Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

16.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52424

⸱

8 listopada 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Streszczenie

Inhibitor kalcyneuryny, takrolimus, jest kamieniem węgielnym większości protokołów leczenia immunosupresyjnego po przeszczepie narządów litych w Stanach Zjednoczonych. Takrolimus jest lekiem o wąskim indeksie terapeutycznym i jako taki wymaga monitorowania dawki terapeutycznej i dostosowania dawki w oparciu o minimalne stężenia we krwi pełnej. Aby ułatwić domowe monitorowanie leków terapeutycznych i ich przestrzegania, atrakcyjną koncepcją jest pobieranie wysuszonych plam krwi. Po nakłuciu palca pacjent pobiera kroplę krwi na bibułę filtracyjną w domu. Po wysuszeniu krew jest wysyłana do laboratorium analitycznego, gdzie takrolimus jest oznaczany ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (HPLC-MS/MS) w połączeniu z prostym etapem ręcznego wytrącania białek i ekstrakcją kolumnową w trybie online.

Do analizy takrolimusu, 6-milimetrowy krążek jest wybijany z nasyconego środka plamki krwi. Plamka krwi jest homogenizowana za pomocą mieszalnika kulowego, a następnie białka są wytrącane metanolem/0,2 MZnSO4 zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus. Po wirowaniu i odwirowaniu 100 μl supernatantu wstrzykuje się do kolumny ekstrakcyjnej online i przemywać 5 ml/min 0,1-kwasem mrówkowym/acetonitrylem (7:3, v:v) przez 1 min. Następnie aktywowany jest zawór przełączający, a anality są przepłukiwane wstecznie na kolumnę analityczną (i rozdzielane za pomocą 0,1% gradientu kwasu mrówkowego/acetonitrylu). Takrolimus jest oznaczany ilościowo w dodatnim trybie wielokrotnej reakcji (MRM) przy użyciu tandemowego spektrometru masowego.

Test jest liniowy od 1 do 50 ng/ml. Zmienność między testami (3,6%-6,1%) i dokładność (91,7%-101,6%) oceniane w ciągu 20 dni spełniają kryteria akceptacji. Średni odzysk ekstrakcji wynosi 95,5%. Nie ma istotnych przeniesień, zakłóceń matrycowych i efektów matrycowych. Takrolimus utrzymuje się w suchych plamkach krwi w temperaturze pokojowej i +4 °C przez 1 tydzień. Próbki wyekstrahowane w automatycznym podajniku próbek są stabilne w temperaturze +4 °C przez co najmniej 72 godziny.

Wprowadzenie

Takrolimus jest silnym środkiem immonosupresyjnym1-7, który ma strukturę makrolidową8 (Rysunek 1). Ze względu na izomerię cis-trans wiązań C-N tworzy dwa rotamery w roztworze9, które można rozdzielić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) Takrolimus jest lipofilowy i rozpuszczalny w alkoholach (metanol: 653 g/l, etanol: 355 g/l), chlorowcowanych węglowodorach (chloroform: 573 g/l) i eterze. Jest trudno rozpuszczalny w węglowodorach alifatycznych (heksan: 0,1 g/l i wodzie (pH 3: 0,0047 g/l)9. Cząsteczka nie zawiera chromoforu, a jej maksymalna absorpcja promieniowania UV wynosi 192 nm. Takrolimus działa poprzez hamowanie kalcyneuryny. Jego mechanizm działania został omówiony w piśmiennictwie10,11. Obecnie stosuje się go u ponad 80% pacjentów po przeszczepach narządów litych w Stanach Zjednoczonych12.

