Obrazowanie dyfuzyjne w szyjnym rdzeniu kręgowym szczura

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej jakości obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (DWI) rdzenia kręgowego szczura w celu nieinwazyjnej charakterystyki mikrostruktury tkanki. Protokół ten opisuje optymalizacje sekwencji rezonansu magnetycznego, cewki o częstotliwości radiowej i metod analizy, aby umożliwić tworzenie obrazów DWI wolnych od artefaktów.

Streszczenie

Rezonans magnetyczny (MRI) to najnowocześniejsze podejście do nieinwazyjnej oceny stanu rdzenia kręgowego, które może być używane jako narzędzie diagnostyczne i prognostyczne w przypadku choroby lub urazu. Obrazowanie dyfuzyjne ważone (DWI) jest wrażliwe na ruch termiczny cząsteczek wody i pozwala na wnioskowanie o mikrostrukturze tkanek. W tym raporcie opisano protokół pozyskiwania i analizy DWI rdzenia kręgowego szyjki macicy szczura w systemie zwierzęcym o małym otworze. Demonstruje konfigurację obrazowania dla żywego znieczulonego zwierzęcia i zaleca protokół akwizycji DWI w celu uzyskania wysokiej jakości obrazowania, który obejmuje stabilizację pępowiny i kontrolę ruchu oddechowego. Stosuje się pomiary z ważeniem dyfuzji w różnych kierunkach i wielkościach (wartości b). Wreszcie, kilka modeli matematycznych wynikowego sygnału wykorzystuje się do uzyskania map procesów dyfuzji w tkance rdzenia kręgowego, które zapewniają wgląd w normalny rdzeń kręgowy i mogą być wykorzystywane do nieinwazyjnego monitorowania urazów lub procesów chorobowych.

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny (MRI) to nieinwazyjne narzędzie, które daje wgląd w mózg i rdzeń kręgowy zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Rezonans magnetyczny zrewolucjonizował diagnostykę kliniczną, ale jest również cennym narzędziem do badań laboratoryjnych. Zwierzęce modele urazów lub chorób neurologicznych stanowią platformę do zrozumienia patofizjologii i przyspieszenia odkrywania terapii. W tym raporcie demonstrujemy zastosowanie MRI do szczurzego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w celu zbadania potencjalnych biomarkerów uszkodzenia mikrostrukturalnego¹ za pomocą obrazowania tensora dyfuzji (DTI). Potencjalne odkrycie biomarkerów obrazowych pomoże w diagnozowaniu i leczeniu pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Markery te mogą odegrać rolę w odkrywaniu terapii w modelach przedklinicznych i umożliwić obserwację lub prognozowanie w ich przełożeniu na warunki kliniczne.

DTI to wyspecjalizowana forma rezonansu magnetycznego, która mierzy mikroskopijny ruch cząsteczek wody (tj. dyfuzję). DTI jest szczególnie korzystne w układzie nerwowym ze względu na obecność aksonów, w których dyfuzja jest nieproporcjonalnie szybsza wzdłuż aksonów niż prostopadła do nich, co dostarcza informacji na temat ich orientacji i składu mikrostrukturalnego. Wskaźniki skalarne wyprowadzone z DTI, w tym miara całkowitej dyfuzji w tkance, średnia dyfuzyjność (MD) oraz miara zależności dyfuzji od orientacji, anizotropia frakcyjna (FA)^2,3, znalazły szerokie zastosowanie w charakteryzowaniu mikrostruktury układu nerwowego zarówno w zdrowiu, jak i chorobie⁴. Wskaźniki te ujawniły mikroskopijne cechy tkanki, które są niewidoczne dla większości innych metod MRI. Wcześniejsze badania wykazały, że DTI wykrywa odległe zmiany mikrostrukturalne w obrębie rdzenia szyjnego po SCI klatki piersiowej u szczurów¹. Zmiany DTI oddalone od zmiany prawdopodobnie odzwierciedlają sposób, w jaki cały rdzeń kręgowy reaguje na uraz i są potencjalnie markerem wtórnego urazu.

