Celem tego protokołu jest zademonstrowanie zasad i technik pomiaru i obliczania szybkości filtracji kłębuszkowej, szybkości przepływu moczu oraz wydalania sodu i potasu u szczura. Ta demonstracja może być wykorzystana do zapewnienia uczniom ogólnego zrozumienia koncepcyjnego, jak mierzyć czynność nerek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Demonstracja w laboratorium fizjologii: szybkość filtracji kłębuszkowej u szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomiary współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) oraz frakcyjnego wydalania sodu (Na) i potasu (K) są kluczowe w ocenie funkcji nerek w zdrowiu i chorobie. GFR mierzy się jako klirens nerkowy inuliny w stanie stacjonarnym, który jest filtrowany w kłębuszkach nerkowych, ale nie jest wydzielany ani ponownie wchłaniany wzdłuż nefronu. Frakcjowe wydalanie Na i K można określić na podstawie stężenia Na i K w osoczu i moczu. Klirens nerkowy inuliny można wykazać u znieczulonego zwierzęcia, które ma cewniki w tętnicy udowej, żyle udowej i pęcherzu moczowym. Sprzęt i materiały używane do tej procedury są powszechnie dostępne w ośrodku badawczym, co sprawia, że procedura ta jest praktycznym sposobem pomiaru funkcji nerek. Celem tego filmu jest zademonstrowanie procedur wymaganych do przeprowadzenia demonstracji laboratoryjnej, w której ocenia się czynność nerek przed i po zastosowaniu leku moczopędnego. Przedstawiona technika może być wykorzystana do oceny czynności nerek w szczurzych modelach choroby nerek.
Wprowadzenie
Najważniejszą funkcją nerek jest homeostatyczna regulacja zawartości wody i elektrolitów w zewnątrzkomórkach. Nerki ściśle regulują wodę zewnątrzkomórkową, sód (Na) i potas (K), aby utrzymać prawidłowy poziom fizjologiczny. Zaburzenia czynności nerek mogą prowadzić do poważnych zaburzeń metabolicznych, które mogą być śmiertelne. Podstawowy proces nerkowy zachodzi w nefronie i rozpoczyna się od filtracji osocza w kłębuszkach nerkowych, a kończy się wydalaniem moczu. Inne procesy, które decydują o końcowym stężeniu wody, Na i K w moczu, to wydzielanie i wchłanianie zwrotne w nefronie. Pomiary współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) i frakcyjnego wydalania Na i K mają kluczowe znaczenie w ocenie funkcji nerek w zdrowiu i chorobie. Czytelnik jest odsyłany do wcześniej opublikowanych artykułów przeglądowych i podręczników w celu bardziej szczegółowego omówienia funkcji nerek1-4.
GFR może być mierzony jako klirens nerkowy inuliny w stanie stacjonarnym, który jest filtrowany w kłębuszku nerkowym, ale nie jest wydzielany ani ponownie wchłaniany wzdłuż nefronu5. Chociaż technika ta wymaga znieczulenia, przygotowania chirurgicznego i końcowego eksperymentu, jest uważana za złoty standard pomiaru GFR. Używając inuliny, która jest oznaczona izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), stężenie inuliny FITC w osoczu i moczu można łatwo zmierzyć w małych objętościach i wykorzystać do obliczenia GFR w wielu punktach czasowych eksperymentu. Frakcjowe wydalanie Na i K można określić na podstawie stężenia Na i K w osoczu i moczu.
Koncepcyjne zrozumienie sposobu pomiaru funkcji nerek można łatwo zademonstrować w krótkim laboratorium, zaprojektowanym tak, aby umożliwić studentom aktywny udział w niektórych aspektach eksperymentu. Ten film przedstawia przygotowanie przed laboratorium, demonstrację funkcji nerek i ocenę wyników po laboratorium. Techniki chirurgiczne niezbędne do wykonania pomiarów GFR zademonstrowano na znieczulonym szczurze. Ponadto przedstawiono przykładowe obliczenia GFR oraz frakcyjne wydalanie Na i K przed i po podaniu leku moczopędnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przed jakąkolwiek procedurą na zwierzętach, instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (IACUC) musi zatwierdzić protokół. Protokół ten został zatwierdzony przez IACUC Uniwersytetu Stanowego Michigan.