Indeks terapeutyczny takrolimusu jest uważany za wąski13. Ponadto korelacja między dawkami takrolimusu a stężeniami we krwi jest słaba, a farmakokinetyka zmienna14,15. Monitorowanie terapeutyczne leków w celu kierowania dawkowaniem takrolimusu u pacjentów po przeszczepieniu jest zatem ogólną praktyką kliniczną16-20. Celem jest utrzymanie stężenia takrolimusu we krwi w ustalonym zakresie terapeutycznym. Stężenia takrolimusu we krwi poniżej zakresu terapeutycznego mogą powodować zwiększoną aktywność przewlekłych lub ostrych reakcji alloimmunologicznych, podczas gdy stężenia powyżej okna terapeutycznego zwiększają ryzyko nadmiernej immunosupresji, raka i toksyczności, takich jak nefrotoksyczność, neurotoksyczność, nadciśnienie tętnicze i cukrzyca. Duża farmakokinetyczną zmienność wewnątrzosobniczą takrolimusu może być szkodliwa zarówno dla przeżycia przeszczepionego narządu, jak i pacjenta21,22. Podczas gdy zmienność międzyosobnicza farmakokinetyki takrolimusu jest spowodowana głównie polimorfizmami CYP3A5, przyczyny zmienności wewnątrzosobniczej obejmują między innymi interakcje lek-lek, choroba-lek i żywność-lek14,15. Również brak przestrzegania schematu leczenia immunosupresyjnego jest czynnikiem przyczyniającym się i główną przyczyną utraty przeszczepu23,24.

Te rozważania sugerują, że częste domowe stosowanie leków terapeutycznych i monitorowanie przestrzegania zaleceń dotyczących stężenia takrolimusu we krwi pełnej może być korzystne dla zapewnienia, że pacjenci mają kontakt z takrolimusem w pożądanym oknie terapeutycznym przez cały czas. Jednak logistyka i koszty częstszego monitorowania leków terapeutycznych, zgodnie z obecną praktyką kliniczną15, są zaporowe. Jednym z powodów jest to, że pacjent musi udać się do flebotomisty w celu pobrania wymaganej próbki krwi żylnej. Zaschnięte plamy krwi pojawiły się ostatnio jako atrakcyjna koncepcja25-28. Po zwykłym opuszkowaniu palca pacjent pobiera kroplę krwi na specjalnej karcie z bibuły filtracyjnej, a po wyschnięciu plamki krwi może ona zostać wysłana do laboratorium centralnego w celu analizy takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych, które pacjent może obecnie przyjmować. Stało się to możliwe dzięki opracowaniu wysoce czułych i specyficznych testów LC-MS/MS do oznaczania ilościowego takrolimusu i innych leków immunosupresyjnych w bardzo małych objętościach krwi, takich jak suche plamki krwi (zwykle 20 μl krwi)25,29-43. Kolejną zaletą jest to, że minimalnie inwazyjne strategie pobierania próbek o małej objętości, takie jak wysuszone plamki krwi, znacznie ułatwiają monitorowanie leków terapeutycznych i badania farmakokinetyczne u małych dzieci28.

Takrolimus jest zwykle mierzony w żylnej krwi pełnejEDTA 15. Powodem jest to, że takrolimus w znacznym stopniu przenika do komórek krwi, a badania kliniczne wykazały lepszą korelację między minimalnymi stężeniami takrolimusu we krwi niż w osoczu ze zdarzeniami klinicznymi15,18. Dla porównania, analiza takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi opiera się na krwi włośniczkowej, która jest zmieszana z matrycą bibuły filtracyjnej. Stwarza to wyzwania w zakresie solubilizacji takrolimusu i potencjalnych zakłóceń w analizie LC-MS/MS. W tym miejscu przedstawiamy uznany i zwalidowany test oparty na homogenizacji wysuszonej plamki krwi za pomocą mieszalnika kulowego w połączeniu z procedurą czyszczenia próbki w trybie online o wysokim przepływie i analizą LC-MS/MS. Na dzień dzisiejszy test ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego oznaczania ponad pięciu tysięcy próbek suszonej kropli krwi takrolimusu w celu monitorowania przestrzegania zaleceń w badaniach klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niezidentyfikowane próbki krwi od zdrowych osób pochodziły ze Szpitala Uniwersytetu Kolorado (Aurora, Kolorado). Wykorzystanie zanonimizowanych próbek z banku krwi do badań walidacyjnych, jak również do przygotowania kalibratorów i próbek kontroli jakości zostało uznane za "wyłączone" przez Wieloinstytucjonalną Komisję Rewizyjną Kolorado (COMIRB, Aurora, Kolorado).

