Method Article

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA służy do regulacji ekspresji genów poprzez kowalencyjne przyłączanie grupy metylowej do pozycji C5 cytozyny w dinukleotydzie cytozynowo-guaninowym cytozyny. Podczas gdy metylacja DNA zapewnia długotrwałe i stabilne zmiany w ekspresji genów, wzorce i poziomy metylacji DNA również podlegają zmianom w zależności od różnych sygnałów i bodźców. W związku z tym metylacja DNA działa jako potężny i dynamiczny regulator ekspresji genów. Badania neuroepigenetyki ujawniły różnorodność stanów fizjologicznych i patologicznych, które są związane zarówno z globalnymi, jak i specyficznymi dla genów zmianami w metylacji DNA. W szczególności uderzające korelacje między zmianami w ekspresji genów a metylacją DNA istnieją w zaburzeniach neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych, podczas plastyczności synaps i po uszkodzeniu OUN. Jednak w miarę jak dziedzina neuroepigenetyki nadal poszerza swoją wiedzę na temat roli metylacji DNA w fizjologii OUN, niezbędne jest określenie związków przyczynowych w odniesieniu do zmian w ekspresji genów i metylacji DNA. Co więcej, w odniesieniu do szerszej dziedziny neurobiologii, obecność ogromnych różnic specyficznych dla regionów i komórek wymaga technik, które rozwiązują te różnice podczas badania transkryptomu, proteomu i epigenomu. Tutaj opisujemy sortowanie astrocytów korowych metodą FACS, które pozwala na późniejsze badanie zarówno transkrypcji RNA, jak i metylacji DNA. Ponadto szczegółowo opisujemy technikę badania metylacji DNA, czułą na metylację analizę stopienia w wysokiej rozdzielczości (MS-HRMA), a także test promotora lucyferazy. Dzięki zastosowaniu tych połączonych technik można nie tylko zbadać zmiany korelacyjne między metylacją DNA a ekspresją genów, ale także bezpośrednio ocenić, czy zmiany w statusie metylacji DNA w danym regionie genu są wystarczające, aby wpłynąć na aktywność transkrypcyjną.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetyka to nauka o modyfikacjach chemicznych, które mogą wpływać na aktywność transkrypcyjną genomu. Zasadniczo, bez zmiany sekwencji DNA, modyfikacje epigenetyczne, takie jak metylacja DNA, acetylacja histonów i metylacja histonów, są wystarczające do odwracalnej zmiany wzorców ekspresji genów 1. Metylacja DNA, silny regulator ekspresji genów, jest najlepiej scharakteryzowaną modyfikacją epigenetyczną. Metylacja DNA to kowalencyjne przyłączenie grup metylowych do pozycji C5 cytozyny, zwykle cytozyny dinukleotydu cytozynowo-guaninowego, znanego również jako miejsce CpG. Obszary, które zawierają duże zagęszczenie miejsc CpG, są znane jako wyspy CpG (CGI). CGI są często związane z transkrypcyjnymi miejscami startowymi (TSS) i promotorami genów 1-3. Tak więc, podczas gdy zmiany metylacji DNA w CGI nie zawsze towarzyszą zmianom w ekspresji lub funkcji komórki, zmiany w metylacji DNA w CGI mogą wywierać silną regulację aktywności transkrypcyjnej 2.

Historycznie rzecz biorąc, zaobserwowano, że metylacja DNA jest niezbędna w embriogenezie, imprintingu i rozwoju, z niewielkimi zmianami w poziomach metylacji DNA występującymi w komórkach postmitotycznych (z wyjątkiem zmian w genach związanych z rakiem) 4,5. Jednak dziedzina neuroepigenetyki podkreśliła ważną, nierozwojową rolę metylacji DNA. W szczególności epigenetyka kognitywna na nowo zdefiniowała metylację DNA jako wysoce plastyczny mechanizm integralnie pośredniczący zarówno w aktywacji transkrypcji, jak i represji genów niezbędnych w procesie uczenia się i zapamiętywania6. Oprócz epigenetyki poznawczej, badania modelujące uraz niedokrwienny i ból neuropatyczny charakteryzują metylację DNA jako labilny mechanizm, który szybko reaguje na różne uszkodzenia OUN 7-9. Jeśli chodzi o astrocyty, kilka linii dowodów sugeruje, że metylacja DNA odgrywa ważną rolę w astroglejogenezie. Fan i wsp. odkryli, że warunkowe KO DNMT1 w nerwowych komórkach progenitorowych (NPC) spowodowało przedwczesny rozwój astrocytów zgodnych z globalnym stanem hipometylacji 10. Dodatkowo, Perisic i wsp., stwierdzili, że zróżnicowane poziomy metylacji DNA promotora GLT-1 pośredniczyły w zróżnicowanych poziomach ekspresji transportera glutaminianu w korze i móżdżku, podkreślając rolę metylacji DNA w ustalaniu specyficznych dla regionu mózgu wzorców ekspresji genów astrocytarnych 11. Ogólnie rzecz biorąc, liczne badania podkreślają dynamiczną i labilną naturę metylacji DNA w OUN, ponieważ wykazano, że środowisko, leki i urazy zmieniają metylację DNA, a często także ekspresję genów 4,9. Podsumowując, te badania neuroepigenetyczne wskazują na metylację DNA jako wykonalny cel terapeutyczny, który może złagodzić różne patologie OUN.

