Artykuł metodologiczny

Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

DOI:

10.3791/52421

⸱

19 marca 2015

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płodne jaja kurze są powszechnie używane do produkcji dużych ilości ludzkiego wirusa grypy A, ponieważ zapewniają wygodny i opłacalny system do udowodnienia wysokich plonów wirusa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie grypą jest związane z około 36 000 zgonów i ponad 200 000 hospitalizacji rocznie w Stanach Zjednoczonych. Ciągłe pojawianie się nowych szczepów wirusa grypy w wyniku mutacji i reasortacji komplikuje kontrolę wirusa i wymaga ciągłego opracowywania nowych leków i szczepionek. Laboratoryjne badanie grypy wymaga niezawodnej i opłacalnej metody namnażania wirusa. W tym przypadku zapewniony jest kompleksowy protokół namnażania się wirusa grypy A w płodnych jajach kurzych, co konsekwentnie daje wysokie miano wirusa. Krótko mówiąc, jaja kurze zapłodnione surowicą wolną od patogenów (SPF) inkubuje się w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-60% przez 10 – 11 dni. W tym okresie rozwój zarodków można łatwo monitorować za pomocą świecy do jaj. Inokulację wirusa przeprowadza się poprzez wstrzyknięcie zapasu wirusa do jamy omoczniowej za pomocą igły. Po 2 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C jaja są schładzane przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C. Skorupka jaja nad workiem powietrznym i błona kosmówkowo-omoczniowa są następnie ostrożnie otwierane i pobierany jest płyn omoczniowy zawierający wirusa. Płyn jest usuwany z zanieczyszczeń przez odwirowanie, porcjowany i przenoszony do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Duża ilość (5-10 ml płynu zawierającego wirusa na jajo) i wysokie miano wirusa, które zwykle osiąga się za pomocą tego protokołu, sprawiły, że wykorzystanie jaj do przygotowania wirusa stało się naszą korzystną metodą, w szczególności w badaniach in vitro, które wymagają dużych ilości wirusa, w których potrzebne są wysokie dawki tego samego szczepu wirusa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grypa A nadal stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Jest to potencjalnie wyniszczająca choroba układu oddechowego, o dużym globalnym obciążeniu, powodująca do 500 000 zgonów rocznie na całym świecie1. Wirusy grypy należą do rodziny Orthomyxoviridae i przenoszą w swoim genomie 8 jednoniciowych RNA o ujemnym znaczeniu 1,2. Wysoka mutowalność (tj. "dryf" antygenowy) genomu wirusa zapobiega długotrwałej odporności. Ponadto grypa jest coraz bardziej oporna na leki przeciwwirusowe 3.

Pandemia grypy H1N1 w 2009 roku uwypukliła wszystkie trudne problemy związane z chorobą grypową (szczep pandemiczny, oporność przeciwwirusowa, opóźniona produkcja szczepionek). Skład szczepionki jest ustalany corocznie przez Światową Organizację Zdrowia dla najbardziej prawdopodobnych patogennych szczepów grypy (po jednym dla H1N1, H3N2 i grypy B) 4. Ponieważ metoda ta opiera się na przewidywanych szczepach grypy, szczepy chorobotwórcze są czasami nieprawidłowo identyfikowane, a skuteczność szczepionki drastycznie spada. Co więcej, pojawienie się nowych szczepów grypy może obejść te programy zapobiegawcze powodujące chorobę pandemiczną 2.

Stworzenie uniwersalnej szczepionki przeciw grypie było nieuchwytne 5. Dlatego należy kontynuować badania nad zrozumieniem patogenezy uszkodzenia płuc. Aby ułatwić badania laboratoryjne, opracowano kilka metod izolacji i namnażania wirusa 6. Wirusy grypy ludzkiej mogą być amplifikowane w różnych substratach komórkowych ssaków. Jednak wytwarzanie wirusów o wysokim mianie w dużych ilościach najlepiej osiąga się w zarodkach jajowych. Poniższy protokół opisuje technikę rozmnażania i przechowywania wirusa grypy A z istniejących zasobów wirusów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Uwagi ogólne: Wszystkie procedury związane z manipulacją jajkiem należy wykonywać w sterylnych warunkach, a technika sterylna powinna być stosowana odpowiednio. Przed użyciem należy wstępnie oczyścić wszystkie urządzenia 70% etanolem. Ogólnie rzecz biorąc, inokulacja i zbiór wirusa grypy powinny być przeprowadzane w laboratorium BSL-2. Jeśli jednak protokół ten jest stosowany do rozprzestrzeniania znacznie większej liczby patogennych wirusów grypy (np. szczepów pandemicznych i przedpandemicznych, szczepów stanowiących zagrożenie dla drobiu i zwierząt gospodarskich, wysoce zjadliwych szczepów ptasiej grypy, szczepu H1N1 z 1918 r.), wymagane są wyższe poziomy bezpieczeństwa biologicznego, a w niektórych przypadkach wymagane są środki ostrożności i zezwolenia w zakresie bezpieczeństwa biologicznego. Lokalny Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego powinien zatwierdzać wszystkie badania dotyczące wirusa grypy.

