane nie pokazane). Jest to prawdopodobne, ponieważ światła bodźców są bardzo wyraźnymi i atrakcyjnymi sygnałami, które bardzo utrudniają szczurom skierowanie reakcji z dala od nich. Dlatego ta sekwencja testów nie jest zalecana.

Dyskusja

Rozwój zadań behawioralnych w celu pomiaru konstruktów poznawczych wyższego rzędu u gryzoni jest niezbędny do pogłębienia wiedzy na temat neurobiologii poznania. Dzięki dobrze skonstruowanym i zatwierdzonym zadaniom gryzonie mogą być oceniane pod kątem zadań o złożoności rywalizującej z zadaniami naczelnych, a nawet ludzi. Tutaj pokazaliśmy, w jaki sposób dwa aspekty funkcji wykonawczych, zmiana strategii i uczenie się zwrotne, mogą być badane u gryzoni przy użyciu zautomatyzowanych technik operacyjnych. Korzystając z tych zautomatyzowanych zadań, powtórzyliśmy wcześniejsze odkrycia w zadaniach cross-maze i diggingu dotyczących neuronalnych substratów uczenia się z przesunięciem i odwróceniem^{11,13,18-21,27,29}, co sugeruje, że zadania instrumentalne są ważnymi ocenami tych konstruktów.

Te zautomatyzowane zadania mają wiele zalet i zalet w porównaniu z istniejącymi niezautomatyzowanymi zadaniami krzyżowania labiryntów i kopania. Najbardziej przekonująca jest lepsza szybkość zbierania danych w zautomatyzowanej wersji operacyjnej. Codzienny trening lub test trwa tylko 30-60 minut i jest w pełni sterowany komputerowo, wymagający minimalnego nadzoru ze strony eksperymentatora. Co więcej, kilka zwierząt może być testowanych jednocześnie za pomocą wielokomorowej konfiguracji operacyjnej. Każda seria zadań, od kształtowania do końcowych testów, może zostać zrealizowana w ciągu około 2-3 tygodni. Kolejną ważną zaletą zautomatyzowanych zadań jest precyzyjna kontrola prezentacji bodźców, co minimalizuje możliwość błędu eksperymentatora. Na przykład, kolejność prezentacji lokalizacji wskazówek w każdej próbie jest losowa i kontrolowana przez komputer, a nie przez eksperymentatora ręcznie przeglądającego listę prób po próbach. Czas między próbami jest precyzyjnie mierzony i spójny, i nie jest zakłócony przez czas potrzebny eksperymentatorowi, aby np. usunąć szczura z labiryntu lub przestawić pojemniki do kopania. Dostarczanie zbrojenia odbywa się automatycznie i nie jest obarczone błędem eksperymentatora (np. zapomnienie o zanęceniu odpowiedniego ramienia labiryntu krzyżowego). Gromadzenie danych jest podobnie ulepszone dzięki automatycznemu rejestrowaniu wzorców odpowiedzi, w tym pomiarowi dokładnych opóźnień odpowiedzi. W przypadku braku innych nieprawidłowości motorycznych, zmiany w opóźnieniach odpowiedzi można wykorzystać do wnioskowania o zmianach prędkości przetwarzania i/lub oceny poziomu złożoności poznawczej zadania^21,22.

Zautomatyzowane zadania zachowują również jedną ważną zaletę zadań między labiryntami: możliwość przeprowadzenia szczegółowej analizy rodzajów błędów popełnionych w dniu zmiany lub odwrócenia. Rozróżnienie między błędami zmiany zestawów, które powielają strategię z poprzedniego dnia (błędy perseweracyjne lub regresywne) a błędami, które reprezentują wcześniej niewypróbowane strategie (błędy nigdy nie wzmocnione) może pomóc w scharakteryzowaniu konkretnych deficytów elastyczności behawioralnej. W szczególności błędy persewerywne występujące na wczesnym etapie badań odzwierciedlają niezdolność zwierzęcia do porzucenia poprzedniej strategii, podczas gdy późniejsze błędy regresywne odzwierciedlają niezdolność zwierzęcia do utrzymania nowej strategii po ustaniu perseweracji²⁰. Błędy, które nigdy nie zostały wzmocnione, mogą wskazywać na niepowodzenie w przyswojeniu nowej strategii lub niezdolność do systematycznego reagowania zgodnie z regułą²⁰. Wcześniejsze odkrycia^16,17,20 wykazujące dysocjowalne neuroanatomiczne podstawy tego typu błędów są również cenne w interpretacji wyników tych zadań.