Obrazowanie rdzenia kręgowego szczura in vivo stanowi kilka wyjątkowych wyzwań. Przede wszystkim rdzeń kręgowy jest dotknięty ruchem oddechowym i wymaga szczególnej uwagi, aby zminimalizować ruch przy użyciu kilku metod. W poprzednich badaniach urządzenia unieruchamiające usuwały ruch kręgosłupa podczas skanowania⁵. Do obrazowania rdzenia szyjnego stosujemy fizyczne ograniczenie w postaci uchwytu na głowę i nauszników, które tłumią, ale nie eliminują ruchu spowodowanego oddychaniem. Ponadto wykorzystujemy niestandardowy schemat bramkowania oddechowego, aby skutecznie synchronizować pozyskiwanie obrazu z cyklem oddechowym. Modyfikacje te umożliwiają usunięcie artefaktów, które w przeciwnym razie byłyby spowodowane ruchem masowym na dużą skalę spowodowanym oddychaniem⁶. DWI jest bardzo wrażliwy na mikroskopijne ruchy, w tym przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego i pulsację krwi, a te mniejsze źródła zanieczyszczenia ruchem są również łagodzone przez schemat bramkowania oddechowego. Dodatkowo rdzeń kręgowy ma małe pole przekroju poprzecznego i stanowi tylko ułamek pola widzenia. Do obrazowania odcinka szyjnego kręgosłupa, w którym rdzeń kręgowy znajduje się głęboko w ciele zwierzęcia, potrzebna jest cylindryczna cewka o częstotliwości radiowej o odpowiedniej penetracji sygnału, aby zobrazować rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym w wysokiej rozdzielczości. Zmniejszenie pola widzenia osiąga się poprzez tłumienie objętości zewnętrznej (OVS), które służy również do anulowania lub zepsucia sygnału z tkanek poza rdzeniem kręgowym. Ta metoda, zwana gradientami spojlera lub tłumieniem objętości zewnętrznej, służy również do zmniejszenia zanieczyszczenia szczątkowym ruchem zwierzęcia, przepływem płynu mózgowo-rdzeniowego lub pulsacją krwi w tych tkankach.

Układ rdzenia kręgowego może być również wykorzystany do uproszczenia protokołu obrazowania. Aksony rdzenia kręgowego w istocie białej (WM) są prawie wszystkie zorientowane równolegle do głównej osi rdzenia kręgowego. Tak więc, podczas gdy DWI mózgu wymaga pomiarów wzdłuż co najmniej 6 kierunków, aby zapewnić, że wyniki nie zależą od położenia w magnesie (proces zwany obrazowaniem tensora dyfuzji), pomiary w rdzeniu kręgowym można uzyskać tylko w 2 kierunkach równoległych i prostopadłych do rdzenia^7,8, zwanych dalej podłużnymi i poprzecznymi, odpowiednio. W ten sposób dyfuzyjność i inne parametry są mierzone oddzielnie w 2 kierunkach i pozwalają na wnioskowanie o mikrostrukturze tkanki zarówno w zdrowiu, jak i chorobie lub urazie.

Protokół

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Komitety ds. Opieki Instytucjonalnej i Użytkowania (IACUC) Medical College of Wisconsin oraz Centrum Medycznego Clement J. Zablocki VA zatwierdziły wszystkie procedury.

1. Przygotowanie i monitorowanie zwierząt

1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej, używając 5% izofluranu w powietrzu medycznym. Gdy odruch prostowania jest nieobecny, a ściskanie tylnej łapy nie powoduje odruchu wycofania, zmniejsz znieczulenie do 2% i przenieś zwierzę na łóżko skanera w pozycji leżącej głową do przodu. Utrzymuj 2% izofluranu przez stożek nosowy przez cały zabieg i utrzymuj przepływ powietrza medycznego na poziomie około 1 l/min. Nałóż niewielką ilość maści nawilżającej na oczy szczura, aby uniknąć uszkodzenia rogówki podczas znieczulenia.
2. Umieść pas do monitorowania oddychania wokół tułowia szczura. Podłącz pasek do układu bramkowania oddechowego. Przed wsunięciem szczura do otworu skanera sprawdź komputer monitorujący oddech, aby upewnić się, że cykl oddechowy jest czysty i spójny. W razie potrzeby wyreguluj pasek, ponieważ ten krok jest niezbędny dla jakości obrazu.
3. Monitorować i utrzymywać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C za pomocą sondy doodbytniczej i systemu ogrzewania ciepłym powietrzem. Utrzymuj częstość oddechów w zakresie 30-45 oddechów na minutę, dostosowując poziom znieczulenia w zakresie od 1,2 do 2%.
4. Umieść szczura w uchwycie głowy z prętem do gryzienia i wkręcanymi nausznikami (Rysunek 1) i wsuń głowę do kwadraturowej cewki objętościowej, aż kręgosłup szyjny znajdzie się w środku cewki.
   UWAGA: Łopatki szczura mogą uniemożliwić dalszą progresję do cewki.
5. Wsuń szczura i uchwyty podtrzymujące do otworu skanera. W razie potrzeby dostosuj kondensatory cewki do strojenia i dopasowania do odpowiedniej częstotliwości i impedancji zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę cewki.