1. Przygotowanie referencji i rozwiązań

  1. Takrolimus i wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus należy zakupić u dostawców wymienionych w wykazie materiałów.
    1. Przygotować roztwory podstawowe w czystym metanolu o stężeniu 1 mg/ml dla takrolimusu i stężeniu 10 μg/ml dla D2,13 C-takrolimusu. Sporządzić roztwory podstawowe materiałów odniesienia w oparciu o trzy niezależne wagi. Podwielokrotne roztwory podstawowe i przechowywać w temperaturze -70 °C lub niższej.
  2. Przygotować roztwór do wytrącania białek i ekstrakcji takrolimusu przy użyciu metanolu / 0,2 MZnSO4 w wodzie (7:3, v:v). Roztwór ten zawiera również wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus o stężeniu 2,5 ng/ml i jest stosowany do ekstrakcji wszystkich próbek, z wyjątkiem ekstrakcji próbek zerowych (patrz ppkt 1.3.3).
    1. Roztwór do wytrącania białek należy przygotowywać świeżo w każdym dniu ekstrakcji i ustawić termin ważności roztworu na 12 godzin.
  3. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej i próbek do kontroli jakości (QC)
    1. Przygotować roztwory podstawowe takrolimusu, przeprowadzając odpowiednie rozcieńczenia roztworu podstawowego przy użyciu czystego metanolu.
    2. W celu przygotowania wzorców i próbek do kontroli jakości, należy dodać 20 μl odpowiednio rozcieńczonego roztworu podstawowego do krwi pełnej EDTA, inkubować w temperaturze 37 °C pod delikatnym wstrząsem w łaźni wodnej, aby umożliwić jednorodne rozprowadzenie takrolimusu w składnikach krwi komórkowej przez 20 minut, a następnie rozdzielić do 1,5 ml probówek polipropylenowych ze stożkowym dnem i zatrzaskowymi pokrywkami. Upewnij się, że względna objętość rozpuszczalnika organicznego nie przekracza 5%.
    3. Za pomocą pipety umieść 50 μl wzbogaconej krwi pełnej w środku każdego okręgu na kartach filtracyjnych.
    4. Suszyć plamy krwi na kartach filtracyjnych w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    5. Przygotować wzorce kalibracyjne takrolimusu w ludzkiej krwi pełnej EDTA przy stężeniach takrolimusu 1, 2,5, 5, 10, 25 i 50 ng/ml. Przygotować ślepą próbkę do ekstrakcji, taką jak wzorce kalibracyjne, z roztworem do wytrącania białek zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus ("próbka zerowa").
    6. Przygotować próbki QC w ludzkiej krwi pełnej EDTA w stężeniach 0, 2, 4, 20, 40 ng/ml. Przygotować próbkę ślepą. W przeciwieństwie do próbek kontroli jakości, które są ekstrahowane z wytrącaniem zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus, tę ślepą próbkę ekstrahować roztworem do wytrącania białek, który nie zawiera wzorca wewnętrznego D2,13 C-takrolimus ("próbka ślepa").
  4. Pobieranie próbek klinicznych
    1. Zebrać wysuszone plamy krwi zgodnie z opisem w43,44.

