Method Article

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka fluorescencyjne, barwniki fluorescencyjne i ogólnie fluorofory zrewolucjonizowały dziedzinę molekularnej biologii komórki. W szczególności odkrycie białek fluorescencyjnych i ich genów umożliwiło inżynierię fuzji białek w celu lokalizacji, analizę aktywacji transkrypcyjnej i translacji białek będących przedmiotem zainteresowania lub ogólne śledzenie pojedynczych komórek i populacji komórek. Zastosowanie fluorescencyjnych genów białkowych w połączeniu z technologią retrowirusową umożliwiło dalszą ekspresję tych białek w komórkach ssaków w stabilny i niezawodny sposób. Pokazano tutaj, w jaki sposób można wykorzystać te geny, aby nadać komórkom w populacji komórek ich własną biosygnaturę. Ponieważ biosygnatura jest uzyskiwana za pomocą technologii retrowirusowej, komórki są oznaczane kodami kreskowymi "na czas nieokreślony". W związku z tym mogą być indywidualnie śledzone w mieszaninie komórek z kodami kreskowymi i wykorzystywane w bardziej złożonych zastosowaniach biologicznych. Śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek jest idealne do zastosowań multipleksowych, takich jak odkrywanie leków przeciwko wielu celom lub profil aktywacji różnych promotorów. Protokół opisuje, jak elegancko rozwijać i amplifikować komórki ssaków z kodami kreskowymi z wyraźnymi genetycznymi markerami fluorescencyjnymi oraz jak używać kilku markerów jednocześnie lub jednego markera o różnej intensywności. Wreszcie, protokół opisuje, w jaki sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane w połączeniu z testami opartymi na komórkach w celu zwiększenia mocy analizy poprzez multipleksowanie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie takie jak spektroskopia fluorescencyjna, mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa, opierają się na fluorescencji, właściwości szeroko wykorzystywanej w zastosowaniach biochemicznych, biomedycznych i chemicznych. Fluorescencja, zarówno wewnętrzna, jak i poprzez znakowanie, została wykorzystana do analizy wzorców i profili ekspresji białek, losu komórek, interakcji białek i funkcji biologicznych1-9 oraz poprzez transfer energii fluorescencji/rezonansu Förstera do wykrywania interakcji biomolekuł i zmian konformacyjnych10-13. Od czasu wyizolowania białka zielonej fluorescencji Aequorea victoria (GFP)14, odkrycie dodatkowych naturalnie występujących białek fluorescencyjnych z innych parzydełkowatych, zwłaszcza koralowców, znacznie zwiększyło liczbę istniejących białek fluorescencyjnych o wyróżniających się widmach wzbudzenia/emisji. To, wraz z wprowadzeniem mutacji w ich genach15-19, jeszcze bardziej rozszerzyło możliwości, uzyskując prawdziwą paletę białek fluorescencyjnych dostępną dla naukowców, którzy wykorzystują w swoich badaniach mikroskopię, cytometrię przepływową i inne technologie oparte na fluorescencji.

Równocześnie, choć niezależnie, rozwój technologii retrowirusowej drastycznie ułatwił stabilną ekspresję ektopowej informacji genetycznej w komórkach ssaków20-23. Nic więc dziwnego, że technologia ta została wykorzystana do przeniesienia genów białek fluorescencyjnych do szerokiej liczby typów komórek i tkanek24-28 lub do produkcji zwierząt transgenicznych29-31. Zgodnie z naturą retrowirusów, informacja genetyczna ektopowego białka fluorescencyjnego jest wprowadzana do genomu komórki32 i komórka staje się fluorescencyjna "na zawsze". Ta właściwość pozwoliła na śledzenie losu komórki lub pojedynczej komórki w populacji komórek. W ten sposób komórka fluorescencyjna uzyskała własną biosygnaturę i może być zdefiniowana jako oznaczona kodem kreskowym. Jego unikalna biosygnatura odróżnia go od innych komórek i, co ważne, odróżnia go od komórek genetycznie zmodyfikowanych w celu ekspresji różnych białek fluorescencyjnych z rozróżnialnymi widmami absorpcyjnymi/emisyjnymi. Zastosowania biologiczne, takie jak śledzenie czynników przeprogramowujących w kierunku pluripotencji33, analiza czynników subjądrowych w celu wyjaśnienia lokalizacji jąder34, budowa fluorescencyjnych plazmidów reporterowych do badań transkrypcyjnych35 lub genetyczne znakowanie neuronów w celu badania architektury sieci neuronalnej36, to tylko cztery z wielu przykładów, w których wykorzystano różne geny białek fluorescencyjnych w tej samej konfiguracji eksperymentalnej.

Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do analizy procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki, takich jak ekspresja genów, cykl komórkowy, apoptoza i sygnalizacja poprzez fosforylację37-43. Stabilna ekspresja genów białek fluorescencyjnych w komórkach ssaków jeszcze bardziej zwiększyła użyteczność cytometrii przepływowej do analizy komórek38,44 i interakcji ligand-receptor45. Zwiększone możliwości pozwoliły, aby cytometria przepływowa stała się szeroko stosowaną metodologią badań przesiewowych o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości46. Pomimo obecnie rozszerzonej liczby fluorometrów i technologii robotycznych, które mogą łączyć systemy czytników płytek, obrazowanie i cytometrię przepływową, wydaje się, że brakuje eksperymentalnych projektów, które mogłyby wykorzystać i dopasować te ulepszone możliwości technologiczne.

Szybkie, niezawodne, proste i solidne metodologie oparte na komórkach są bardzo potrzebne do aplikacji multipleksowanych, które jeszcze bardziej zwiększają wysoką przepustowość. Jest to szczególnie prawdziwe w dziedzinie odkrywania leków, gdzie inżynieria testów komórkowych w formacie multipleksowym może zwiększyć moc wysokoprzepustowych badań przesiewowych39,47-50. Multipleksowanie, ponieważ umożliwia jednoczesne analizy w jednej próbce, dodatkowo zwiększa możliwości w zakresie wysokiej przepustowości51-54. Fluorescencyjne genetyczne kodowanie kreskowe nie tylko pozwala na eleganckie multipleksowanie, ale także, po zaprojektowaniu, pozwala obejść potrzebę czasochłonnych protokołów, zmniejsza koszty związane z przeciwciałami, kulkami i barwnikami39,52,55 i może zmniejszyć liczbę ekranów wymaganych do zastosowań o wysokiej przepustowości. Niedawno opisaliśmy, w jaki sposób technologia retrowirusowa może usprawnić multipleksowanie poprzez fluorescencyjne genetyczne kodowanie kreskowe do zastosowań biologicznych, poprzez ekspresję testu wcześniej opracowanego do monitorowania aktywności proteazy HIV-156,57 z różnymi klinicznie rozpowszechnionymi wariantami58. Metodologia jest wyjaśniona w bardziej opisowy sposób, koncentrując się na tym, jak selekcjonować i amplifikować genetycznie fluorescencyjne komórki z kodami kreskowymi oraz jak wytwarzać panele populacji klonalnych wyrażających odrębne białka fluorescencyjne i/lub różną intensywność fluorescencji. Panele populacji komórek, które można rozróżnić na podstawie ich charakterystyki fluorescencyjnej, zwiększają możliwości multipleksowania, które można dalej wykorzystać w połączeniu z testami komórkowymi, które odpowiadają na różne pytania biologiczne. W protokole opisano również, w jaki sposób zaprojektować panel komórek z kodami kreskowymi zawierającymi jeden z testów opartych na komórkach opracowanych wcześniej w laboratorium, jak na przykładzie59. Protokół ten nie ma zatem na celu pokazania dobrze ugruntowanej technologii retrowirusowej/lentiwirusowej do transferu genetycznego, wartości białek fluorescencyjnych lub zastosowań cytometrii przepływowej60,48, ale raczej pokazanie wzmacniającej mocy połączenia tych trzech elementów w zastosowaniach multipleksowanych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek ssaków, produkcja i transdukcja wirusa do genetycznego kodu kreskowego