2. Parametry skanowania MRI

UWAGA: Opisane tutaj procedury wykorzystywały system 9,4 T z poziomym otworem dla małych zwierząt, ale mają zastosowanie do innych natężeń pola systemów MRI dla małych zwierząt.

1. Korzystaj ze zautomatyzowanych procedur systemu MRI do wykrywania częstotliwości rezonansowej, iteracyjnej poprawy jednorodności pola magnetycznego (podkładki), kalibracji mocy częstotliwości radiowej i regulacji wzmocnienia odbiornika.
2. Korzystając z interfejsu oprogramowania systemu, uzyskaj domyślne skanowanie zwiadowcze w trzech płaszczyznach, aby zapewnić prawidłowe pozycjonowanie.
   1. Kliknij "Nowy skan", wybierz tripilot i kliknij "sygnalizację świetlną", aby uzyskać obrazy.
   2. Upewnij się, że środek kręgosłupa szyjnego jest wyrównany zarówno ze środkiem magnesu, jak i środkiem cewki MRI. Aby wyśrodkować grzbiet w magnesie, popchnij lub pociągnij za kołyskę i ponownie uzyskaj skan zwiadowczy w celu weryfikacji.
   3. Aby wyregulować położenie odcinka szyjnego kręgosłupa względem cewki rezonansu magnetycznego, zdejmij kołyskę z magnesu w celu zmiany położenia. W razie potrzeby powtarzaj ten proces, aż pozycja będzie spójna. Jeśli zwierzę zostanie przestawione, powtórz krok 2.1.
3. Dodanie nowej sekwencji echa spinowego ważonej dyfuzją echo-płaską (DtiEpi) do obecnego protokołu obrazowania.
   1. Konfiguruj i pobieraj obrazy ważone dyfuzją za pomocą sekwencji DWI, korzystając z ustawień domyślnych, z wyjątkiem następujących:
   2. Otwórz interfejs graficzny pozycji plastrów, aby przepisać 12 plastrów o grubości 0,75 mm. Ustaw plastry prostopadle do głównej osi rdzenia szyjnego. Zapewnij spójne ułożenie plastrów między różnymi zwierzętami lub w różnych sesjach obrazowania, wykorzystując podstawę móżdżku jako wewnętrzne odniesienie.
   3. Ustaw pasma nasycenia na "włączone". Umieść 4 pasma nasycenia o grubości 10 mm na zewnątrz rdzenia kręgowego, aby zminimalizować sygnał z tych tkanek i zmniejszyć ich potencjał do wywoływania artefaktów (ryc. 3). Ustaw bramkowanie oddechowe ("moduł spustowy") na "włączone".
      UWAGA: Niestandardowe bramkowanie oddechowe wymaga wiedzy i doświadczenia w programowaniu sekwencji impulsów. Jeśli nie jest to możliwe, obejściem tego problemu jest zmniejszenie liczby plastrów do 3-5, a TR do 1 s, aby upewnić się, że wszystkie plastry są uzyskiwane między oddechami zwierzęcia. Powtórz całą sekwencję z drugim podzbiorem plastrów, aby uzyskać pełne pokrycie rdzenia szyjnego.
   4. Kliknij ikonę przybornika, a następnie kliknij "Edytuj metodę". Ustaw liczbę segmentów EPI na 4. Zmień kierunek kodowania fazy na lewo-prawo. Inne ustawienia domyślne to: odstęp między echami = 0,3234 ms, całkowita długość ciągu echa na segment EPI = 32,
      UWAGA: Kodowanie fazy ustawione w kierunku lewo-prawo, a nie przód-tył, zmniejszy zanieczyszczenie ruchu przez inne struktury.
   5. Użyj następujących ustawień geometrycznych. Rozmiar matrycy = 128 x 128, a pole widzenia w płaszczyźnie = 25,6 x 25,6 mm, co daje rozdzielczość przestrzenną w płaszczyźnie = 0,200 x 0,200 mm. Upewnij się, że grubość plastra = 0,75 mm. Kolejność plasterków = 'z przeplotem', odstęp między plasterkami = 0 mm.
   6. Użyj następujących ustawień ważenia dyfuzji: tryb pomiaru DW = "kontrast DW", czas trwania gradientu dyfuzji (δ) = 7 ms, separacja gradientu dyfuzji (Δ) = 12 ms, liczba wartości b = 8, pożądane wartości b = 0, 250, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,500, 3,500 mm/s², liczba kierunków dyfuzji = 2, kierunki ważenia dyfuzji = [1 0 0] i [0 0 1] (wykonane tak, aby znajdowały się w płaszczyznach równoległych i prostopadłych do osi rdzenia kręgowego).
      UWAGA: Przy tych ustawieniach osiągnęliśmy wartości b aż 3,500 s/mm². Specyfikacje sprzętowe i inne cechy wydajności systemu mogą ograniczać wartość b, ponieważ czas trwania gradientu dyfuzji (δ) i separacja gradientu dyfuzji (Δ) zależą od wydajności gradientu, które w naszym systemie wynosiły: (maksymalna wytrzymałość gradientu: 440 mT/m, maksymalna szybkość narastania: 3,440 T/m/s). Do pomiarów kurtozy zaleca się 2 wartości b, przy czym wyższa wartość b wynosi co najmniej 2 000 s/mm².
   7. Użyj następujących ustawień czasu. czas echa (TE) = 27 ms (ustawiony na minimum, wprowadzając 0), czas powtórzenia (TR) = 1,800 ms.
4. Zdobądź przygotowaną sekwencję. Przy powyższych parametrach całkowity czas akwizycji wynosi około 25 minut.
5. Podczas wszystkich skanów monitoruj oprogramowanie bramkowania oddechowego i dostosuj okres opóźnienia między "wyzwalaczem" (programowe wykrywanie wydechu) a sygnałem do systemu MRI tak, aby akwizycje następowały tylko w spokojnej (nieruchomej) części cyklu oddechowego (ryc. 2a, stabilna część szarej linii). Opóźnienie wyzwalania w zakresie 100-400 ms jest konieczne w zależności od wzorca oddychania zwierzęcia. Pomoże to zmniejszyć liczbę artefaktów występujących podczas ruchu oddechowego (ryc. 3e).
6. Jeśli to możliwe, powtórz sekwencję z niestandardowymi "odwróconymi blipami" ustawionymi na "włączone", co wymaga dodatkowych 25 minut czasu pobierania.
   UWAGA: Jeśli niestandardowa sekwencja 9 "odwróconego impulsu" (wymagana do korekcji artefaktu podatności podczas kroku 3) jest niedostępna, możliwy jest tylko jeden kierunek kodowania fazy EPI, podczas gdy modyfikacja odwróconej sekwencji impulsów umożliwia wybór kierunku kodowania fazy (od prawej do lewej lub od lewej do prawej).
7. Po zakończeniu obrazowania wyjmij zwierzę z uchwytu i umieść je z powrotem w klatce. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.

