Mysi izolowany model serca ogłuszenia mięśnia sercowego związanego z zatrzymaniem krążenia

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest ocena ogłuszenia mięśnia sercowego po niedokrwiennym zatrzymaniu krążenia u gryzoni.

Streszczenie

Poniższy protokół jest przydatny do oceny upośledzonej funkcji serca lub ogłuszenia mięśnia sercowego po umiarkowanych urazach niedokrwiennych. Technika ta jest przydatna do modelowania uszkodzenia niedokrwiennego związanego z wieloma klinicznie istotnymi zjawiskami, w tym kardiochirurgią z zatrzymaniem krążenia i pomostowaniem krążeniowo-oddechowym, CABG poza pompą, przeszczepem, dławicą piersiową, krótkim niedokrwieniem itp. W protokole przedstawiono ogólną metodę modelowania hipotermii, hiperkaliemii, zatrzymania i reperfuzji w sercach gryzoni, koncentrując się na pomiarze funkcji skurczu mięśnia sercowego. Krótko mówiąc, serce myszy jest perfundowane w trybie langendorffa, instrumentowane za pomocą balonu dokomorowego i rejestrowane są wyjściowe parametry funkcjonalne serca. Po ustabilizowaniu się serca poddaje się krótkiej infuzji roztworu kardioprotekcyjnej kardioprogologii hipotermicznej w celu zainicjowania zatrzymania rozkurczowego. Kardioplegia jest dostarczana z przerwami przez 2 godziny. Serce jest następnie reperfaktorowane i ogrzewane do temperatur normotermicznych i monitorowane jest odzyskiwanie funkcji mięśnia sercowego. Zastosowanie tego protokołu skutkuje niezawodną obniżoną funkcją skurczową serca wolną od poważnych uszkodzeń tkanki mięśnia sercowego u gryzoni.

Wprowadzenie

Ogłuszenie mięśnia sercowego definiuje się jako odwracalne zmniejszenie aktywności skurczowej pomimo przywrócenia odpowiedniego przepływu krwi po krótkim okresie niedokrwienia lub długotrwałych okresach niedokrwiennych z kardioprotekcją^1,2,3,4,5. Przedstawiona metoda jest specjalnie stosowana do modelowania klinicznie istotnych urazów niedokrwiennych, które mogą powodować odwracalne upośledzenie funkcji skurczowej (tj. Uszkodzenia niedokrwienne związane z kardiochirurgią z wykorzystaniem zatrzymania krążenia, krótkich okresów niedokrwienia, dławicy piersiowej itp.). W przeciwieństwie do badań nad ciężkim niedokrwieniem mięśnia sercowego (zawał mięśnia sercowego, martwica), protokół ten został opracowany w celu oceny odzyskiwania funkcji mięśnia sercowego i kardioprotekcji bez uszkodzenia tkanki, przebudowy i śmierci komórek. W przeważającej części pracy omówiono standardowy protokół zatrzymania krążenia z elementami podobnymi do kardiochirurgii z wykorzystaniem hipotermii i przerywanego porodu kardioplegii.

Ochrona mięśnia sercowego podczas większości operacji kardiochirurgicznych opiera się na kardioplegii i obejściu krążeniowo-oddechowym. Chociaż rozwiązania i strategie kardioplegii (CP) różnią się znacznie (krew, krystaloidy, zimno, ciepło itp.), najczęstszymi elementami są: 1) hiperkaliemia i/lub inne strategie mające na celu zatrzymanie pracy serca w stanie rozkurczu, ograniczając w ten sposób wykorzystanie energii wynikające ze skurczu mięśnia sercowego, oraz 2) hipotermia w celu spowolnienia metabolizmu i pomocy w utrzymaniu ATP i innych rezerw energii podczas zatrzymania. Obecne rozwiązania w zakresie kardioplegii zapewniają ochronę serca przed urazami niedokrwiennymi, które w przeciwnym razie okazałyby się śmiertelne. Jednak strategie kardioprotekcyjne podczas chirurgicznych urazów niedokrwiennych nie są doskonałe, a wynikające z tego łagodne uszkodzenie niedokrwienne może skutkować odwracalną dysfunkcją skurczu serca pomimo odpowiedniego przepływu krwi (ogłuszenie mięśnia sercowego), kwasicę, uszkodzenie kardiomiocytów i skutki naczyniowe, w tym zmniejszoną perfuzję wieńcową i skurcz naczyń.