Nasze procedury zostały opracowane i zoptymalizowane do stosowania u szczurów. Biorąc to pod uwagę, inne grupy stosowały podobne procedury do testowania zdolności zmiany zestawu u myszy³¹. Jednak pewne modyfikacje muszą być zastosowane u myszy, aby dostosować się do różnic gatunkowych. Obejmują one dłuższą prezentację wizualnej lampki ostrzegawczej przed wysunięciem dźwigni, trening przez wiele dni przy użyciu 30 prób dziennie oraz wprowadzenie kary za przerwę w grze po nieprawidłowych wyborach. Chociaż te modyfikacje sprawiają, że test ten jest mniej podatny na stosowanie w przypadku wyzwań farmakologicznych, może okazać się przydatny do oceny elastyczności poznawczej u genetycznie zmienionych myszy (chociaż nie jest jasne, czy te modyfikacje zachowałyby wrażliwość kory czołowej zadania).

Oczywiście istnieją również ograniczenia dotyczące tych zadań. Niektóre z tych ograniczeń wynikają ze zautomatyzowanego charakteru zadania, podczas gdy inne są związane z parametrami samego zadania. Jeśli chodzi o to ostatnie, opisane tutaj zadanie polegające na zmianie zestawu (jak również zadanie²⁶ polegające na zmianie zestawu w labiryncie) wykorzystuje ograniczony zestaw bodźców i reakcji. W przeciwieństwie do zadania polegającego na kopaniu, w którym nowe przykłady (np. nieznane zapachy lub media do kopania) mogą być używane do konstruowania nowych zestawów uwagi na każdym etapie^11,19, zadanie instrumentalnego zmieniania zestawu z konieczności wymaga wyboru między dwoma bodźcami, które są znane zwierzęciu – albo lewą i prawą lampką wskazującą, albo pozycją lewą i prawą. Oznacza to, że zadania związane z operacyjnym i międzylabiryntowym przerzucaniem zbiorów obejmują zarówno konflikt reakcji, jak i zmianę strategii, chociaż koncepcja przeniesienia strategii do nowego, wcześniej nieistotnego wymiaru bodźca jest zachowana^20,23. W związku z tym, opisane tutaj zadania operacyjne polegające na przesunięciu i odwróceniu zestawu nie pozwalają na trzeci wymiar bodźca, jak w zadaniu kopania, które może obejmować kopanie mediów, zapachu i tekstury^11,19. Nie uważamy tego jednak za śmiertelną wadę, ponieważ zadanie instrumentalnej zmiany ustawienia nadal wymaga od zwierzęcia stłumienia wcześniej istotnej strategii dyskryminacji i zwrócenia uwagi na wcześniej ignorowany wymiar bodźca. Ponadto wydaje się możliwe, że modyfikacje parametrów sprzętu i zadania mogłyby wspierać dodanie trzeciego wymiaru bodźca, takiego jak sygnały słuchowe lub zapach, chociaż te dodatki prawdopodobnie utrudniłyby uczenie się i byłyby mniej podatne na jednodniowe testy farmakologiczne.

Wreszcie, potencjalnym ograniczeniem każdego zadania opartego na instrumentach jest utrata bezpośrednich informacji na temat zachowania szczurów – tj. eksperymentator nie obserwuje już szczura. Uważamy, że korzyści w zakresie obiektywności i szybkości gromadzenia danych, jakie daje automatyzacja, z nawiązką rekompensują tę stratę, a kamery zamontowane w komorach operacyjnych są stosunkowo łatwym sposobem na przywrócenie indywidualnego dostępu wizualnego w razie potrzeby.

Istnieje kilka kroków, które można podjąć, aby zmaksymalizować sukces przy użyciu tych zadań operacyjnych. Po pierwsze, nie można przecenić znaczenia obchodzenia się ze zwierzętami przed rozpoczęciem treningu; Podobnie jak w przypadku każdego zadania behawioralnego, dobrze traktowane zwierzęta są łatwiejsze w obsłudze, są mniej zestresowane i mają tendencję do generowania mniej zmiennych danych. Po drugie, niektóre testy pilotażowe mogą być konieczne w celu określenia najlepszej pory dnia na przeprowadzenie testów; Testujemy podczas cyklu świetlnego i stwierdzamy, że wydajność jest optymalna, gdy zwierzęta są testowane pod koniec tego cyklu (np. około 16:00 w przypadku cyklu świetlnego kończącego się o 19:00). Po trzecie, należy zadbać o potwierdzenie, że stabilna wydajność jest ustalana na każdym etapie przygotowania do następnego etapu, zanim zwierzę przejdzie do następnego etapu. Na przykład, konsekwentna i solidna wydajność na etapie szkolenia z wysuwaną dźwignią jest doskonałym predyktorem biegłej wydajności w "ustawionym" zadaniu dyskryminacji. Jeśli chodzi o sprzęt, chociaż wszystkie kroki są zautomatyzowane, konieczna jest interwencja eksperymentatora, aby potwierdzić, że wszystkie komponenty są sprawne. Na przykład kontrola sprzętu powinna być przeprowadzana codziennie (lub częściej niż raz dziennie, jeśli testowana jest duża liczba zwierząt), aby upewnić się, że wszystkie światła, dźwignie i systemy dostarczania nagród są sprawne. W szczególności awarie systemów dostarczania nagród (zwłaszcza dozowników granulek) mogą drastycznie wpłynąć na wydajność. Niezwykle duża liczba pominięć w danym dniu może wskazywać na problem ze sprzętem do dostarczania nagrody, dlatego dane wyjściowe powinny być sprawdzane codziennie przez eksperymentatora zaznajomionego z zadaniem i oczekiwanymi poziomami wydajności. W przypadku braku awarii sprzętu, duża liczba pominięć może wskazywać na inne problemy z motywacją lub zdrowiem zwierząt. Jeśli zwierzę jest poza tym zdrowe, ograniczenie pokarmu może zostać zwiększone, aby doprowadzić zwierzę do 80-85% masy ciała podczas karmienia na luzie przez krótki czas, aż do powrotu do sprawności.