2. Ekstrakcja próbek suszonej plamki krwi takrolimusu

  1. Sprawdź wzrokowo wysuszoną plamkę krwi, aby upewnić się, że próbka jest akceptowalna i objętość45.
  2. Przebij środek plamki krwi na karcie filtracyjnej za pomocą dziurkacza o średnicy 6 mm.
    Uwaga: Jakość stempli może być monitorowana przez ważenie. Dziurkowana nasycona tarcza filtracyjna waży średnio 5,02 mg ± 0,09 mg (zakres: 4,83-5,14 mg, n=12).
  3. Umieść krążki w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml ze stożkowym dnem i zatrzaskowymi pokrywkami.
  4. Dodaj 20-30 kul do każdej tuby.
  5. Dodać 500 μl roztworu do wytrącania białek (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7:3, v:v z wzorcem wewnętrznym 2,5 ng/ml) do każdej probówki. Do ekstrakcji próbek zerowych należy użyć roztworu do wytrącania białek bez wzorca wewnętrznego.
  6. Homogenizuj krążki w blenderze kulowym przez 1 minutę (maksymalna prędkość, ustawienie "10").
  7. Potrząsaj próbkami w temperaturze pokojowej na wirze wielorurowym (maksymalna prędkość, ustawienie "10") przez 10 minut.
  8. Odwirować próbki przy ciśnieniu 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  9. Przenieść supernatanty do szklanych fiolek HPLC wyposażonych w wkładkę o pojemności 300 μl. Stosować wstępnie nacięte uszczelki teflonowe.
    Uwaga: Wyekstrahowane próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej do czasu analizy LC-MS/MS.

3. Analiza LC-MS/MS

  1. Załadować 100 μl supernatantu z wyekstrahowanej próbki do kolumny ekstrakcyjnej z wkładem C8 i przemywać 0,1% kwasem mrówkowym w stosunku 7:3 w wodzie: acetonitrylu o przepływie 5 ml/min przez 1 min. Połączenia zaworu przełączającego pokazano na rysunku 2, a gradient przebiegający przez pompę wyciągową w tabeli 1.
  2. Następnie należy aktywować zawór przełączający, powodując płukanie wsteczne analitów z kolumny wstępnej na kolumnę analityczną.
  3. Ustaw termostat kolumny na 65 °C.
  4. Eluować anality z kolumny analitycznej, stosując natężenia przepływu i gradient przedstawione w tabeli 1.
  5. Podłączyć kolumnę analityczną do tandemowego spektrometru mas za pośrednictwem źródła jonizacji turbo electrospray. Dostosuj kluczowe parametry spektrometru mas zgodnie z tabelą 2.
  6. Wykrywanie jonów dodatnich ([M+Na]+) w trybie reakcji wielokrotnej (MRM). Do oznaczania ilościowego należy stosować następujące przemiany jonowe: takrolimus: m/z (masa/ładunek) = 826,6 → 616,2 i D 2,13C-takrolimus: m/z = 829,6 → 619,2,
    Uwaga: Całkowity czas pracy wynosi 4,6 min.

4. Kwantyfikacja

  1. Dla każdej serii należy wygenerować krzywą kalibracyjną na podstawie kalibratorów przygotowanych w ppkt 1.3.5 i uwzględnić ją w każdej serii analitycznej.
    1. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, wykreślając stężenia nominalne w funkcji współczynnika odpowiedzi analitu (powierzchnia piku [analit] / powierzchnia piku [wzorzec wewnętrzny]) za pomocą oprogramowania spektrometru mas.
    2. Zamontuj kalibratory za pomocą dopasowania kwadratowego w połączeniu z ważeniem 1/X.
  2. W celu uzyskania odpowiedniej ilości takrolimusu w wysuszonych plamkach krwi należy zintegrować piki takrolimusu i wzorca wewnętrznego w ekstrahowanych chromatogramach MRM. Obliczyć współczynnik odpowiedzi dla takrolimusu (powierzchnia piku [analit] / powierzchnia piku [wzorzec wewnętrzny]) i porównać z krzywą wzorcową przy użyciu oprogramowania do spektrometrii mas.

