Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inhibitor kalcyneuryny, takrolimus, jest kamieniem węgielnym większości protokołów leczenia immunosupresyjnego po przeszczepie narządów litych w Stanach Zjednoczonych. Takrolimus jest lekiem o wąskim indeksie terapeutycznym i jako taki wymaga monitorowania dawki terapeutycznej i dostosowania dawki w oparciu o minimalne stężenia we krwi pełnej. Aby ułatwić domowe monitorowanie leków terapeutycznych i ich przestrzegania, atrakcyjną koncepcją jest pobieranie wysuszonych plam krwi. Po nakłuciu palca pacjent pobiera kroplę krwi na bibułę filtracyjną w domu. Po wysuszeniu krew jest wysyłana do laboratorium analitycznego, gdzie takrolimus jest oznaczany ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (HPLC-MS/MS) w połączeniu z prostym etapem ręcznego wytrącania białek i ekstrakcją kolumnową w trybie online.
Do analizy takrolimusu, 6-milimetrowy krążek jest wybijany z nasyconego środka plamki krwi. Plamka krwi jest homogenizowana za pomocą mieszalnika kulowego, a następnie białka są wytrącane metanolem/0,2 MZnSO4 zawierającym wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus. Po wirowaniu i odwirowaniu 100 μl supernatantu wstrzykuje się do kolumny ekstrakcyjnej online i przemywać 5 ml/min 0,1-kwasem mrówkowym/acetonitrylem (7:3, v:v) przez 1 min. Następnie aktywowany jest zawór przełączający, a anality są przepłukiwane wstecznie na kolumnę analityczną (i rozdzielane za pomocą 0,1% gradientu kwasu mrówkowego/acetonitrylu). Takrolimus jest oznaczany ilościowo w dodatnim trybie wielokrotnej reakcji (MRM) przy użyciu tandemowego spektrometru masowego.
Test jest liniowy od 1 do 50 ng/ml. Zmienność między testami (3,6%-6,1%) i dokładność (91,7%-101,6%) oceniane w ciągu 20 dni spełniają kryteria akceptacji. Średni odzysk ekstrakcji wynosi 95,5%. Nie ma istotnych przeniesień, zakłóceń matrycowych i efektów matrycowych. Takrolimus utrzymuje się w suchych plamkach krwi w temperaturze pokojowej i +4 °C przez 1 tydzień. Próbki wyekstrahowane w automatycznym podajniku próbek są stabilne w temperaturze +4 °C przez co najmniej 72 godziny.
Wprowadzenie
Takrolimus jest silnym środkiem immonosupresyjnym1-7, który ma strukturę makrolidową8 (Rysunek 1). Ze względu na izomerię cis-trans wiązań C-N tworzy dwa rotamery w roztworze9, które można rozdzielić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) Takrolimus jest lipofilowy i rozpuszczalny w alkoholach (metanol: 653 g/l, etanol: 355 g/l), chlorowcowanych węglowodorach (chloroform: 573 g/l) i eterze. Jest trudno rozpuszczalny w węglowodorach alifatycznych (heksan: 0,1 g/l i wodzie (pH 3: 0,0047 g/l)9. Cząsteczka nie zawiera chromoforu, a jej maksymalna absorpcja....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Niezidentyfikowane próbki krwi od zdrowych osób pochodziły ze Szpitala Uniwersytetu Kolorado (Aurora, Kolorado). Wykorzystanie zanonimizowanych próbek z banku krwi do badań walidacyjnych, jak również do przygotowania kalibratorów i próbek kontroli jakości zostało uznane za "wyłączone" przez Wieloinstytucjonalną Komisję Rewizyjną Kolorado (COMIRB, Aurora, Kolorado).
1. Przygotowanie referencji i rozwiązań
- Takrolimus i wzorzec wewnętrzny D2,13 C-takrolimus należy zakupić u dostawców wymienionych w wykazie materiałów.