1. Przygotowanie jaj do inokulacji

  1. Uzyskać świeżo zapłodnione jaja ptaków wolne od surowicy patogenów (SPF) od odpowiedniego dostawcy. Zazwyczaj używa się jaj kurzych. Jajka należy zużyć natychmiast po przyjeździe.
  2. Po przyjeździe umieść jaja w nawilżonym inkubatorze z automatyczną obracarką do jaj, aby regularnie obracać jaja. Jeśli automatyczna obracarka do jaj nie jest dostępna, ręcznie obracaj jajka co najmniej 2-3 razy dziennie (pamiętaj, aby nosić rękawiczki i utrzymywać wszystko tak sterylne, jak to możliwe).
  3. Wysiadywać jaja w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-60% przez 10-11 dni.

2. Puszkowanie jajek

  1. Użyj świecy do jaj, aby zbadać jajko w jasnym świetle w ciemnym pomieszczeniu, aby sprawdzić jaja pod kątem niepłodności przez świecowanie po około 7 lub 8 dniach inkubacji.
    1. Przetrzyj świecę do jajek 70% etanolem. Często zmieniaj rękawice i dezynfekuj 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia patogenami.
    2. Wyjmij jaja z inkubatora i umieść je w pustych kartonach po jajkach.
    3. Wyłącz światła w pokoju.
    4. Trzymaj duży koniec każdego jajka pojedynczo przy świeczniku.
    5. Obserwuj jajo, aby określić, czy jest płodne, czy bezpłodne.
      UWAGA: Cienkie naczynia krwionośne prowadzące do zarodka w kształcie fasoli powinny być wyraźnie widoczne. Niezapłodnione jaja pojawią się jako mała plamka krwi z widocznym żółtkiem jaja.
  2. Wyrzuć jaja, które nie są zapłodnione, i zwróć żywe jaja do inkubatora. Nie pozostawiaj jaj poza inkubatorem na dłużej niż 30 minut. Jeśli nie można potwierdzić statusu jajka, oznacz je i obserwuj później.

3. Przygotowanie inokulum wirusa

  1. Rozcieńczyć zapas wirusa grypy do około 103 – 104 pfu/ml w sterylnym PBS zawierającym 10 mM HEPES (pH 7,4). Etap krytyczny: Rozcieńczyć zapas wirusa bezpośrednio przed użyciem i cały czas utrzymywać rozcieńczonego wirusa na lodzie.

4. Inokulacja wirusa grypy drogą omocznikową

  1. W dniu inokulacji wirusa (dzień 10 lub 11) ponownie zapal jaja i wyeliminuj wszelkie martwe zarodki. Rozróżniaj żywe zarodki, szukając ruchu wewnątrz komórki jajowej.
  2. Wyjmij trzy jaja z inkubatora i ułóż jaja w osobnym uchwycie workiem powietrznym do góry.
  3. Zaznacz przestrzeń powietrzną jaj trwałym markerem.
  4. Umyj skorupkę jajka nad przestrzenią powietrzną 70% etanolem.
  5. Umieść jaja z przestrzenią powietrzną do góry w kartonie na jajka i do okapu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
  6. Użyj sterylnej igły 18G, aby przebić mały otwór w skorupce nad workiem powietrznym każdego jajka. Należy uważać, aby nie wbić igły zbyt głęboko, aby uniknąć dźgnięcia zarodka lub żółtka.
  7. Pobrać rozcieńczony wirus grypy do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i założyć igłę 22G.
  8. Ostrożnie wsunąć strzykawkę z igłą pod kątem 45° do jamy omoczniowej.
  9. Wstrzyknąć 0,2 ml rozcieńczonego wirusa grypy.
  10. Powtórzyć wstrzyknięcie z pozostałymi dwoma jajami, a następnie wyrzucić strzykawkę i igłę.
  11. Uszczelnij otwór kroplą kleju z pistoletu do klejenia (lub stopionego wosku parafinowego). Uważaj, aby klej nie wyciekł do wnętrza jajka.
  12. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze jaj z przestrzenią powietrzną skierowaną do góry.
  13. Powtarzaj kroki 4.2 – 4.12, aż wszystkie jaja zostaną zaszczepione.

5. Czas inkubacji

  1. Wysiaduj zainfekowane jaja bez obracania w temperaturze 37 °C i wilgotności ~60%.
  2. Wybierz optymalny czas inkubacji w zależności od typu wirusa grypy. Inkubować grypę A przez 48 godzin; inkubować grypę B i C przez 72 godziny.