5. Procedury walidacji

  1. Dolna granica wykrywalności (LLOD) i dolna granica oznaczalności (LLOQ).
    1. Za dolną granicę wykrywalności (LLOD) należy uznać najniższe stężenie takrolimusu o stosunku wartości szczytowej do szumu wynoszącym 4:1. Zdefiniować dolną granicę oznaczalności (LLOQ) jako najniższe stężenie krzywej kalibracyjnej z dokładnością równą lub lepszą niż ± 20 % odchylenia od stężenia nominalnego i precyzją równą lub lepszą niż 20 % (współczynnik wariancji).
  2. Dokładność i precyzja w ciągu dnia i między nimi.
    1. Przetestuj dokładność i precyzję przy czterech poziomach stężeń: 2 ng/ml (QC1), 4 ng/ml (QC2), 20 ng/ml (QC3) i 40 ng/ml (QC4).
    2. Przygotuj próbki kontroli jakości w każdym dniu walidacji w ludzkiej krwi pełnej EDTA, wysusz na kartach filtracyjnych, wyekstrahuj i przeanalizuj zgodnie z powyższym opisem.
    3. Określ dokładność i precyzję w ciągu dnia na podstawie 6 próbek na poziom stężenia QC.
    4. Oceń dokładność i precyzję w ciągu 20 dni. Mierz każdy poziom kontroli jakości za pomocą 4 próbek każdego dnia.
    5. Analizuj dwie krzywe kalibracyjne razem z próbkami kontroli jakości każdego dnia.
    6. Obliczyć dokładność śróddzienną jako % stężenia nominalnego (sześć próbek na poziom stężenia, zob. ppkt 5.2.2). Obliczanie precyzji jako współczynnika wariancji (CV%).
    7. Należy uznać dokładność śróddzienną za dopuszczalną, jeżeli mieści się ona w granicach dopuszczalności od 85% do 115% stężenia nominalnego. Uznaj, że precyzja śróddzienna jest dopuszczalna, jeśli jest równa lub lepsza niż CV (współczynnik wariancji) wynoszący 15%.
    8. Oblicz dokładność i precyzję między dniami jako średnią dla każdego poziomu stężenia QC analizowanego w ciągu 20 dni walidacji.
    9. Za dopuszczalną uznaje się średnią dokładność międzydzienną, jeżeli mieści się ona w granicach dopuszczalności od 85% do 115% stężenia nominalnego. Uznaj, że precyzja międzydzienna jest akceptowalna, jeśli jest równa lub lepsza niż CV (współczynnik wariancji) wynoszący 15%.
  3. Wykluczenie zakłóceń matrycy.
    1. Aby wykluczyć zakłócenia, które mogą być spowodowane sygnałami matrycy, przeanalizuj puste wysuszone plamy krwi (8 różnych osób, najlepiej 4 samce i 4 samice).
    2. Sprawdź wzrokowo chromatogramy jonowe. W przypadku wykrycia pików takrolimusu w oknie retencji należy zintegrować i porównać ich pola pod krzywą z obszarami pików takrolimusu w ślepych próbkach wzbogaconych takrolimusem w LLOQ. Zakłada się, że powierzchnia pików w próbkach zerowych nie przekracza 15 % powierzchni pików takrolimusu w LLOQ.
  4. Tłumienie jonów/wzmacnianie jonów.
    1. Należy zastosować protokół infuzji po kolumnie, jak opisano45, aby ocenić potencjalną interferencję tłumienia jonów/wzmacniania jonów spowodowaną przez składniki matrycy koelucyjnej.
    2. Podawać takrolimus w stężeniu 10 μg/ml rozpuszczonym w 0,1% kwasie mrówkowym: metanolu (30:70, v/v) po kolumnie z szybkością 10 μl/min.
      1. Podłączyć pompę strzykawkową za pomocą trójnika między kolumną analityczną a źródłem elektrorozpylania spektrometru masowego.
      2. Monitorować intensywność sygnału MS/MS przejść MRM dla takrolimusu i jego wzorca wewnętrznego (m/z = 826,6 → 616,2 i m/z = 829,6 → 619,2) po wstrzyknięciu ekstrahowanych próbek zerowych (n = 8 próbek od różnych osobników).