Te zadania polegające na przesunięciu i odwróceniu zbiorów mogą być używane w różnych paradygmatach eksperymentalnych. Na przykład można badać skutki manipulacji, takich jak zmiany chorobowe, terapie rozwojowe, manipulacje dietetyczne, długoterminowe leczenie farmakologiczne lub modyfikacje genetyczne. Podczas gdy wpływ leczenia na etap zmiany lub odwrócenia serii może być głównym zainteresowaniem, należy zauważyć, że ponieważ takie przewlekłe lub stałe leczenie musi być koniecznie zastosowane przed rozpoczęciem treningu, należy również zbadać wpływ na wiele etapów wydajności (szczególnie na początkową dyskryminację lub "zestaw")²¹. Stosowanie ostrych manipulacji, takich jak leczenie farmakologiczne lub tymczasowe inaktywacje neuroanatomiczne, jest szczególnie dobrze przystosowane do tych zadań. W takich przypadkach przydatne jest dodanie trzeciej grupy (jak pokazano na rysunku 2); W ten sposób pierwotna grupa eksperymentalna otrzymuje manipulację będącą przedmiotem zainteresowania w dniu zmiany lub odwrócenia, podczas gdy jedna grupa kontrolna otrzymuje manipulację w dniu początkowej dyskryminacji lub "zestawu" w celu przetestowania szerokiego wpływu na uczenie się, a druga grupa kontrolna nie otrzymuje żadnych manipulacji (lub pozorowanych zabiegów) w obu dniach^20,22. Należy zauważyć, że w przypadku takich badań nad ostrą manipulacją wskazane jest dopasowanie szczurów pod kątem wydajności podczas uczenia się początkowego zestawu i przypisanie ich odpowiednio do grupy eksperymentalnej i (drugiej) grupy kontrolnej. Minimalizuje to prawdopodobieństwo, że różnice w wydajności wywołane leczeniem mogą być zakłócone przez indywidualne różnice w tym, jak łatwo szczury uczą się rozróżniać bodźce. Ponadto, jeśli eksperyment wymaga testowania wielu kohort przez tygodnie lub miesiące, każda kohorta powinna obejmować zwierzęta ze wszystkich grup eksperymentalnych. Na przykład badanie testujące skutki ostrych manipulacji farmakologicznych podczas zmiany może wymagać łącznie 48 szczurów i 3 grup eksperymentalnych, testowanych w trzech kohortach po 16 zwierząt każda. W takim przypadku każda kohorta powinna zawierać 5-6 szczurów w każdej grupie eksperymentalnej. Idealnie byłoby, gdyby analizy statystyczne zawierały czynnik, który potwierdza, że nie było różnic w wydajności w każdej kohorcie szczurów. Wreszcie, te zadania instrumentalne mogą być szczególnie przydatne do stosowania technik rejestracji in vivo , w tym mikrodializy, woltamperometrii i elektrofizjologii, ze względu na takie elementy, jak kontrolowane środowisko, precyzyjny czas prezentacji bodźca i reakcji oraz ograniczone ruchy zwierząt, które nie są dostępne lub praktyczne w zadaniach związanych z przechodzeniem przez labirynt lub kopaniem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pakiet komory behawioralnej z wysuwanymi dźwigniami	Med Associates, Inc.	MED-008-B2	Wymagane komponenty to dwie wysuwane dźwignie, dwie lampki stymulacyjne, oświetlenie domu i system dostarczania wzmocnienia
Oprogramowanie MED-PC	Med Associates, Inc.	Oprogramowanie SOF-735
MPC2XL	firmy Med Associates, Inc.	SOF-731	Narzędzie do przesyłania danych do importu surowych danych do formatu Excel
Bezpyłowe granulki precyzyjne, 45 mg, cukier	Bio-Serv	F0042