W miarę jak dziedzina epigenetyki poszerza swoje zrozumienie roli metylacji DNA w rozwoju neurologicznym i chorobach, wyzwaniem związanym z przeniesieniem metylacji DNA w kierunku celu terapeutycznego jest przeprowadzenie nie tylko badań korelacyjnych, ale i przyczynowych, które definiują konkretne cele i miejsca genów. Ponadto badanie zmian w metylacji DNA specyficznych dla regionu mózgu i typu komórki pozostaje ciągłym i wartym uwagi czasem wyzwaniem, unikalnym w dziedzinie neuroepigenetyki. Protokół ten wykorzystuje różne techniki, w tym sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) astrocytów, wrażliwą na metylację analizę stopu w wysokiej rozdzielczości (MS-HRM) oraz test lucyferazy metylacji w celu zbadania stanu metylacji DNA KCNJ10, genu kodującego Kir4.1. Kir4.1 to specyficzny dla gleju kanał potasowy, który wykazuje zarówno specyficzne dla regionu mózgu, jak i komórki, wzorce ekspresji w OUN 12-16. Ekspresja Kir4.1 wzrasta przechodząc z regionów OUN rostralnych do ogonowych, przy czym najwyższa ekspresja występuje w rdzeniu kręgowym 15. Chociaż kanał ulega ekspresji w komórkach wyściółki, oligodendrocytach i ich komórkach prekursorowych, Kir4.1 ulega ekspresji głównie w astrocytach i uważa się, że jest niezbędny do utrzymania homeostatycznego poziomu potasu, a także wspierania wychwytu glutaminianu poprzez ustawienie astrocytarnego potencjału błony spoczynkowej na hiperspolaryzowany -80mV 12,16-19. Co ważne, ekspresja Kir4.1 jest niestatyczna zarówno podczas rozwoju, jak i po wielu formach uszkodzenia OUN 20-25. Chcieliśmy zbadać epigenetyczną regulację tego kanału, szczególnie w astrocytach podczas rozwoju. Zastosowane techniki oferują specyficzne dla genu i ukierunkowane analizy miejsc CpG, które dostarczają dowodów przyczynowych na rolę metylacji DNA w regulacji ekspresji genu KCNJ10. Techniki te można zastosować do innych genów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Uniwersytecie Alabamy w Birmingham zatwierdził wykorzystanie zwierząt.

1. Uzyskiwanie RNA i DNA ze wzbogaconej populacji astrocytarnej za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) astrocytów z całej tkanki mózgowej