        Uwaga: W przypadku braku tłumienia jonów/wzmacniania jonów, wstrzyknięcie matrycy ślepej nie powinno mieć wpływu na ciągły sygnał spowodowany infuzją analitów, podczas gdy tłumienie jonów powoduje spadek sygnału i wzmocnienie jonów o pik.
  5. Przeniesienia.
    1. Oceń potencjalne przeniesienie, analizując wyekstrahowane próbki ślepe po najwyższych kalibratorach (50 ng/ml, n = 6).
    2. Sprawdź wzrokowo chromatogramy jonowe. W przypadku wykrycia pików takrolimusu w oknie retencji należy zintegrować i porównać ich pola pod krzywą z obszarami pików takrolimusu w ślepych próbkach wzbogaconych takrolimusem w LLOQ. Zakłada się, że powierzchnia pików w próbkach zerowych nie przekracza 15 % powierzchni pików takrolimusu w LLOQ.
  6. Odzysk wydobycia.
    1. Określić poziomy odzysku, porównując sygnały analitów po ekstrakcji próbek kontroli jakości przy wszystkich czterech poziomach stężeń (n = 6 na stężenie) z sygnałami ślepej próby wysuszonej krwi wzbogaconej odpowiednimi ilościami takrolimusu po ekstrakcji.
    2. Przygotować cztery zestawy kontroli jakości (poziomy stężenia: 2, 4, 20, 40 ng/ml).
    3. Przygotować kolejne 4 zestawy odpowiednich "próbek do testów odzysku", nasycając 50 μl ślepej próby pełnej EDTA na kartach bibuły filtracyjnej i susząc przez 2 godziny.
    4. Następnie, zarówno w przypadku kontroli jakości, jak i ślepych "próbek do badania odzysku", należy wyciąć nożyczkami całą plamkę krwi na karcie filtracyjnej i umieścić powstałe krążki w polipropylenowej probówce ze stożkowym dnem i zatrzaskową pokrywką.
    5. Wyodrębnić wszystkie próbki.
    6. Przenieść supernatanty (400 μl) do szklanych fiolek HPLC.
    7. Dodać roztwór podstawowy takrolimusu do ślepej próby "wyekstrahowanych próbek do badania odzysku" w celu uzyskania stężeń 2, 4, 20 i 40 ng/ml (4 μl 200, 400, 2 000, 4 000 ng/ml roztworów podstawowych takrolimusu na 400 μl supernatantu).
    8. Po analizie LC-MS/MS porównaj sygnały zarówno w próbkach QC, jak i "próbkach do testu odzysku" o odpowiednim stężeniu (odzysk% = próbki sygnału wzmocnione przed ekstrakcją / próbki sygnału wzmocnione po ekstrakcji x 100).
  7. Integralność rozcieńczenia.
    1. Ustalić integralność rozcieńczenia, używając próbek wzbogaconych analitami w stężeniach 500, 250 i 100 ng/ml.
    2. Po ekstrakcji próbki rozcieńczyć roztworem do wytrącania białek (1:10, n = 3 na poziom stężenia).
    3. Obliczyć odchylenia od stężeń nominalnych. Weź pod uwagę wyniki, które mieszczą się w zakresie 85%-115% akceptowalnych wartości nominalnych.
  8. Stabilność.
    1. Zbadać stabilność, używając próbek kontroli jakości na wszystkich czterech poziomach stężeń (n = 4 na stężenie) analizowanych w różnych punktach czasowych i w różnych warunkach przechowywania.
    2. Porównaj wyniki po przechowywaniu z wartościami nominalnymi. Weź pod uwagę wyniki, które mieszczą się w zakresie 85%-115% akceptowalnych wartości nominalnych.
    3. Ustalić stabilność próbki przez 1 tydzień w temperaturze otoczenia, 1 tydzień w temperaturze 4 °C, 1 miesiąc w temperaturze -20 °C i 1 miesiąc w temperaturze -80 °C.
    4. Zbadać stabilność podczas zamrażania i rozmrażania w trzech cyklach (-20 °C). Zbadaj stabilność wyekstrahowanej próbki i automatycznego podajnika próbek, umieszczając je w termostatowanym autosamplerze ustawionym na 4 °C. Wstrzyknąć próbki po 72 godzinach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne chromatogramy jonowe ślepej próbki, próbki wzbogaconej o dolną granicę oznaczalności oraz próbki pacjenta są pokazane na rysunku 3.