Ten protokół różni się od standardowych modeli izolowanego niedokrwienia serca oceniających zawał mięśnia sercowego i ciężkie niedokrwienie tym, że ocenia łagodniejsze uszkodzenia niedokrwienne, które mogą skutkować upośledzeniem funkcji serca po krótkim niedokrwieniu lub niedokrwieniem związanym z zatrzymaniem krążenia. (przegląd technik perfuzji Langendorffa i badań I/R, patrz ^6-8). Ogólne wytyczne i dokładna analiza parametrów eksperymentalnych związanych z izolowanymi perfuzjonowanymi sercami myszy można znaleźć w Sutherland et al. 2003⁹ Przedstawiona tutaj technika szczegółowo opisuje niezbędny sprzęt, odczynniki, kroki, strategie i wskazówki, aby niezawodnie wywołać ogłuszenie w sercach myszy. Konieczne są drobne modyfikacje, aby zastosować tę technikę u szczurów.

Krótko izolowane serca myszy są poddawane Langendorffowi przez około 30 minut fizjologicznym buforem Krebsa-Henseleita (KHB), po czym następuje zatrzymanie akcji serca chronione przed zimnem poprzez dostarczenie roztworu hiperkaliemicznego hipotermicznego kardioplegii. Po zatrzymaniu czynności serca monitoruje się jego regenerację podczas rozgrzewania i reperfuzji serca za pomocą KHB. Zmiany w stopniu odzyskania funkcji skurczowej serca można ocenić w celu oceny środków kardioprotekcyjnych i różnych strategii kardioprotekcyjnych.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Dożywotnich, a wszystkie zwierzęta i procedury są zgodne z Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych¹⁰.

1. Produkcja balonów i obwód monitorowania ciśnienia w lewej komorze

1. Konstruowanie balonów nn według Millera i wsp.¹¹ W zlewce z mieszadłem wymieszaj 9,5 ml wody destylowanej, 14,2 ml jasnego syropu kukurydzianego i 33,8 g sacharozy, podgrzej na gorącym talerzu, mieszaj, aż cukier się rozpuści. Kontynuuj podgrzewanie roztworu, aż osiągnie około 150 ºC.
   UWAGA: Istnieje wiele metod konstruowania balonów NN, w tym modyfikacja końcówek prezerwatyw i konstrukcja folii spożywczej^9,12. Uważamy, że powyższa metoda jest stosunkowo łatwa do skonstruowania balonów szczelnych, jednak zaletą balonów z folii spożywczej jest wcześniejsza charakterystyka odpowiednich zależności częstotliwości-odpowiedzi⁹.
2. Połam suche nitki spaghetti na kawałki o długości około 5 cm i zanurz jeden bok każdego kawałka na głębokość około 1 cm w roztworze cukru i powoli wyjmij.
3. Umieść suchy koniec pasma makaronu w bloku styropianu i zawieś, aby mieszanka cukru spłynęła i utworzyła formę w kształcie łzy. Pozostaw O/N w eksykatorze, aby forma stwardniała.
4. Następnego dnia zanurz formy w silikonowym żelu dyspersyjnym. Umieść pasma makaronu z powrotem w bloku styropianu i wstaw do piekarnika o temperaturze 37 ºC na 2 godziny lub do wyschnięcia. Powtórz ten krok jeszcze raz, aby nałożyć dwie warstwy silikonu.
5. Po wyschnięciu umieść w wodzie na kilka godzin, aby pomóc w usunięciu balonu z formy. Balony należy przechowywać w 0,02% roztworze azydku sodu.
6. Użyj zestawu do pobierania krwi 23 G, aby wyprodukować niestandardową kaniulę balonową, przecinając igłę, aby uzyskać końcówkę i umieszczając nacięcia w igle.
7. Podłącz rurkę do przetwornika ciśnienia i przepłucz wodą, utrzymując rurkę i kaniulę całkowicie zanurzone, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu. Umieść balon wypełniony wodą na kaniuli i użyj jedwabnych szwów 2-0, aby zawiązać na kaniuli. Balon testowy pod kątem zdolności do utrzymywania ciśnienia (~100 mmHg przez co najmniej 1 godzinę)