3. Przetwarzanie obrazu

1. Eksportuj dane z systemu w formacie DICOM bezpośrednio z systemu (preferowane) lub konwertuj dane do formatu NIFTI za pomocą oprogramowania niestandardowego lub oprogramowania innych firm.
2. Wykonaj korekcję artefaktów podatności.
   1. Wyodrębnij woluminy b=0 z każdego skanowania do jednego pliku, korzystając z narzędzi dostarczonych z FSL lub innymi pakietami oprogramowania MRI. Wymagany jest jeden plik dla każdego kierunku kodowania fazy.
      UWAGA: Na przykład, jeśli każdy skan składa się z 8 skanów o różnych wartościach b z ważeniem dyfuzyjnym w kierunku poprzecznym, a następnie 8 skanów ważenia dyfuzji w kierunku wzdłużnym, plik obrazu zawiera skany b=0 w^{1 i 9 tomie} i może być wyodrębniony i złożony z następującym kodem powłoki:
      fslroi ${up}_dwi_masked.nii.gz temp1 0 1
      fslroi ${up}_dwi_masked.nii.gz temp2 8 1
      fslroi ${down}_dwi_masked.nii.gz temp3 0 1
      fslroi ${down}_dwi_masked.nii.gz temp4 8 1
      fslmerge -t blip_both temp1 temp2 temp3 temp4
      (gdzie w tym przypadku $up i $down są skanami z odpowiednio normalnym i odwróconym kierunkiem kodowania fazy).
   2. Użyj polecenia "topup" w fsl^10,11, aby utworzyć poprawiony plik ze zredukowanymi artefaktami zniekształceń obrazu. Zastosuj tę korekcję do surowych obrazów DWI, które mają być używane do tworzenia map parametrów.
      UWAGA: Instrukcje dotyczące użycia polecenia można znaleźć pod adresem http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide. Przykładowy kod do użycia polecenia w tym przypadku jest następujący:
      topup --imain=blip_both_nlmf_b0images_masked.nii --datain=.. /topup_data.txt --config=./b02b0_ratspine.cnf --out=topup_splines_nlmf --iout=$out --verbose --logout=topuplog.log
      dwiup='ls ${up}*dwi_nlmFilt.nii'
      dwidown='ls ${down}*dwi_nlmFilt.nii'
      applytopup --imain=${dwiup},${dwidown} --datain=.. /topup_data.txt --method=jac --inindex=1,$ind --topup=topup_splines_nlmf --out=DWI_${out} –v
      Skopiuj i edytuj domyślny plik w ${FSLDIR}/etc/flirtsch/b02b0.cnf dla rdzenia kręgowego szczura, zmniejszając każdą z wartości w wierszach --warpres i --fwhm o współczynnik 10.
3. Jeśli obrazy z ważeniem dyfuzyjnym są uzyskiwane wzdłuż co najmniej 6 kierunków nieortogonalnych (przy użyciu schematu DTI w Paravision lub podobnego niestandardowego projektu), użyj pakietów oprogramowania, takich jak fsl's Diffusion Toolbox¹² lub Camino¹³, aby obliczyć standardowe mapy parametrów DTI. Jeśli nie, użyj niestandardowej procedury generowania przydatnych wskaźników, która wykorzystuje ważenie dyfuzji tylko w 2 kierunkach, na przykład, jak wskazano w krokach 3.4 i następnych.