  1. Płytka 2,5 x 106 przylegających komórek na 10-centymetrowej płytce (lub około 50-60% zbiegu) na dzień przed transfekcją w zmodyfikowanym podłożu orła Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS). Do produkcji retrowirusowej należy użyć opakowania z wybranej linii komórkowej, takiej jak Phoenix-GP (miły prezent od Gary'ego Nolana z Uniwersytetu Stanforda).
    UWAGA: Linia komórkowa opakowania stabilnie eksprymuje białka Gag i Pol do tworzenia cząstek retrowirusowych w trans. Upewnij się, że komórki są zdrowe i przylegają do płytki w jednej warstwie przed transfekcją.
  2. 24 godziny później przygotuj mieszaninę do transfekcji DNA.
    1. Do 125 μl DMEM bez surowicy dodać 3 μg wektora otoczki wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (pCI-VSVg) i 3 μg wektora transferowego przenoszącego interesujący nas gen białka fluorescencyjnego. Wymieszać i dodać 15 μl polietylenu (2 mg/ml).
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dodawać kroplami do komórek.
      UWAGA: Polietylen dodaje się do jednorodnej mieszaniny DNA jako odczynnik do transfekcji do tworzenia polipleksów. W celu uzyskania cząstek wirusa niosących różne fluorescencyjne markery białkowe, każdą transfekcję należy wykonać niezależnie z wybranym markerem. Pamiętaj, że wektor przeniesienia retrowirusa ma około 7 kb długości i nie może być zapakowany, jeśli przekracza 10 kb.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C. W celu zwiększenia produkcji wirusa umieść płytki w temperaturze 30 °C lub 32 °C.
    UWAGA: 24-godzinną pożywkę po transfekcji można zastąpić 7 ml świeżej pożywki i chociaż może to poprawić zdrowie komórek, może zmniejszyć miano wirusa w supernatancie.
  4. 48 godzin po transfekcji zebrać cząstki wirusa zawierające supernatant i przefiltrować za pomocą filtra politetrafluoroetylenowego 0,45 μM. Do transdukcji należy użyć świeżo pobranego supernatantu wirusowego. W przeciwnym razie utrzymać supernatant w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C i unikać zamrażania i rozmrażania. Pamiętaj, że miano wirusa zmniejszy się prawdopodobnie nawet o 50% z każdym cyklem zamrażania i rozmrażania.
  5. Wybrana linia komórek płytki 24 godziny przed transdukcją, jeśli przylega, lub bezpośrednio przed transdukcją, jeśli nie przylega. Zasiew 2,0 x 105 do 3,0 x 105 przylegających komórek (tutaj Huh 7.5.1 i HEK 293T) lub 5,0 x 105 do 1 x 106 nieprzylegających komórek (tutaj SupT1) na studzienkę w płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: Upewnij się, że skalibrowałeś liczbę komórek, które mają zostać zasiane przed transdukcją, szczególnie w przypadku komórek przylegających, tak aby komórki osiągnęły konfluencję około 60% w momencie transdukcji.
  6. Dodać 5 μg/ml polibrenu (bromek heksadimetrenu) do wysianych komórek, a następnie dodać wcześniej zebrany supernatant wirusowy, aby uzyskać około 20-40% infekcji (tutaj 2 ml).
    UWAGA: MOI lub procent infekcji jest w większości arbitralny, ponieważ sortowanie pozwoli na amplifikację dowolnej subpopulacji komórek. Oczywiście wyższy wskaźnik infekcji łagodzi i przyspiesza proces amplifikacji.
  7. Transdukować komórki przez odwirowanie w wiszącym wirniku kubełkowym o masie 1 500 x g przez 120 minut w temperaturze 32 °C. Przed inkubacją zawiesić nieprzylegające komórki świeżą pożywką. W przypadku komórek przylegających należy zastąpić świeżą pożywką 24 godziny po transdukcji.
    UWAGA: Zaleca się uszczelnienie płytek przed odwirowaniem parafilmem, aby uniknąć rozlania. Aby zwiększyć genetycznie kodowaną różnorodność komórek, należy przeprowadzić transdukcję komórek z cząsteczkami wirusa przenoszącymi różne białka fluorescencyjne (uzyskane z kroku 1.4). Wybierając markery fluorescencyjne, należy upewnić się, że są one kompatybilne z oprzyrządowaniem i mają wyraźne parametry fluorescencyjne.