6. Żniwa wirusa grypy

  1. Po okresie inkubacji schładzać jaja w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny (lub O/N) w celu zabicia zarodka i zwężenia naczyń krwionośnych w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia zakażonego płynu omoczniowego krwią. Zrób to, aby zapobiec wchłanianiu wirusa przez czerwone krwinki, co zmniejsza wydajność. Alternatywnie schładzaj jajka przez 30 minut w temperaturze -20 °C; Zwiększa to jednak ryzyko zanieczyszczenia krwi.
  2. Po wystarczającym schłodzeniu jaj należy przenieść je do okapu bezpieczeństwa biologicznego. Umieść jajko w mocnym uchwycie z workiem powietrznym skierowanym do góry. Oczyść powierzchnię jajka 70% etanolem.
  3. Użyj sterylnych nożyczek, aby otworzyć skorupkę jajka nad workiem powietrznym. Usuń powłokę wokół worka powietrznego, uważając, aby nie zniszczyć błony kosmówkowo-omoczniowej.
  4. Otwórz błonę kosmówkowo-omoczniową sterylnymi kleszczami. Delikatnie odsuń zarodek i woreczek żółtkowy małą szpatułką lub łyżką. Uważaj, aby nie pękło żółtko.
  5. Za pomocą pipety Eppendorf o pojemności 1 ml ostrożnie zebrać płyn omoczniowy. W razie potrzeby przechyl jajko nieco na bok, aby zebrać jak najwięcej płynu.
  6. Połącz płyn omoczniowy ze wszystkich jaj w plastikowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas zbierania wirusa. Z jednego jajka wydostaje się 5 – 10 ml lekko żółtawego płynu.
  7. Obracać płyn omoczniowy zawierający wirusa o sile 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby rozdrobnić resztki. Przenieść klarowny płyn do nowej probówki o pojemności 50 ml trzymanej na lodzie. Wyrzuć jaja do pojemnika na odpady BSL-2.

7. Przechowywanie

  1. Natychmiast podwielokrotnić oczyszczony płyn omoczniowy (np. 50, 100 lub 500 ul aliquots) i zamrozić w ciekłym azocie. Zamrożone zapasy wirusa należy przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano wiele metod określania miana wirusa grypy. Jednym z czynników branych pod uwagę przy wyborze odpowiedniej metody jest to, że niektóre z nich określają całkowite cząstki niezależnie od żywotności (np. test hemaglutyniny), podczas gdy inne opierają się na zakaźności, która oceni żywotne wiriony (np. test płytki nazębnej) 6. W tym przypadku miano wirusa płynu omoczniowego pobranego z jaj kurzych zaszczepionych wirusem grypy przystosowanym do mysi (A/PR/8/34) oznaczono za pomocą testu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grypa powoduje duże globalne obciążenie chorobami, a prace nad zrozumieniem patogenezy uszkodzenia płuc są kontynuowane 7. Aby ułatwić badania nad tą śmiertelną chorobą, opracowano różne metody namnażania wirusa grypy 6. W tym miejscu opisujemy technikę wytwarzania wirusa grypy w jajach kurzych. Zaletą tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna i prowadzi do uzyskania dużych ilości zapasów wirusa grypy o wysokim mianie, co często jest konieczne w badaniach in vitro .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie było wspierane przez granty NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) oraz American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Cellgro 21-040-CV
jaja kurze zapłodnione surowicą wolne od patogenów (SPF) VALO BioMedia
 FARM iNNOVATORSModel 2100
FARM iNNOVATORSModel 3200
świecarka do jajFARM iNNOVATORSModel 3300 
Strzykawka 1 mlBD Bioscience309659
Igła 18GBD Bioscience305196
Igła 20G / 22GBD Bioscience305176 / 305156
HEPESSigma-AldrichH3375
Etanol>99,5%Sigma-Aldrich459844rozcieńczony do 70% za pomocą pistoletu do
klejenia wody "Ad tech Hi Temp Projekt Pro"Technologia reklamowa, Adhesive Technologies, Inc.Model 1105
klej "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.220-34ZIP30
Komórki MDCKATCCCRL-2935
Myte czerwone krwinki z indyka, 10%Laboratoria biologiczne Lampire724908
Nawilżany inkubator jaj Automatyczna obracarka do jaj

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  2. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  3. Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  4. Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
  5. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
  6. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
  7. Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
  8. Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
  9. Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
  10. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inokulacja jaj kurzychiniekcja do jamy alotoidalnejoznaczenie miana wirusametoda testu plackowegotest hemaglutynacjitechnika wiecenia jajjaja wolne od patogen w w surowicypobieranie p ynu alotoidalnegoprzechowywanie w ciek ym azocie

Powiązane artykuły