4. Załaduj poprawiony plik DWI wygenerowany przez TOPUP do fslview i wybierz z menu "File -> Create Mask". Użyj narzędzi ołówka, aby narysować obszar zainteresowania w obrębie jednego typu tkanki (na przykład GM, grzbietowy WM lub brzuszno-boczny WM). Zapisz ten plik i powtórz dla innych żądanych ROI, aby użyć ich później.
   UWAGA: Inne procedury segmentacji ROI z rdzenia kręgowego zostały udokumentowane^14,15 i mogą być preferowane dla zaawansowanych użytkowników.
5. Użyj pliku ROI, aby zamaskować plik DWI, a następnie oblicz średni sygnał w ROI dla każdej objętości obrazu za pomocą następującego polecenia:
   fslstats -t DWI_corrected.nii.gz -k GM_mask.nii.gz –M
6. Skopiuj pierwsze 8 wyników do programu do obliczeń numerycznych, takiego jak MATLAB, jako wektor sygnału poprzecznego (na przykład nazwij go sig_T), a drugie 8 wyników jako wektor sygnału podłużnego (sig_L), gdzie 8 to liczba użytych wartości b.
   1. Skopiuj wartości b w programie do obliczeń numerycznych jako wektor 8 wartości b. Wartości b dla kierunku poprzecznego i podłużnego były identyczne. Jeśli to możliwe, efektywną wartość b, a nie nominalną wartość b, należy uzyskać ze skanera, który jest wymieniony w oknie parametrów z kroku 2.3.5 jako "Efektywna wartość B".
   2. Użyj zestawu narzędzi do dopasowywania krzywych programu do obliczeń numerycznych, aby dopasować dane sygnału i wartości b do żądanego modelu, wpisując cftools w wierszu polecenia. Aby to zrobić, kliknij "Dane..." i wybierz wektory sygnału jako dane y, a wartości b jako dane x. Kliknij "Dopasowanie..." i w sekcji "Typ dopasowania" wybierz "Równanie niestandardowe", a następnie kliknij "Nowe" i "Równania ogólne", aby wprowadzić równanie do dopasowania.
7. Aby dopasować do standardowego modelu dyfuzji, wprowadź równanie:
   S0.*exp(-x.*D)" (1)
8. Dopasowanie do modelu, który obejmuje dyfuzję i człon drugiego rzędu (kurtoza; K) Aby zmierzyć odchylenie od dyfuzji Gaussa¹⁶, wprowadź równanie:
   S0.*exp(-x.*D+(1/6).*(x.*D).^2.*K)" (2)
9. Kliknij "OK" i "Zastosuj". Przestrzegać szacowanych wartości dyfuzyjności (D) i kurtozy (K) w oknie wyjściowym. W selektorze "Zbiór danych:" wybierz sig_T (lub sig_L) dane do użycia z równaniem (1) lub (2) i kliknij "Zastosuj".
10. Oblicz wskaźnik anizotropii (AI) za pomocą dyfuzyjności poprzecznej i podłużnej:
    AI=(D_{L-D T})/(D_L+D_T) (3)
    Jest to analogiczne do anizotropii frakcyjnej (FA) obliczanej na podstawie modelu DTI. Wskaźnik anizotropii dla kurtozy można również obliczyć za pomocą kurtozy poprzecznej i podłużnej zamiast dyfuzyjności.
    UWAGA Ta metoda daje wartości parametrów modelu, takich jak K_T, D_T itp. Możliwe jest również użycie operacji wiersza poleceń zestawu narzędzi do dopasowywania krzywych na każdym wokselu w kręgosłupie w celu utworzenia mapy każdego parametru na podstawie modelu. Można zastosować alternatywne metody montażu, które są szczegółowo opisane w innym miejscu. ¹⁷