2. Przygotowanie izolowanego systemu perfuzji serca

1. Początkowo umyj i ogrzej system. Włączyć cyrkulator kąpieli ciepłej wody o temperaturze 37 ºC, który został podłączony do aparatu Langendorffa i napełnić zbiornik buforowy wodą destylowaną. Podłącz nowy filtr z włókna szklanego do rurki zasilającej urządzenie i włącz pompę, aby przepłukać system. W czasie przygotowania monitoruj temperaturę wody wydychanej z bloku Langendorff za pomocą sondy temperatury, aby upewnić się, że kąpiel wodna jest dokładnie ustawiona. Włącz również chłodzoną pompę cyrkulacyjną i ustaw ją na 20 ºC, która będzie używana podczas zatrzymania krążenia serca.
2. W międzyczasie przygotuj następujące rozwiązania. Przygotować 1 l roztworu do walki z kardioplegią (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 10 mM NaHCO₃) i przefiltrować. Przygotuj również 2 l KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO_4, 1,7 mM MgSO₄, 2 mM Na-pirogronian, 6 mM dekstrozy, 24,9 mM NaHCO₃ (wstępnie napowietrzony CO₂), 1,4 mM CaCl₂ (dodany jako ostatni). Po rozpuszczeniu usunąć osady, filtrując je do kolby za pomocą lejka do spiekania szklanego o grubości 5 μm. Umieść trochę w małym naczyniu na lodzie, które będzie używane podczas operacji i izolacji.
3. Natlenić perfuzat (KHB) 95% O₂/5% CO₂ przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Uruchom system Langendorff z KHB, aby usunąć pozostałą wodę z systemu i zbiornika buforowego. W przypadku myszy ustaw początkową prędkość pompy na ~2,0 ml/min. Umieść szwy jedwabne 2-0 i 4-0 w pobliżu kaniuli perfuzyjnej. Uruchom pompę, aż rurki i aparatura zostaną wypełnione perfuzatem, a następnie upewnij się, że pęcherzyk powietrza jest wypełniony perfuzatem.
   UWAGA: W przypadku długich okresów perfuzji i stabilnego funkcjonowania zdecydowanie zaleca się zainstalowanie wbudowanego filtra z włókna szklanego (~1 μm) w obwodzie perfuzyjnym w celu zebrania wszelkich osadów, które mogą tworzyć skrzepy w sercu

3. Chirurgia myszy

3.1) Znieczulenie i obsługa myszy

1. Przygotować strzykawkę z dawką znieczulającą 80 mg/kg ketaminy i mieszaniną 5 mg/ml ksylazyny i dodać sterylną sól fizjologiczną o stężeniu 0,9%, aby zwiększyć objętość do 0,2 ml. Wstrzyknąć heparynę I.P. (50 μl roztworu o stężeniu 1 000 j./ml).
2. Umieść mysz z powrotem w pojemniku transportowym (~10-20 min) i poczekaj, aż straci przytomność, gdy heparyna zacznie działać. Okresowo wykonuj szczypanie palca u nogi, aby monitorować odruch bólowy.

3.2) Usuń Serce

1. Gdy mysz jest całkowicie nieprzytomna i nie reaguje na uszczypnięcie palca, przymocuj ją do odpowiedniego stołu operacyjnego za pomocą szpilek lub końcówek strzykawki 25 G przez kończyny. Wykonaj torakotomię, aby odsłonić serce. Wytnij mały otwór tuż pod mostkiem i przedłuż nacięcie na boki myszy, omijając przeponę.
2. Szybko przetnij membranę, a następnie szybko przetnij boki klatki piersiowej. Odwróć klatkę piersiową jak muszlę małża, aby odsłonić klatkę piersiową. Delikatnie chwyć serce, umieść pod nim nożyczki i wyjmij serce.
   UWAGA: Konieczne jest szybkie usunięcie serca, gdy zostanie ono odsłonięte w klatce piersiowej, a płuca nie działają.

3.3) Oczyść Serce

1. Umieść serce w naczyniu zawierającym lodowaty KHB i odetnij wszelkie duże kawałki dołączonej tkanki płucnej. Użyj kleszczy, aby podnieść serce i zlokalizować aortę. Delikatnie ściśnij serce i poszukaj krwi, która się pojawi, ponieważ powinien to być otwarty koniec aorty. Użyj pęsety z cienką końcówką, aby przytrzymać serce za otwarty koniec aorty.