2. Selekcja i amplifikacja genetycznie oznaczonych kodami kreskowymi komórek

  1. Analizuj transdukowane komórki ssaków za pomocą cytometrii przepływowej co najmniej 72 godziny po transdukcji, aby określić ilościowo procentową szybkość transdukcji. Użyj porównywalnej nietransdukowanej linii komórkowej jako kontroli ujemnej.
    UWAGA: Ponieważ sortowanie będzie stosowane do oczyszczania pojedynczych populacji komórek z kodami kreskowymi, wysoki procentowy wskaźnik początkowej transdukcji, choć nie jest konieczny, powinien przyspieszyć proces amplifikacji.
  2. Wykorzystaj wybrany sorter komórek, aby uzyskać komórki, które wyrażają interesujące Cię białko.
    1. W tym celu upewnij się, że bramki są prawidłowo ustawione we właściwych kanałach.
      1. W tym celu należy użyć tej samej naiwnej linii komórkowej jako kontroli ujemnej i ustawić parametr/napięcie kanału tak, aby populacja ujemna była poniżej wartości 10:3 na każdej osi fluorescencji. Określ bramkowanie dla dodatniej fluorescencji jako zdarzenia, które pojawiają się powyżej kontroli negatywnej dla każdego kanału fluorescencyjnego.
    2. Należy pamiętać, że każdy instrument może się różnić, a prawidłowe napięcie do określania bramkowania powinno być odpowiednio dostosowane, co sprawia, że kontrole dodatnie i ujemne są niezbędne w każdej konfiguracji eksperymentalnej.
      1. Do detekcji fluorescencji w tym eksperymentalnym układzie należy użyć kanału FITC (filtr pasmowoprzepustowy 530/30 poprzedzony filtrem długoprzepustowym 502) dla eGFP, kanał PE (filtr pasmowo-przepustowy 585/42 poprzedzony filtrem długoprzepustowym 556) dla td Tomato i kanał APC (filtr pasmowo-przepustowy 660/20) dla E2 Crimson.
        UWAGA: Laser o długości fali 488 nm wzbudza eGFP i td Tomato, podczas gdy E2 Crimson jest wzbudzany przez laser o długości fali 633 nm.
  3. Sortować do stożkowych tubek o pojemności 15 ml z 1 ml 100% FCS.
    UWAGA: Proces sortowania populacji komórek fluorescencyjnych nie jest obowiązkowy, ponieważ można bezpośrednio przejść do rodzaju poszczególnych klonów (patrz poniżej). Sortowanie ścisłych populacji na podstawie wybranej fluorescencji zapewnia populację zapasową dla przyszłej selekcji poszczególnych klonów. Należy pamiętać, że pojedyncze komórki są czasami trudne do wyhodowania, podczas gdy dużą populację komórek można łatwo zamrozić, a następnie rozmrozić i amplifikować na późniejszym etapie.
  4. Odwirować posortowane populacje w wiszącej wirówce kubełkowej z wirnikiem o masie 524 g w temperaturze 32 °C przez 5 minut, aby osadzać komórki. Ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki i ponownie ułożyć komórki tak, aby zlewność komórek była poniżej 60%, aby umożliwić wzrost i podział przez co najmniej dwa dni.
    1. Na przykład, komórki przylegające do płytki w około 3 x 105 komórek w 2 ml pożywki na basenie na płytce 6-dołkowej i 2 x 106 komórek w 2 ml pożywki na płytce 6 cm. Użyj DMEM dla komórek przylegających i RPMI dla komórek nieprzylegających (lub dowolnego określonego podłoża, jeśli jest to wymagane). Umieścić posiane komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na kilka dni, aby umożliwić amplifikację.

3. Uzyskaj populacje klonalne genetycznie oznaczonych kodów kreskowych komórek o różnej intensywności

  1. Uzyskać populacje klonalne z komórek pierwotnie transdukowanych (krok 1.7) lub z posortowanej populacji (krok 2.3).
    UWAGA: Zapewni to równy lub podobny poziom ekspresji białek fluorescencyjnych wśród wszystkich komórek w populacji (ciasna populacja z małym CV w średniej intensywności fluorescencji do 40%).
    1. W tym celu należy posortować pojedyncze komórki na 96-dołkowe płytki za pomocą automatycznej jednostki osadzania komórek (ACDU). Ustaw bramki do sortowania według interesujących populacji. Upewnij się, że bramki są oddalone od siebie o co najmniej jedną skalę logarytmiczną, aby uzyskać rozróżnialne populacje podczas wyboru komórek o różnej intensywności fluorescencji. Do przedstawionej tutaj procedury należy użyć tego samego zestawu eksperymentalnego cytometrii przepływowej, który opisano w kroku 2.2.
  2. Namnażać poszczególne klony w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 tygodnie. W procesie amplifikacji przeanalizuj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że rosnące populacje powstają z pojedynczych komórek, a nie z więcej niż jednej.
    UWAGA: Pamiętaj, że sorter umieści średnio jedną komórkę na studzienkę i podczas gdy niektóre studzienki mogą w ogóle nie mieć żadnej komórki, inne mogą mieć więcej niż jedną.
    1. Aby mieć pewność, że populacja powstanie tylko z jednej komórki, należy bardzo delikatnie obchodzić się z płytką i nigdy nie naruszać studzienek przez pipetowanie. Obserwuj płytkę, dobrze po klęsce, pod mikroskopem.
      UWAGA: Chociaż poszczególne komórki mogą być czasami trudne do zidentyfikowania, gdy zaczną się dzielić, będą łatwo rozpoznawalne.
    2. Należy pamiętać, że często komórki "zbijają się" wzdłuż krawędzi. Odrzuć te studnie, w których można zaobserwować wiele populacji klonalnych i zachowaj te, które mają jedną ciasną populację.
      UWAGA: Zaleca się przeniesienie ich na większe płytki w celu wzmocnienia.
  3. Badanie przesiewowe przypuszczalnych populacji klonów, analizując je za pomocą cytometrii przepływowej. Porównaj je z kontrolą ujemną wykorzystującą tę samą konfigurację eksperymentalną cytometrii przepływowej.
    1. Przeanalizuj tylko procent próbki, a resztę zachowaj jako kopię zapasową. Wybierz najbardziej wyraźnie oddzielone populacje na podstawie średniej intensywności i ciasnoty populacji. Wzmocnij je w razie potrzeby lub zamroź zapasy w pożywce do zamrażania z 20% glicerolem w temperaturze -80 °C przez krótki czas lub ciekłym azotem przez dłuższy czas.
      UWAGA: Pamiętaj, że "prawdziwa" populacja klonów powinna mieć bardzo ścisły wzór fluorescencji.