1. Przygotowanie roztworu inuliny FITC przed laboratorium
- Podgrzać 20 ml soli fizjologicznej do temperatury 70 °C i powoli mieszać ze 100 mg inuliny FITC (5 mg/ml inuliny), aż cała inulina się rozpuści.
- Schłodzić roztwór do RT i dodać 800 mg albuminy surowicy bydlęcej (40 mg/ml BSA, liofilizowany proszek, zasadniczo wolny od globulin, niska endotoksyna, czystość ≥98% przez elektroforezę w żelu agarozowym).
- Przefiltrować roztwór inuliny-BSA bibułą filtracyjną (stopień 1). Umieścić przefiltrowany roztwór w strzykawce o pojemności 20 ml z filtrem na końcówce strzykawki (0,2 μm) i przykryć folią w celu ochrony przed światłem.
2. Anestezjologia i chirurgia
- Umieść szczura w komorze indukcyjnej wypełnionej 5% izofluranem w celu wywołania znieczulenia. Zapisz masę ciała (250-350 g) i umieść szczura na podgrzewanej platformie chirurgicznej zaprojektowanej tak, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu. Delikatnie przymocuj szczura do platformy za pomocą taśmy laboratoryjnej na łapach. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1-2% izofluranu o czystości medycznej 100%O2 przy natężeniu przepływu powietrza 0,8-1,0 l/min.
- Wprowadzić cewnik stożkowy (końcówka wewnątrznaczyniowa OD, 2.7F) do tętnicy udowej w celu monitorowania ciśnienia krwi i tętna oraz pobierania próbek krwi.
- Wprowadzić cewnik (PE-50) do żyły udowej w celu infuzji inuliny. Przymocuj cewnik do otaczającej tkanki za pomocą plecionego jedwabnego szwu chirurgicznego5-O 6.
- Podłącz cewnik tętniczy do tensometrycznego przetwornika ciśnienia. Rejestruj ciśnienie krwi i tętno za pomocą oprogramowania do akwizycji danych i wyświetlaj je na ekranie komputera w czasie rzeczywistym. Technika ta jest szczegółowo zademonstrowana na filmie6.
- Odsłoń pęcherz przez nacięcie nadłonowe. Wytnij mały otwór w końcówce pęcherza i włóż kaniulę (PE-190) z rozszerzaną termicznie końcówką do wnętrza pęcherza w celu zebrania moczu. Przymocuj kaniulę do pęcherza moczowego za pomocą szwu ze sznurka do torebki.
3. Pobieranie moczu i krwi
- Umieścić strzykawkę z inuliną FITC w pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 ml/godz. na 100 g masy ciała (3 ml/godz. dla szczura o masie ciała 300 g). Podłączyć strzykawkę do cewnika do żyły udowej. Rozpocznij infuzję inuliny i odczekaj 1-2 godzinny okres równowagi. Strzykawkę należy przykryć folią w celu ochrony przed światłem.
- Określić, czy natężenie przepływu moczu jest stabilne i odpowiednie do analizy próbki (20 μl/min), pobierając próbkę moczu do wstępnie zważonej fiolki zbiorczej przez okres 10 minut. Określić objętość moczu grawimetrycznie za pomocą wagi cyfrowej. Odpowiednia objętość moczu na 10-minutowy okres zbierania wynosi 0,2 ml. Kontynuuj pobieranie próbek moczu, aż dwie kolejne zbiórki wykażą szybkość przepływu moczu 20 μl/min lub więcej.
- Próbki przedlekowe
- Pobieraj próbkę moczu w ciągu 20 minut. Pobrać próbkę krwi (0,5 ml) z cewnika tętniczego w połowie okresu zbierania moczu. Należy uważać, aby całkowicie oczyścić cewnik tętniczy z soli fizjologicznej przed pobraniem próbki krwi do fiolki zbiorczej zawierającej heparynę 1 j. Należy używać fiolek do pobierania z oznaczeniami objętości, aby ułatwić pobranie 0,5 ml krwi tętniczej.