Wyniki

Właściwe procedury minimalizujące artefakty ruchowe pozwalają na uzyskanie wysokiej jakości obrazów dyfuzyjnych rdzenia kręgowego szczura w odcinku szyjnym. Zastosowanie niestandardowego bramkowania oddechowego (Rysunek 2), nasycenie niepożądanego sygnału z tkanek poza kręgosłupem (Rysunki 3B i C) oraz korekcja zniekształceń podatności pola magnetycznego pozwalają na uzyskanie obrazów dyfuzyjnych, takich jak te przedstawione na Rysunkach 4 i 5. Obrazy wykonane nieprawidłowo lub bez bramkowania będą obarczone artefaktami w formie powidoków (Rysunek 3E), podczas gdy poprawne bramkowanie pozwala na uzyskanie obrazów wolnych od artefaktów.

Wizualna inspekcja obrazów ważonych dyfuzją w obrębie 12 warstw ujawnia cechy rdzenia kręgowego związane z jego mikrostrukturą. W szczególności szybsza dyfuzja w tkance skutkuje większą utratą sygnału na obrazach ważonych dyfuzją, co nasila się przy większym ważeniu dyfuzyjnym (wartość b). Przy ważeniu dyfuzyjnym wykonanym prostopadle do osi rdzenia kręgowego, istota biała wzdłuż obwodu rdzenia wydaje się jasna, ponieważ dyfuzja jest powolna i ograniczona prostopadle do aksonów. W przeciwieństwie do tego, istota szara w centralnym regionie rdzenia wydaje się ciemniejsza, ponieważ składa się z aksonów i ciał komórkowych, które nie są wszystkie wyrównane w jednym kierunku. W porównaniu z tym, ważenie dyfuzyjne w kierunku równoległym skutkuje ciemniejszym wyglądem istoty białej, ponieważ dyfuzja wzdłuż aksonów jest szybka, podczas gdy istota szara jest względnie jaśniejsza. Należy zauważyć, że oddzielne obrazy ważone dyfuzją są przedstawione dla różnych wartości b, ponieważ kierunki równoległy i prostopadły wykazują najlepszy kontrast między istotą białą a szarą przy różnych wartościach b.

Połączenie wszystkich obrazów ważonych dyfuzją przy użyciu formalizmów matematycznych pozwala na przedstawienie map parametrów dyfuzji. Średnie sygnały z białej i szarej istoty naniesiono na wykres w zależności od czynnika ważenia dyfuzji (wartości b) dla kierunków równoległego i prostopadłego. Te dane ilościowe potwierdzają obrazy ważone dyfuzją przedstawione na Rysunku 4. W szczególności biała istota wykazuje silną zależność od kierunku ważenia dyfuzji (podłużnego lub poprzecznego), podczas gdy szara istota jest w mniejszym stopniu zależna od kierunku. Podobnie, dopasowanie sygnału w każdym wokselu za pomocą równania kurtozy dyfuzji pozwala uzyskać ilościowe mapy parametrów dyfuzji (Rysunek 6B), które podkreślają tę samą zależność. Biała istota charakteryzuje się wysokim stopniem anizotropii zarówno w pomiarach dyfuzji (AID), jak i kurtozy (AIK). Zatem dyfuzja poprzeczna i kurtoza ujawniają podstawową mikrostrukturę rdzenia kręgowego znaną z badań histologicznych. Parametry dyfuzji te, pozyskane u żywych, ale znieczulonych zwierząt, odzwierciedlają mikroskopowe właściwości tkanki, takie jak gęstość i średnica aksonów. Zmiany w tych pomiarach spowodowane urazami i chorobami będą przydatne do nieinwazyjnej oceny skutków urazu oraz efektów obiecujących terapii. Obrazowanie ważone dyfuzją szyjnego rdzenia kręgowego szczura może zatem stać się narzędziem w badaniach przedklinicznych nad urazami i chorobami rdzenia kręgowego.

Rysunek 1: Konstrukcja cewki i uchwytu do MRI szyjnego odcinka rdzenia kręgowego. Do obrazowania szyjnego odcinka kręgosłupa z wysoką czułością i jednorodnością wykorzystano specjalistyczną kwadraturową cewkę objętościową (Doty Scientific Inc). Środki znieczulające i powietrze medyczne są dostarczane przez wskazane porty gazowe do stożka nosowego, który jest wygodnie dopasowany do nosa szczura. Wydychany i nadmiarowy gaz jest odprowadzany linią wydechową pod lekką próżnią. Głowa szczura jest stabilizowana za pomocą listwy do zgryzania umieszczonej wokół siekaczy oraz wsporników usznych delikatnie wprowadzonych do kanału słuchowego. Pozostałe komponenty monitorowania fizjologicznego, w tym monitor oddechowy i sonda temperatury, nie zostały przedstawione.