Krzywe kalibracyjne

Dolna granica wykrywalności wynosiła 0,5 ng/ml, a dolna granica oznaczalności wynosiła 1,0 ng/ml. Pięćdziesiąt ng/ml zostało wybrane jako najwyższy kalibrator, ponieważ wyższe stężenia prawdopodobnie nie zostaną osiągnięte w klinice w normalnych warunkach.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż, jak wspomniano powyżej, koncepcja monitorowania leku terapeutycznego i przestrzegania zaleceń dotyczących stosowania takrolimusu w oparciu o wysuszone plamki krwi jest atrakcyjna, istnieją wyzwania analityczne, które wykraczają poza te zwykle związane z analizą LC-MS/MS takrolimusu w żylnych próbkach krwi pełnej EDTA. Należą do nich między innymi fakt, że matryca jest pełną krwią kapilarną nasączoną bawełnianym materiałem linters użytego tutaj materiału karty filtracyjnej oraz niską objętość krwi (20 μl). Niemni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Federalną Agencję Leków Stanów Zjednoczonych (FDA) HHSF223201310224C oraz grant 1U01FD004573-01 Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych/FDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KonwencjaFarmakopealna Stanów Zjednoczonych
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.
Czerwone krwinkiSzpital Uniwersytetu KoloradoW20091305500 V
OsoczeSzpital Uniwersytetu KoloradoW2017130556300Q
Aceton CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitryl Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Izopropanol 99,9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Metanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Woda Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Kwas mrówkowyThermo Fisher ScientificA118P-500
Solanka buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
SiarczanThermo Fisher ScientificZ68-500
0,5 – 10 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1,5 ml Probówka EppendorfThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMSMÄTTLER TOLEDO17008651
10 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylneNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMSMÄTTLER TOLEDO17008653
100 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylneNeptuneBT 100
1,000 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylneMultimax2940
2 – 20 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Probówka EppendorfThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMSMÄTTLER TOLEDO17008652
20 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylneGeneMateP-1237-20
200 μ l końcówki do pipet z filtremMultimax2938T
200 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylneMultimax2936J
50 ml Rurka FalconBD Falcon352070
300 μ l wkładki do fiolek HPLCWirówka PhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizatorNext AdvanceBBX24
PDIQ55172
Szklane pojemniki, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Fiolki szklane, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Rękawice, nitryloweRękawice marki Titan44-100S
Fiolki HPLC, 9 mm, 2 ml, przezroczystePhenomenexARO- 9921-13
Pokrywki do fiolek HPLCPhenomenexARO- 8952-13-B
Igła, 18 G 1.5305196Precyzyjny
stojak na rurki EppendorfThermo Fisher Scientific03-448-11
Stojak na fiolki HPLCThermo Fisher Scientific05-541-29
Koraliki stalowe 0,9 i 2 mmNext AdvanceSSB14B
Pojemniki do przechowywania zamrażarek / lodówekThermo Fisher Naukowy03-395-464
Standardowy wielorurowy wirownikVWR Scientific Products658816-115
Papier Whatman, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
Automatyczny podajnik próbekCTC PAL kumpel. HTCABIx1
Pompa binarna, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Pompa binarna, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Mikro odgazowywacz próżniowy, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Piec kolumnowy,  Agilent 1290 z 2 pozycjami Agilent Technologies1290 G1216C
Termostatowana komora kolumny ze zintegrowanym 6-portowym zaworem przełączającymAgilent Technologies1290 G1316C
Wkład wstępnej kolumny HPLC, Zorbax XDB C8 (5 µ Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; Kolumna analityczna 12,5 mmPhenomenex820950-926
HPLC, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &mikro; Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; 150 mmPhenomenex993967-906
Tandemowy spektrometr
API5000 MS/MS ze źródłem TurboIonsprayAB Sciex4364257
Oprogramowanie do spektrometrii masAB SciexAnalyst 1.5.1
1642802 F370002 Jednorazowe chusteczki Biofuge Fresco Heraeus 290395 masowy

Bibliografia

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973(2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilo ciowe takrolimusuanaliza LC MS MSwytr canie bia ekekstrakcja kolumnowa onlinetryb wielkich reakcjikrzywa kalibracyjnastandard wewn trznywycinanie plamek krwihomogenizacja w homogenizatorze kulowym
Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.