4. Montaż serca, rozpoczęcie perfuzji i umieszczenie balonu

4.1) Montaż i kaniulacja serca

1. Przed przetransportowaniem serca do aparatu Langendorffa należy włączyć pompę, upewniając się, że ciśnienie perfuzji jest niskie (~20 mmHg). Trzymaj serce za aortę tuż pod kaniulą. Używając innego zestawu pęsety z cienką końcówką, ostrożnie otwórz aortę i wsuń serce w górę na kaniulę. Przytrzymaj go na miejscu za pomocą jednego zestawu pęsety, a następnie użyj klipsa o miękkich krawędziach, aby tymczasowo przymocować go do kaniuli.
   UWAGA: Szybkie zamontowanie serca do kaniuli perfuzyjnej ma kluczowe znaczenie dla dobrego przygotowania. Z doświadczenia wynika, że zabiegi od otwarcia klatki piersiowej do zamontowania serca powinny trwać od 1 do 2 minut.
2. Zawiąż i rozpocznij perfuzję w następujący sposób, używając jedwabnego szwu 4-0 przymocuj aortę do kaniuli bezpośrednio pod klipsem. Upewnij się, że zawiązka znajduje się również wokół metalowej kaniuli aortalnej, aby aorta nie została zawiązana podczas zaciskania węzła. Po mocnym umieszczeniu jednego krawata zdejmij klips.
3. Użyj dodatkowych jedwabnych szwów, aby bezpiecznie przymocować aortę do kaniuli, upewniając się, że zawiązałeś ją poniżej wszelkich gałęzi naczyń, które mogą schodzić z aorty. Często można je zauważyć po wycieku perfuzatu lub wystrzeliwaniu z aorty.
   UWAGA: W początkowych etapach perfuzji krew powinna być wypłukiwana z serca, a całe serce powinno mieć delikatny różowy kolor. Ciemne przebarwienia, które nie zmywają się, wskazują na obszary niedokrwienne, prawdopodobnie spowodowane zatorem powietrznym lub skrzepami i nie należy używać serca.

4.2) Ustalanie pomiaru perfuzji i LVP

1. Powoli zwiększaj ciśnienie perfuzji i zwiększaj prędkość pompy, aż ciśnienie perfuzji osiągnie 70 mmHg.
   UWAGA: Standardowe ciśnienie perfuzji dla perfuzji myszy może wynosić 70-90 mmHg, ale musi być utrzymywane na stałym poziomie w każdym zwierzęciu w ramach eksperymentu.
2. Oczyść pozostałą tkankę (płuca, tarczycę itp.), które mogą być nadal przyczepione do serca. Użyj nożyczek, aby odciąć lewe przedsionki, aby utworzyć otwór w lewej komorze.
3. Umieść balon na uchwycie i opróżnij powietrze. Umieść kaniulę balonową w pobliżu kaniuli aortalnej, bezpośrednio nad otworem do lewej komory. Ostrożnie włóż balon w dół do lewej komory, trzymając serce na miejscu, aby aorta się nie rozerwała.
4. Po umieszczeniu na miejscu powoli zacznij napompowywać balon, aż LVEDP osiągnie ~8 mmHg. Umieść sondę temperatury na dnie serca, aby mierzyła temperaturę ścieków.

4.3) Pomiar podstawowy

1. Zamknij serce w komorze perfuzyjnej z płaszczem wodnym. W tym czasie należy stale perfuzjować serce za pomocą KHB i upewnić się, że temperatura nadal rośnie. Monitoruj temperaturę i odpowiednio dostosuj łaźnię wodną, aż osiągnie około ~37 ºC.
   UWAGA: Monitorowanie temperatury w początkowych fazach perfuzji ma kluczowe znaczenie, ponieważ przepływy wieńcowe, a następnie temperatura może się różnić w zależności od serca. Temperatura perfuzatu ścieków jest monitorowana pod kątem pożądanej temperatury mięśnia sercowego za pomocą sondy temperatury umieszczonej na wierzchołku serca. Ponadto, w porównaniu z innymi protokołami perfuzji Langendorffa, serce nie jest zanurzone w CP lub KHB podczas perfuzji lub zatrzymania, odbywa się to głównie w celu szybkiej regulacji temperatury, a także zapewnienia wydajnego dostarczania CP bez dyfuzji.
2. Rozpocznij ciągłą rejestrację pomiarów funkcjonalnych za pomocą systemu akwizycji danych podłączonego do odpowiednich czujników, w tym ciśnienia perfuzyjnego, ciśnienia w lewej komorze (przetwornik ciśnienia przymocowany do balonu LVP), temperatury i parametrów elektrofizjologicznych (EKG, MAP, jeśli jest na wyposażeniu) (załączniki będą zgodne z producentami i specyficzne dla poszczególnych czujników i systemu akwizycji danych). Gdy ściek KHB osiągnie ~37 ºC przez co najmniej 15 minut, a parametry czynnościowe serca są stabilne, zanotuj czas pomiarów wyjściowych.
   UWAGA: Kryteria włączenia/wykluczenia są stosowane do każdego serca. LVDP wynoszący <60 mmHg na początku badania wskazuje na serce, które powinno zostać usunięte z analizy. Ponadto przepływ wieńcowy >4,5 ml/min lub niezdolność do utrzymania ciśnienia perfuzyjnego na początku badania prawdopodobnie wskazuje na nieszczelną lub rozerwaną aortę. Również wszelkie serca, które mają wyraźne obszary niedokrwienne, które można potwierdzić wizualnie (np. skrzep) lub wykazują związane z niedokrwieniem zmniejszenie czynności serca (tj. zwiększenie LVeDP, skrajnie arytmiczne), są usuwane z analizy.
3. Zmierzyć przepływ wieńcowy poprzez zbieranie ścieków wieńcowych w cylindrze z podziałką przez 1 minutę. Zamknąć komorę i pozwolić, aby temperatura i funkcja powróciły do wartości wyjściowych. Alternatywnie można mierzyć przepływ wieńcowy w sposób ciągły w linii perfuzyjnej za pomocą sondy przepływu umieszczonej za obwodem nadmiarowym.