Rycina 2: Schemat bramkowania oddechowego. Schematycznie przedstawiono typowy przebieg oddechowy (szary) oraz sygnał wyzwalający (czerwony) z jednostki bramkowania (A). W typowej implementacji bramkowania (B), pojedynczy sygnał wyzwalający służy do pozyskania wszystkich warstw (linie pionowe; tutaj pokazano 12) w odstępach czasu równomiernie rozłożonych w obrębie czasu repetycji (TR). Jeśli TR przekracza typowy okres oddechu, kilka warstw może zostać pozyskanych podczas jednego oddechu, co czyni je podatnymi na artefakty ruchowe (kolor czerwony). W zmodyfikowanym schemacie (C), podzbiór warstw jest pozyskiwany szybko po sygnale wyzwalającym (tutaj pokazano 6), po czym następuje opóźnienie, a pozostałe warstwy są pozyskiwane po kolejnym sygnale wyzwalającym. Dzięki reorganizacji opóźnień w obrębie sekwencji, TR w obu schematach pozostaje identyczny.

Rycina 3: Pozycjonowanie warstw MRI, pasma nasycenia i kontrola ruchu. Na obrazie zwiadowczym (A) rozmieszczono dwanaście warstw osiowych, przy czym najbardziej przednią warstwę ustawiono w stałej odległości od przecięcia pnia mózgu i móżdżku. Dodano pasma nasycenia (B), aby wyeliminować niepożądany sygnał poza obszarem zainteresowania. Obraz bez ważenia dyfuzyjnego (C) oraz obraz z ważeniem dyfuzyjnym (D) uzyskany przy zastosowaniu niestandardowego schematu bramkowania wyraźnie pokazują anatomię rdzenia i są wolne od artefaktów. W przypadku nieoptymalnego schematu bramkowania lub nieprawidłowego bramkowania oddechowego, obrazy ważone dyfuzyjnie wykazują artefakty (E) w postaci utraty sygnału w obrębie rdzenia lub wielu „duchów” poza rdzeniem, co zniekształci późniejszą analizę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy ważone dyfuzją. Dzięki optymalizacjom opisanym w tekście uzyskano wysokiej jakości obrazy ważone dyfuzją z zastosowaniem ważenia dyfuzyjnego w kierunku poprzecznym (A) oraz podłużnym (B) względem głównej osi rdzenia kręgowego. Dla każdego kierunku przedstawiono różne wartości b, które w celach ilustracyjnych zapewniają najlepszy kontrast między istotą białą a szarą. Dla każdego kierunku lub wartości b wszystkie 12 przekrojów pozyskano w czasie około 90 sec. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Proces korekcji odwróconego kodowania fazowego. Lewa kolumna przedstawia pojedynczy przekrój obrazowany za pomocą sekwencji DWI zgodnie z opisem w niniejszym protokole (obraz „blip up”). Środkowa kolumna przedstawia sekwencję nabytą po raz drugi z włączoną opcją „reverse blips”. Zauważ, że cechy, które wydają się rozciągnięte na pierwszym obrazie, w środkowej kolumnie wydają się skompresowane. Prawa kolumna przedstawia obrazy ważone dyfuzyjnie skorygowane za pomocą TOPUP. Górny rząd to obraz nieważony dyfuzyjnie, środkowy rząd to przykład z ważeniem dyfuzyjnym zastosowanym w kierunku poprzecznym, a dolny rząd to przykład z ważeniem dyfuzyjnym zastosowanym w kierunku podłużnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Obliczone mapy dyfuzyjności i kurtozy. Znormalizowany sygnał (intensywność obrazu) przedstawiono (A) jako funkcję ważenia dyfuzyjnego (wartość b) dla poprzecznego (T) i podłużnego (L) kierunku kodowania dyfuzyjnego. Wysokiej jakości mapy (B) dyfuzyjności (D), kurtozy (K) i anizotropii (AI) obliczone z sygnału w każdym wokselu ujawniają unikalne cechy tkanki rdzenia kręgowego. W szczególności widoczna jest wyraźna różnica w parametrach między istocią białą a szarą, a także różnice regionalne w obszarach istoci białej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawione tutaj techniki mogą dostarczyć wysokiej jakości obrazy rdzenia kręgowego szczura in vivo, zależne od dyfuzji. Jakość obrazu zależy od wielu czynników, ale rdzeń kręgowy ma kilka unikalnych problemów, które są ważne.