- Przepłukać cewnik tętniczy solą fizjologiczną heparyny (20 j./ml), aby oczyścić cewnik z krwi (ok. 0,1 ml). Długość cewnika tętniczego powinna być jak najkrótsza, aby ograniczyć objętość heparyny z soli fizjologicznej wymaganej do spłukiwania.
Uwaga: Rozcieńczone próbki krwi dają niedokładne obliczenia GFR i frakcyjnego wydalania Na i K. - Odczekaj 10 minut i powtórz pobieranie drugiej próbki moczu i krwi przed pobraniem leku.
- Po pobraniu dwóch próbek przed pobraniem leku należy podać lek moczopędny, furosemid (10 mg/kg), przez cewnik tętniczy. Przepłukać cewnik tętniczy heparynizowaną solą fizjologiczną, aby oczyścić cewnik z leku. Należy uważać, aby zapobiec wstrzyknięciu powietrza przez cewnik tętniczy. Zapisać czas wstrzyknięcia furosemidu.
- Próbki po podaniu leku: W każdym z 3 poniższych punktów czasowych należy pobrać próbkę moczu w ciągu 10-minutowego okresu zbierania moczu oraz próbkę krwi (0,5 ml) w połowie okresu zbierania moczu.
- W przypadku próbki po podaniu leku 1 – zebrać pięć minut po furosemidzie.
- W przypadku próbki po podaniu leku 2 – zebrać dziesięć minut po furosemidzie.
- W przypadku próbki po podaniu leku 3 – zebrać piętnaście minut po furosemidzie.
- Po pobraniu wszystkich próbek należy poddać szczura eutanazji zgodnie z procedurami instytucjonalnymi poprzez torakotomię i usunięcie serca. Usuń obie nerki. Zdekapsuluj (usuń otaczającą błonę) i osusz nerki, aby usunąć nadmiar krwi. Zważ nerki.
4. Przykładowa analiza
- Zmierz grawimetrycznie wszystkie objętości próbek moczu za pomocą wagi cyfrowej i zapisz masę.
- Odwirować próbki krwi pełnej za pomocą wirówki stołowej (1 800 x g) w celu oddzielenia osocza. Przenieść próbki osocza do małych oznakowanych fiolek.
- Analizować stężenia Na i K w próbkach moczu i osocza za pomocą analizatora sodu/potasu.
- Pomiar FITC-inuliny w osoczu i moczu
- Rozcieńczyć mocz przed pobraniem leku (od 1:200 do 1:400) i mocz po leku (1:10) buforem HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Dodać 40 μl wzorca lub próbki i 60 μl buforu HEPES do płytki 96-dołkowej (jedna próbka na studzienkę) i pozostawić do wymieszania przez 10 minut, przykryte folią aluminiową.
- Wygeneruj krzywą wzorcową dla inuliny FITC dla stężeń 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 μg/ml (rysunek 1). Oznaczyć fluorescencję FITC-inuliny w próbkach i wzorcach za pomocą czytnika mikropłytek o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 538 nm.
- Dopasuj wartości fluorescencji dla wzorców do 4-parametrowej analizy regresji funkcji logistycznych. Parametry funkcji regresji służą do obliczania stężenia FITC-inuliny w próbkach osocza i moczu (tabela 1).