  1. Uspokoić zwierzę CO2 przez 1 minutę, a następnie szybko odciąć głowę. Wypreparuj korę zgodnie z opisem w Albuquerque i wsp., 26; Nie ma potrzeby usuwania opon mózgowych.
    Uwaga: Transgeniczne szczury wykazujące ekspresję eGFP pod promotorem S100β (marker astrocytów) zostały wygenerowane przez Itakurę i wsp.27 i wykorzystywane do sortowania astrocytów metodą FACS.
  2. Przygotuj homogenat całego mózgu za pomocą zestawu do dysocjacji papainy w warunkach niesterylnych zgodnie z protokołem producenta. Aktywuj papainę termicznie w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut. Uwaga: Roztwór papainy jest dostarczany przez producenta i zawiera L-cysteinę i EDTA (patrz tabela materiałów).
    1. Wytnij lub przetnij otwór w górnej części stożkowej rurki o pojemności 50 ml, aby umożliwić wprowadzenie rurki przenoszącej 95% O2:5% CO2 do zamkniętej stożkowej rurki (Rysunek 1A). Umieść wypreparowaną korę w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 mm zawierającym pożywkę dysocjacyjną (MEM uzupełnioną 20 mM glukozą i penicyliną/streptomycyną (500 U/ml) i zrównoważoną do 95% O2:5% CO2) i użyj czystej żyletki, aby zmielić tkankę na 1 x 1 mm2 kawałki.
  3. Przenieść tkankę za pomocą 10 ml pipetmana ręcznego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej roztwór papainy. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie pipety transferowej przed rozładowaniem, aby zminimalizować ilość przenoszonych mediów dysocjacyjnych. Utrzymuj roztwór papainy w równowadze do 95% O2:5% CO2 poprzez powierzchniową wymianę gazową przez czas inkubacji. Nie bulgoczący roztwór papainy. Inkubować tkankę przez 20 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Po inkubacji w roztworze papainy należy rozcierać tkankę 10 razy za pomocą pipety do przenoszenia o pojemności 10 ml z małą prędkością. Odwirować mętną zawiesinę komórkową o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Zrównoważyć roztwór inhibitora DNazy/albuminy (dostarczony przez producenta) poprzez powierzchniową wymianę gazową i ponownie zawiesić granulowane komórki w 3 ml roztworu inhibitora DNazy/albuminy. Przygotuj komercyjny nieciągły gradient gęstości zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Wirować nieciągły gradient gęstości przy 1 000 x g przez 6 minut. Wyizolować zdysocjowane komórki z dna probówki, odsysając dolną osadkę za pomocą pipety.
  6. Ponownie zawiesić zdysocjowane komórki w 2-3 ml DPBS z 0,02% albuminą surowicy bydlęcej i 1 mg/ml DNazy lub preferowaną buforowaną pożywką hodowlaną HEPES. Przepuść przez filtr 40 μm przed FACS (rysunek 2A). Trzymaj komórki na lodzie do czasu sortowania.
    1. Wykonaj FACS28.
    2. Granulki w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Granulowane astrocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.
  7. Ekstrakcja RNA i DNA przy użyciu preferowanej metody izolacji 2930. Ocena stężenia i jakości RNA i DNA za pomocą spektrofotometru i bioanalizatora 31.
    Uwaga: W kolejnych krokach wykorzystuj tylko wysokiej jakości RNA i DNA, odpowiednio 260/280 = 2,0-2,2 i 1,8-1,9. Analiza bioanalizatora jest niezbędna do oceny degradacji RNA lub fragmentacji DNA. RNA lub DNA mogą być wykorzystane natychmiast lub przechowywane odpowiednio w temperaturze -80 °C lub -20 °C do kolejnych badań.

2. Ocena statusu metylacji DNA genu za pomocą wrażliwej na metylację analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości (MS-HRMA)

  1. Wprowadź sekwencję genów będących przedmiotem zainteresowania do preferowanego oprogramowania do mapowania metylacji online, aby zidentyfikować dowolne wyspy CpG w genie będącym przedmiotem zainteresowania 32.
    1. Zaprojektuj startery przeciwko sekwencjiDNA 33 przekształconej w wodorosiarczyn i amplifikuj przy użyciu preferowanej polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta. Sprawdź amplifikowany rozmiar produktu, uruchamiając 1% żel DNA z agarozy pod napięciem 100 V przez 45 minut. Podkłady należy przechowywać w stężeniu podstawowym 20 μM w temperaturze -20 °C.
  2. Wodorosiarczyn przekształca 500-1,000 ng DNA z każdej próbki i metylowane wzorce DNA w zakresie od 0 do 100% od tego samego gatunku zwierząt 34. Eluować próbki do uzyskania stężenia 20 ng/μl. Sprawdź stężenie DNA przekształconego w wodorosiarczyn za pomocą spektrofotometru 31.
  3. Ustawić 20 μl reakcji do amplifikacji MS-HRM przy użyciu preferowanej polimerazy DNA i starterów przy stężeniu 5 μM zgodnie z tabelami 1 i 2. Uruchom wszystkie próbki, w tym DNA FACS i wzorce metylowe, w trzech egzemplarzach.
  4. W zależności od oprogramowania analitycznego należy ustawić parametry przed i po uruchomieniu i zatrzymaniu wokół przejść krzywej topnienia. Ustaw parametry rozpoczęcia wstępnego topienia i zatrzymania wstępnego topienia tak, aby różnica między nimi wynosiła 0,2 – 0,5 °C. Ustaw podobnie początek po stopieniu i koniec po topieniu. Wyodrębnić dane dotyczące różnicy temperatur szczytowych dla każdej próbki.
  5. Korzystając z procentowych wzorców metylowych (wartość y) i odpowiadających im średnich różnic temperatury szczytowej (wartość x), wygeneruj równanie regresji liniowej (rysunek 3A-B, tabela 3-4). Użyj tego równania regresji liniowej, aby oszacować stan metylacji nieznanych próbek 35.