Ruch jest poważnym problemem, który, jeśli nie zostanie skorygowany, spowoduje, że obrazy staną się bezużyteczne. W związku z tym wymaga starannego monitorowania podczas sesji rezonansu magnetycznego. Jeśli podczas początkowego skanowania zostaną zaobserwowane artefakty obrazu, które są zgodne z ruchem, przerwij akwizycję i podejmij kroki w celu wyeliminowania artefaktów, ponieważ są one trudne do usunięcia w procesie przetwarzania końcowego. Upewnij się, że komputer oddechowy odbiera silny, regularny sygnał z urządzenia do monitorowania oddechu. Może być konieczne wyregulowanie pasa oddechowego w celu uzyskania prawidłowego napięcia, które zapewnia stały sygnał, ale nie ogranicza oddychania zwierzęcia. Utrzymuj odpowiedni poziom znieczulenia przez cały czas; Z naszego doświadczenia wynika, że stosuje się 1,5–2,0% izofluoranu. Podobnie, zmniejszenie ogólnego ruchu zwierzęcia i kręgosłupa jest kolejnym ważnym aspektem zapewniającym obrazy wolne od artefaktów. W przeciwieństwie do ludzkiego rdzenia kręgowego, który doświadcza znacznego ruchu spowodowanego pulsacją płynu mózgowo-rdzeniowego związaną z cyklem serca, pulsacja płynu mózgowo-rdzeniowego u gryzoni jest głównie związana z cyklem oddechowym¹⁸. Chociaż trudno jest całkowicie wyeliminować cały ruch w sznurku, szczególnie ważne jest, aby w miarę możliwości zmniejszyć ruch, co często osiąga się metodą prób i błędów. Ponadto szczury z różnymi urazami lub zaburzeniami neurologicznymi mogą mieć nieprawidłową częstość oddechów lub inne powikłania fizjologiczne, które mogą wymagać dostosowania procedur opisanych w niniejszym dokumencie.

Modyfikacje sekwencji impulsów dla bramkowania oddechowego, wraz z dostosowanymi do tego celu procedurami rekonstrukcji obrazu, minimalizują skutki zniekształceń spowodowanych niejednorodnymi polami magnetycznymi, których nie można usunąć za pomocą regulacji wykonanych w systemie MRI.

Podobnie jakość obrazu zależy od czasu trwania obrazowania. W naszym przykładzie ograniczenie liczby ważeń dyfuzyjnych tylko w dwóch kierunkach umożliwiło skrócenie całkowitego czasu obrazowania. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie jest ono już kompatybilne z pełną analizą tensorową (DTI), co jest normą dla wielu innych badań. Alternatywnie, użycie mniejszej liczby średnich i większej liczby kierunków dyfuzji lub wartości b może pozwolić na lepszą charakterystykę przy zachowaniu tego samego czasu akwizycji. Wcześniejsze badania wykazały, że podejście dwukierunkowe dostarcza informacji zgodnych z podejściem 6-kierunkowym (DTI)¹⁹, ale należy zadbać o to, aby warstwy (i kierunki dyfuzji) były zorientowane dokładnie wzdłuż i prostopadle do sznura. Jednak uzyskanie wielu wartości b pozwala na lepszą charakterystykę i matematyczne dopasowanie kurtozy i jest zalecane zamiast stosowania pojedynczej wartości b. Co więcej, cała sekwencja została powtórzona z odwróconym kierunkiem kodowania fazy, co zmniejsza wpływ artefaktów podatności pola magnetycznego i poprawia ogólną jakość obrazu poprzez uśrednianie. Wreszcie, rozdzielczość obrazu zastosowana w naszym protokole zapewnia wyraźną separację istoty białej i szarej. Możliwe są obrazy o wyższej rozdzielczości, chociaż często odbywa się to kosztem dłuższego czasu skanowania lub potencjalnej liczby artefaktów.

Ulepszenia w cewkach o częstotliwości radiowej, sekwencjach impulsów i metodach przetwarzania końcowego będą miały wpływ na poprawę obrazowania rdzenia kręgowego w przyszłych adaptacjach tej metody. Na przykład cewki powierzchniowe mogą być korzystne dla poprawy jakości obrazu, podobnej do obserwowanej u myszy. ²⁰ Istnieje duże prawdopodobieństwo, że środki te okażą się użyteczne jako biomarkery w diagnostyce klinicznej i leczeniu urazów rdzenia kręgowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cewka RF do obrazowania małych zwierząt	Doty	SAIP400-H-38-S
System bramkowania oddechowego	SA Instruments	1030
Skaner MR	Bruker	Biospec 94/30 USR