5. Inicjowanie zatrzymania krążenia

1. Umieścić 100 ml zimnego buforu kardioplegii w innym zbiorniku i przenieść kaniulę zbiornika KHB do zbiornika kardioplegii.
2. Odłączyć obudowę z płaszczem wodnym i obieg ogrzewania perfuzyjnego od ciepłej łaźni wodnej i podłączyć do cyrkulatora chłodniczego za pomocą szybkozłączy przewodów. Używaj oddzielnych cyrkulatorów grzewczych i chłodzących, aby umożliwić szybkie zmiany temperatury serca i perfuzacji.
3. Podążaj za pęcherzykiem powietrza, który zostanie wprowadzony do rurki podczas przełączania, a gdy dotrze w pobliże izolowanego serca, rozpocznij czas kardioplegii. Dostarczaj kardioplegię przez 2 minuty. Po podaniu dawki początkowej należy przerwać pompę. Upewnij się, że zatrzymałeś serce w stanie rozkurczu i zbliżaj się do żądanej temperatury CP.
   UWAGA: Konieczna jest wystarczająca pułapka bąbelkowa, aby uniknąć zatoru powietrznego w sercu. Alternatywnie można łatwo zbudować system dostarczania dla obu zbiorników przełączany za pomocą kranu odcinającego, jednak po małym pęcherzyku powietrza, który jest wprowadzany podczas wymiany kaniuli między zbiornikami, odkrywamy, że jest to łatwa metoda pomiaru czasu dostarczania CP przy potencjalnie różnych prędkościach pompy między eksperymentami (tj. z powodu myszy/szczura, ciśnienia perfuzji, oporu filtra itp.)
4. Utrzymuj serce w kardioplegii przez 2 godziny w temperaturze ~20 ºC. Co pół godziny podczas CP ponownie włączaj pompę na 1 minutę, aby podać kolejną dawkę.
   UWAGA: Przerywane dawki CP co 30 minut powodują upośledzenie funkcji serca bez martwicy tkanki. Dłuższe okresy między dawkami CP (tj. >45 min) mogą powodować martwicę i przykurcz niedokrwienny i byłyby bardziej odpowiednie dla modelu martwiczego uszkodzenia związanego z niezabezpieczonym niedokrwieniem.

6. Reperfuzja

1. Pod koniec CP przenieś kaniulę zbiornika z powrotem do natlenionego KHB. Podłącz obwody regulacji temperatury do cyrkulatora grzewczego i włącz pompę, aby rozpocząć reperfuzję. W tym momencie kardioplegia wypłukuje się, obserwuj wzrost temperatury, a serce zaczyna ponownie bić po 2-4 minutach reperfuzji. Kiedy zaczyna bić serce, bicie jest powolne i często arytmiczne.
   UWAGA: Zwykle nie występuje duży wzrost rozkurczowego LVP (tj. wzrost o ≤10 mmHg), co jest często charakterystyczne w modelach czystego niedokrwienia. Arytmie mogą utrzymywać się aż do reperfuzji, a czasami serce będzie wymagało defibrylacji. Można to osiągnąć za pomocą stymulatora ustawionego na wyższe napięcia (~10-50 V) oraz elektrod umieszczonych u podstawy i wierzchołka serca.
2. Pozwól sercu na reperfuzję przez 30 minut i w tym czasie wykonaj pomiary przepływu wieńcowego, jeśli to konieczne. Zmierz przepływ wieńcowy, zbierając ścieki za pomocą cylindra z podziałką przez 30-60 sekund.