3. Ocena aktywności hipermetylowanego promotora za pomocą testu lucyferazy

  1. Zidentyfikuj wyspy CpG docelowego genu (Krok 2.1). PCR amplifikuje obszary zainteresowania 36 i klonuje przed genem reporterowym lucyferazy lucyferazy lucyferazy luc2 Firefly w celu wytworzenia plazmidów CpG-island-luc2 37.
  2. Linearyzuj 30 μg plazmidu CpG-island-luc2 poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym 38. Zweryfikuj miejsca pod kątem skrótu ograniczeń i unikaj podwójnych cięć za pomocą preferowanego oprogramowania do cięcia 38. Enzymy inaktywowane termicznie w odpowiedniej temperaturze i czasie po trawieniu zgodnie z protokołem producenta. Minimalna utrata DNA następuje na etapie linearyzacji.
  3. Metylowane plazmidy należy zlinearyzować przy użyciu metylazy CpG (M.Sssl) O/N w temperaturze 30 °C lub pozostawić bez obróbki zgodnie z protokołem producenta, z wyjątkiem następujących regulacji.
  4. Wykonaj 50 μl reakcji.
  5. Użyj 5 jednostek metylazy CpG do metylacji 700 ng zlinearyzowanego plazmidu.
  6. Uruchom reakcje O/N przez 13-19 godzin.
  7. Po reakcji metylazy CpG należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą standardowego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelu krzemionkowego zgodnie z protokołem producenta. Znaczne straty DNA występują w wyniku reakcji metylazy CpG, utrata 30-60%.
  8. Sprawdź metylację plazmidów za pomocą trawienia restrykcyjnego Hpa II.
  9. Pobrać 1 μg metylowanego lub niemetylowanego DNA i poddać trawieniu restrykcyjnemu za pomocą Hpa II przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Użyć 5-10 jednostek Hpa II na każdy μg DNA. Po wytrawieniu Hpa II należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą preferowanego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelem krzemionkowym. Uruchom zarówno metylowane, jak i niemetylowane plazmidy CpG na 1% żelu DNA z agarozy w buforze TAE lub TBE pod napięciem 100 V przez 45 minut w celu wizualizacji (Figura 4B).
  10. Poddaj zarówno metylowane, jak i niemetylowane plazmidy podwójnemu trawieniu z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, aby uwolnić pełnowymiarowe fragmenty luc 2 (wektor) i wyspy CpG (wstaw) 38. Przeprowadzić podwójne trawienie O/N w odpowiedniej temperaturze i inaktywować termicznie enzymy po mineralizacji zgodnie z protokołem producenta. Minimalna utrata stężenia DNA występuje podczas trawienia z podwójnym ograniczeniem.
  11. Uruchom podwójnie strawione plazmidy na 1% żelu agarozowym DNA pod napięciem 100 V przez 1 godzinę, aby umożliwić oddzielenie wektora i insertu (Figura 4C). Ostrożność. Nosząc ochronną osłonę twarzy UV, umieść żel DNA na czarnym świetle stołu, aby uwidocznić opaski. W zależności od rozmiaru, wyciętą metylowaną i niemetylowaną wkładkę oraz niemetylowany wektor za pomocą czystego ostrza chirurgicznego.
  12. Żelowy ekstrakt DNA przy użyciu nasyconego fenolu, pH 6,6. Krótko zważ żel DNA zawierający wektor lub wkładkę. Użyj 100 μl fenolu na 0,1 grama żelu DNA. Homogenizuj żel DNA w fenolu za pomocą homogenizatora szklanego.
  13. Dodać chloroform (używając 1/5 objętości fenolu) i wstrząsać próbkami przez 20 sekund. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty. Wirować przez 15 minut z maksymalną prędkością (16,1 x 1 000 x g) w temperaturze 4 °C.
  14. Usunąć roztwór wodny i dodać 0,1 razy objętość 3 M octanu sodu i 2,5 razy objętość etanolu. Próbki inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C. Po inkubacji usunąć etanol i ponownie zawiesić DNA w 30 μl preferowanego buforu. Znaczna utrata DNA następuje po wyizolowaniu insercji i wektorów, utrata 30-50%.
  15. Religacja metylowanych i niemetylowanych insertów do niemetylowanego wektora przy użyciu ligazy DNA T4 38. Użyj stosunku wektora 1:4 do wstawienia dla reakcji ligacji. Ustaw reakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Do reakcji użyć całkowitej objętości 50 μl i inkubować O/N w temperaturze -20 °C lub na lodzie z pokrywką nad wiadrem na lód.