- Przygotować roztwory podstawowe w czystym metanolu o stężeniu 1 mg/ml dla takroli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne chromatogramy jonowe ślepej próbki, próbki wzbogaconej o dolną granicę oznaczalności oraz próbki pacjenta są pokazane na rysunku 3.
Krzywe kalibracyjne
Dolna granica wykrywalności wynosiła 0,5 ng/ml, a dolna granica oznaczalności wynosiła 1,0 ng/ml. Pięćdziesiąt ng/ml zostało wybrane jako najwyższy kalibrator, ponieważ wyższe stężenia prawdopodobnie nie zostaną osiągnięte w klinice w normalnych warunkach.
.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż, jak wspomniano powyżej, koncepcja monitorowania leku terapeutycznego i przestrzegania zaleceń dotyczących stosowania takrolimusu w oparciu o wysuszone plamki krwi jest atrakcyjna, istnieją wyzwania analityczne, które wykraczają poza te zwykle związane z analizą LC-MS/MS takrolimusu w żylnych próbkach krwi pełnej EDTA. Należą do nich między innymi fakt, że matryca jest pełną krwią kapilarną nasączoną bawełnianym materiałem linters użytego tutaj materiału karty filtracyjnej oraz niską objętość krwi (20 μl). Niemni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Federalną Agencję Leków Stanów Zjednoczonych (FDA) HHSF223201310224C oraz grant 1U01FD004573-01 Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych/FDA.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Konwencja | Farmakopealna Stanów Zjednoczonych | ||
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | ||
| Czerwone krwinki | Szpital Uniwersytetu Kolorado | W20091305500 V | |
| Osocze | Szpital Uniwersytetu Kolorado | W2017130556300Q | |
| Aceton CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitryl Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Izopropanol 99,9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Metanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Woda Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Kwas mrówkowy | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Solanka buforowana fosforanami (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Siarczan | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0,5 – 10 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1,5 ml Probówka Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | MÄTTLER TOLEDO | 17008651 | |
| 10 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylne | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | MÄTTLER TOLEDO | 17008653 | |
| 100 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylne | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylne | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Probówka Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µ l pipeta, VoluMate LIQUISYSTEMS | MÄTTLER TOLEDO | 17008652 | |
| 20 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylne | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μ l końcówki do pipet z filtrem | Multimax | 2938T | |
| 200 μ l końcówki do pipet z filtrem, sterylne | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Rurka Falcon | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μ l wkładki do fiolek HPLC | Wirówka Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizator | Next Advance | BBX24 | |
| PDI | Q55172 | ||
| Szklane pojemniki, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Fiolki szklane, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Rękawice, nitrylowe | Rękawice marki Titan | 44-100S | |
| Fiolki HPLC, 9 mm, 2 ml, przezroczyste | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Pokrywki do fiolek HPLC | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Igła, 18 G 1.5 | 305196Precyzyjny | ||
| stojak na rurki Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Stojak na fiolki HPLC | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Koraliki stalowe 0,9 i 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Pojemniki do przechowywania zamrażarek / lodówek | Thermo Fisher Naukowy | 03-395-464 | |
| Standardowy wielorurowy wirownik | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Papier Whatman, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Automatyczny podajnik próbek | CTC PAL | kumpel. HTCABIx1 | |
| Pompa binarna, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Pompa binarna, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Mikro odgazowywacz próżniowy, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Piec kolumnowy, Agilent 1290 z 2 pozycjami | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Termostatowana komora kolumny ze zintegrowanym 6-portowym zaworem przełączającym | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| Wkład wstępnej kolumny HPLC, Zorbax XDB C8 (5 µ Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; Kolumna analityczna 12,5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &mikro; Wielkość cząstek m), 4,6 i middot; 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandemowy spektrometr | |||
| API5000 MS/MS ze źródłem TurboIonspray | AB Sciex | 4364257 | |
| Oprogramowanie do spektrometrii mas | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Bibliografia
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