7. Pobieranie tkanki

1. Opróżnij balon i wyjmij go z lewej komory. Zdejmij serce z kaniuli i zważ je. W początkowych eksperymentach należy pobrać co najmniej jeden poprzeczny wycinek serca i wybarwić TTC w celu oceny martwicy, aby upewnić się, że serce jest wolne od jakichkolwiek martwiczych uszkodzeń.
2. Zbieraj plastry serca do badań mikroskopowych, mokrych/suchych mas itp. Pozostałą część lub całe serce należy szybko zamrozić, umieszczając w ciekłym azocie. Przechowuj zamrożone serca w zamrażarce o temperaturze -80 ºC.
   UWAGA: W celu pomiaru wysokoenergetycznych związków fosforanowych (tj. ATP, fosforanu kreatyny) serca należy natychmiast zamrozić.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia typowe wyniki z jednego eksperymentu na myszach. LVP (linia czerwona), dP/dt (linia zielona) oraz temperatura (linia fioletowa) były rejestrowane w sposób ciągły przez ok. 3 hr. Litery oznaczają: a – pomiar wyjściowy, b, c, d, e – podawanie roztworu kardioplegii, f – początek reperfuzji, g, h, i, j – pomiar przepływu wieńcowego podczas reperfuzji. Należy zwrócić uwagę na obniżenie LVDP i dP/dt po reperfuzji w porównaniu do wartości wyjściowej. Rycina 1B zawiera dane ...

Dyskusja

Powyższy protokół szczegółowo opisuje metody oceny ogłuszenia mięśnia sercowego wtórnego do globalnego niedokrwienia związanego z zatrzymaniem krążenia. W naszych rękach protokół ten powoduje około ~40% zmniejszenie czynności serca (LVDP, +/- dP/dt) przy minimalnych zmianach częstości akcji serca w 30-minutowym punkcie czasowym po reperfuzji. Gdy serce jest reperfaktorowane i ponownie rozgrzewane, wszystkie parametry funkcji serca są zmniejszane w początkowych punktach czasowych ze znacznie zmniejszonym tętnem, zanim ust...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór kardioplegii (św. Tomasz II)			Symbol / Stężenia (mM)
Chlorek			NaCl; 110
Chlorek			KCl; 16
Chlorek			CaCL2; 1,5
Chlorek			MgCL2; 16
Wodorowęglan			NaHCO3; 10
			Krebsa-Heinsleta
Chlorek			sodu NaCl; 118
Chlorek			KCl; 4,8
Siarczan			MgSO4; 1,7
Wodorowęglan sodu	NaHCO3; 24,9
potasu (jednozasadowy)			KH2PO4; 1,2
Chlorek			CaCL2; 1.4
Pirogronian			Na;
2 Glukoza			C6H12O6; 6
Odczynniki
Syrop
Spaghetti
Żel
blok styropianowy
piec laboratoryjny/inkubator ( 50C)
Sprzęt do perfuzji Langendorff Izolowany
perfuzjonowany system serca (IH-SR (Hugo-Sachs) lub równoważny)
System gromadzenia danych (DSI, ADinstruments lub równoważny)
Cyrkulator
Cyrkulator wody chłodzącej Pompa
perfuzyjna o wydajności 2-30 ml / min
Liniowe filtry perfuzyjne - 1 um włókno szklane
Czujniki i wzmacniacze ciśnienia LVP i ciśnienia
Mały cylinder z podziałką (~10 ml)
Mała sonda temperatury i termometr (Werner lub ekwiwalent)
rezysta perfuzyjna (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
bełkotka
95/5 mieszanina
Narzędzia chirurgiczne i odczynniki
Nożyczki
dwa kleszcze
ketamina
ksylazyna
heparyna
mały zacisk z miękkimi bokami do trzymania aorty (tj. zacisk końcowy z klejonymi końcami)
Jedwabne szwy

sodu potasu wapnia magnezu sodu Bufor potasu magnezu Fosforan wapnia sodu do balonówkukurydzianydyspersyjny silikonowy podgrzewanej wodyperfuzyjnegogazowaO2/CO2 chirurgiczne Metzenbaum i PotzDumont rozmiar 5 2-0 i 4-0