  16. Po podwiązaniu należy przeprowadzić czyszczenie DNA za pomocą preferowanego, dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia membrany z żelu krzemionkowego. Znaczna utrata DNA następuje po reakcji ligacji, około 30-50% utraty DNA. Sprawdź ponowną ligację, uruchamiając 1% żel DNA z agarozy pod napięciem 100 V przez 45 minut i oceń stężenie ponownie zligowanych plazmidów (ryc. 4D).
  17. Transfekcja metylowanych lub niemetylowanych plazmidów do komórek D54 przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta. Wysiewaj komórki D54 na 12-dołkowej płytce w 0,14 x 106 komórek/dołek.
  18. Po 24 godzinach transfekcja komórek z równymi stężeniami (1) niemetylowanego plazmidu CpG-luc2 + Renilli lub innego wektora lucyferazy kontrolnej lub (2) metylowanego plazmidu CpG-luc2 + Renilli lub innego kontrolnego wektora lucyferazy.
  19. Pozwól komórkom na transfekcję przez 24 godziny przed wykonaniem podwójnego testu lucyferazy. Wykonaj test zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj odczyty za pomocą luminometru. Przeczytaj każdą studzienkę w trzech egzemplarzach.
  20. Obliczać stosunek aktywności lucyferazy świetlika do aktywności lucyferazy Renilla lub innej kontrolnej aktywności lucyferazy. Normalizuj metylowany Firefly: kontroluj aktywność lucyferazy do niemetylowanego Firefly: kontroluj aktywność lucyferazy, dzieląc aktywność metylowanej lucyferazy przez niemetylowaną aktywność lucyferazy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzbogacona populacja astrocytów została pozyskana poprzez sortowanie FACS transgenicznych zwierząt transgenicznych eGFP-S100β 27. Ze względu na pogarszającą się jakość komórek i cząsteczek molekularnych wyizolowanych od zwierząt w wieku powyżej 50 dnia po urodzeniu (p50), zwierzęta w wieku p0-p40 są optymalne do takich eksperymentów. Do tych eksperymentów wykorzystano tkankę korową. Korydy od dwóch do sześciu zwierząt były łączone razem. FACS wykonano w ośrodku UAB Comprehensive Flow Cytometry Core. Sortowanie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje izolację wzbogaconej populacji astrocytów za pomocą FACS, a także różnorodne techniki, które pozwalają zarówno na badania korelacyjne, jak i przyczynowe między metylacją DNA a ekspresją genów. Techniki te, stosowane w izolacji lub w połączeniu, są szczególnie przydatne dla laboratoriów, które pracują z tkankami o wysokiej heterogeniczności komórkowej lub są zainteresowane statusem metylacji DNA określonego genu lub regionu genu w porównaniu z globalnymi zmianami metylacji DNA. Jednym ze stosunkowo wy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez R01NS075062-01A1. Sortowanie FACS wykonywane w zakładzie UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr Scott Philips z UAB Neurobiology Core facility i dr Susan Nozell z UAB CDIB pomagali w technicznych aspektach testu lucyferazy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
System dysocjacji papainyWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerOprogramowanie online Applied Biosystemsdo lokalizacji CpG Islands
EZ DNA Zestaw do metylacji ZymoResearchD5001
Wstępnie zmieszany wzorzec kalibracji szczurówEpiGenDx80-8060R-Premix
Metylaza CpG (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAszybka ekstrakcja żelu QIagen28704Używany do ekstrakcji żelu i oczyszczania DNA
Enzymy restrykcyjneNew England BioLabs
Nóż NEBNew England BioLabsonlineweryfikuj miejsca trawienia ograniczeń
Podwójny system testów reporterowych lucyferazyPromegaE1910
Luc2, wektor renilla pGL4.10PromegaE6651
, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometrTurner Designs
Lipofectamine LTX i Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Fenol, nasycony pH 6,6/6,9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpektroftometrThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
Oprogramowanie High Resolution Melt (HRM) v2.0Life Technologies4397808
Oprogramowanie AB SDS v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Przewodnik wprowadzający Life Technologiesonline
AB 7900HT Szybkietechnologie
Wektor eksploatacji systemu w czasie rzeczywistym

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

Related Articles