5. Analiza wyników po laboratorium: Obliczenia
- Obliczać Natężenie przepływu moczu (UV; ml/min): [objętość zebranego moczu (ml)] ÷ [czas zbierania (min)]
- Obliczać Współczynnik filtracji kłębuszkowej (GFR; ml/min): [Stężenie inuliny w moczu (μg/ml) x UV (ml/min)] ÷ [Stężenie inuliny w osoczu (μg/ml)]
- Obliczać Przefiltrowany ładunek sodu (μmol/min): Stężenie sodu w osoczu (μmol/ml) x GFR (ml/min)
- Obliczać Szybkość wydalania sodu (U NaV; μmol/min): Stężenie sodu w moczu (μmol/ml) x UV (ml/min)
- Obliczać Frakcjowe wydalanie sodu (FE Na; %): [U NaV (μmol/min)] ÷ [Przefiltrowany ładunek sodu (μmol/min)] x 100
- Obliczać Przefiltrowany ładunek potasu (μmol/min): Stężenie potasu w osoczu (μmol/ml) x GFR (ml/min)
- Obliczać Szybkość wydalania potasu (UK V; μmol/min): Stężenie potasu w moczu (μmol/ml) x UV (ml/min)
- Obliczać Frakcjowe wydalanie potasu (FE K; %): [UKV (μmol/min)] ÷ [Przefiltrowany ładunek potasu (μmol/min)] x 100
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Lekiem moczopędnym używanym w demonstracji laboratoryjnej była furosemid, która bardzo szybko hamuje reabsorpcję Na i K filtrowanych przez nerki, co prowadzi do zwiększenia wydalania Na, K i wody w ciągu kilku minut od podania leku. Ze względu na swój główny mechanizm działania, furosemid powinien mieć minimalny wpływ na GFR oraz filtrowane obciążenie Na i K, ale zwiększy przepływ moczu oraz frakcyjną ekskrecję Na i K.
Reprezentatywne wyniki przedstawione w Tabeli 3 pokazują, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odpowiedni marker do pomiaru GFR musi spełniać cztery kryteria: być swobodnie filtrowany w kłębuszkach nerkowych, nie być związany z białkami osocza i nie być ani wchłaniany, ani wydzielany w nefronie. Inulina jest polimerem fruktozy, który spełnia te kryteria. W rezultacie, klirens nerkowy inuliny jest uważany za złoty standard pomiaru GFR7. Zaprezentowana technika reprezentuje tradycyjne podejście polegające na oznaczaniu klirensu nerkowego inuliny za pomocą czasowych zbiorów moczu podczas ciągłego wlewu inu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autora i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony.
Podziękowania
Źródłem finansowania demonstracji laboratoryjnej był grant NIGMS: GM077119. Dziękujemy dr Josephowi R. Haywoodowi i dr Peterowi Cobbettowi za ich wsparcie dla Short Couse in Integrative and Organ Systems Pharmacology. Dziękujemy również Pani Hannah Garver za jej wsparcie techniczne przy demonstracji laboratoryjnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-0 Pleciony jedwabny szew chirurgiczny | Specjalizacje chirurgiczne Corp | SP1033 | |
| Płytka testowa, 96-dołkowa | Costar | 3922 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Wirówka | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Stożkowe probówki | na próbki Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Aplikatory z końcówką bawełnianą | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Waga cyfrowa | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulina | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gąbki z gazy | Covidien | 2146 | |
| Podgrzewane łóżko chirurgiczne | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparyna | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Izofluran | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Waporyzator izofluranowy | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Mikrokleszcze preparacyjne | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| Analizator sodu/potasu NOVA 5+ | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Uchwyty igieł Olsen-Hegar z nożyczkami | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (do cewnika pęcherza moczowego) | Przetwornik | ||
| nbsp; | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Cewnik do stożkowej tętnicy udowej szczura | Zastosowania strategiczne Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Nożyczki do zeza | Narzędzia do nauki | 14075-11 | |
| Nożyczki chirurgiczne dla studentów | Narzędzia do nauki o nauce | 91402-12 | |
| Rękawice chirurgiczne | Kimberly-Clark | Sterling Rękawice | |
| Pompka strzykawkowa | Razel Scientific | R99-E | |
| Kleszczyki do tkanek | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 91121-12 | |
| Nożyczki do tkanek | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Pleciony jedwabny szew chirurgiczny Specjalizacje chirurgiczne Corp SP1033 Płytka testowa, 96-dołkowa Costar 3922 Albumina surowicy bydlęcej Sigma Chemical Co A2934-25G Wirówka Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Stożkowe probówki na próbki Dot Scientific Inc. #711-FTG Aplikatory z bawełnianą końcówką Solon Manufacturing Co 56200 Oprogramowanie do akwizycji danych ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Skala Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulina Sigma Chemical Co F3272-1G Gąbki z gazy Covidien 2146 Podgrzewane łóżko chirurgiczne EZ-Anesthesia EZ-212 Heparyna Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Izofluran Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Waporyzator izofluranowy EZ-Anesthesia EZ-190F Mikrokleszcze preparacyjne Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Czytnik mikropłytek - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Analizator sodu/potasu NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Uchwyty igieł z nożyczkami Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (do cewnika pęcherza moczowego) Przetwornik ciśnienia 427435 BD Medical ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Cewnik stożkowy do tętnic udowych szczura Zastosowania strategiczne Inc. RFA-01 Salix Furosemid 5% Intervet #34-478 Nożyczki do zeza Narzędzia do nauki o zezie 14075-11 Nożyczki chirurgiczne dla studentów Narzędzia naukowe 91402-12 Rękawice chirurgiczne Rękawice nitrylowe Kimberly-Clark Sterling Pompka strzykawkowa Razel Scientific R99-E Kleszczyki do tkanek Narzędzia do nauki precyzyjnej 91121-12 Nożyczki do tkanek George Tiemann Co 105-420 |
Bibliografia
- Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
- Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
- Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney International. 38 (1), 167-184 (1990).
- Thurau, K., Valtin, H., Schnermann, J. Kidney. Annual Review of Physiology. 30, 441-524 (1968).
- Shannon, J. A., Smith, H. W. The excretion of inulin, xylose, and urea by normal and phoriziniaed man. Journal of Clinical Investigation. 14, 393-401 (1935).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Sterner, G., et al. Determining 'true' glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or predictive equations. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 42, 278-285 (2008).
- Toto, R. D. Conventional measurement of renal function utilizing serum creatinine, creatinine clearance, inulin and para-aminohippuric acid clearance. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 4 (6), 505-509 (1995).
- Matavelli, L. C., Kadowitz, P. J., Navar, L. G., Majid, D. S. Renal hemodynamic and excretory responses to intra-arterial infusion of peroxynitrite in anesthetized rats. Americam Journal of Physiology. 296, F170-F176 (2009).
- Davidson, W. D., Sackner, M. A. Simplification of the anthrone method for the determination of inulin in clearance studies. Journal of Laboratory, & Clinical Medicine. 62, 351-356 (1963).
- Symes, A. L., Gault, M. H. Assay of inulin in tissues using anthrone. Clinical Biochemistry. 8 (1), 67-70 (1975).
- Shalmi, M., Lunau, H. E., Petersen, J. S., Bak, M., Christensen, S. Suitability of tritiated inulin for determination of glomerular filtration rate. Americam Journal of Physiology. 260 (2 Pt 2), F283-F289 (1991).
- Denton, K. M., Anderson, W. P. Glomerular untrafiltration in rabbits with superficial glomeruli. EUropean Journal of Physiology. 419 (3-4), 235-242 (1991).
- Jobin, J., Bonjour, J. -P. Measurement of glomerular filtration rate in conscious unrestrained rats with inulin infused by implanted osmotic pumps. Americam Journal of Physiology. 248 (5 Pt 2), F734-F738 (1985).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Americam Journal of Physiology. 276 (1 Pt 2), F172-F177 (1999).
- Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Americam Journal of Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Bivona, B. J., Park, S., Harrison-Bernard, L. M. Glomerular filtration rate determinations in conscious type II diabetic mice. Americam Journal of Physiology. 300 (3), F618-F625 (2011).
- Rosen, S. M. Effects of anaesthesia and surgery on renal hemodynamics. British Journal of Anesthesiology. 44, 252-258 (1972).
- Cousins, M. J. Anesthesia and the kidney. Anaesthesia and intensive care. 11 (4), 292-320 (1983).
- Walter, S. J., Zewde, T., Shirley, D. G. The effect of anaesthesia and standard clearance procedures on renal function in the rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology. 74, 805-812 (1989).
- Rieg, T. A. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (75), (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