4. Zapewnienie możliwości multipleksowania dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS)

  1. Połącz tyle odrębnych populacji klonów, ile potrzeba, które można dalej wykorzystać w formacie multipleksowanym. Wybierz klony o rozróżnialnych widmach absorpcyjnych/emisyjnych i/lub różnej intensywności. Jeśli używana jest płytka 96-dołkowa, która jest odpowiednia dla HTS, wysiewaj 50 000 komórek w 200 μl na studzienkę.
    UWAGA: Należy pamiętać, że liczba komórek jest tylko szacunkowa i może się zmieniać w zależności od typu komórki i tego, czy jest ona przylegająca, czy nie.
  2. Przeanalizować próbkę za pomocą cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że każda z niezależnych ustalonych fluorescencyjnych linii komórkowych może być od siebie odróżniona. Przed analizą przygotuj kontrole negatywnego i pojedynczego koloru, aby ustawić parametry i wartości kompensacji.
    UWAGA: Ustawienie parametrów w celu wyraźnego rozróżnienia mieszanych populacji umożliwi ich dalsze wykorzystanie w formacie multipleksowanym.

5. Dostosuj genetycznie kodowane kreskowo linie komórkowe do wybranego zastosowania biologicznego

  1. Transduce ustalił genetycznie oznaczone linie komórkowe z kodami kreskowymi z cząstkami wirusa, które zawierają wybrane elementy testu, jak opisano tutaj w Stolp et al., 201359. Pamiętaj, że wybrany test powinien zajmować dodatkowy i możliwy do wyróżnienia kanał fluorescencyjny i tym samym ma być przenoszony do odpowiedniej linii komórkowej z kodem kreskowym.
    UWAGA: Każda linia komórkowa z kodem kreskowym może być poddana innemu testowi.
  2. Sortuj genetycznie fluorescencyjne komórki z kodami kreskowymi pod kątem tych, które zawierają elementy testu.
    UWAGA: Elementy testowe mogą być sprzężone ze znacznikiem lub białkiem fluorescencyjnym (jako fuzja lub przez wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu) w celu łatwego wykrywania za pomocą western blotting, cytometrii przepływowej lub mikroskopii. System wykorzystany w tym protokole opiera się na samej ekspresji powierzchni epitopu HA lub z dodatkową ekspresją epitopu FLAG.
    1. Zabarwić populacje klonów zawierające test przeciwciałami sprzężonymi fluorescencyjnie HA i APC. Następnie przeanalizuj populacje klonów za pomocą barwienia przeciwciałami sprzężonymi z anty-FLAG i FITC.
    2. Aby prześledzić przebieg testu, przeanalizuj lub "odkoduj" populacje w odpowiednim kanale, w którym można rozróżnić odrębne genetycznie oznaczone liniami komórkowymi oznaczonymi kodami kreskowymi. W tym miejscu odkoduj charakter podłoża, analizując w kanale PE w celu wykrycia td Tomato.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowanie fluorescencyjnych komórek z kodami genetycznymi do celów biologicznych może być osiągnięte tylko po wygenerowaniu indywidualnych populacji klonów. Multipleksowanie jest najskuteczniejsze, gdy populacje z kodami kreskowymi mają wyraźne, wyraźne charakterystyki fluorescencyjne z minimalnym nakładaniem się widma. Przykład pokazany na rysunku 1 z klonalnymi populacjami komórek SupT1 ssaków ilustruje, że komórki z kodem kreskowym z mCherry i cyjanofluorescencyjnym białkiem (CFP) mogą być łatw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przypadku połączono dwie dobrze ugruntowane procedury; inżynieria genetyczna poprzez technologię retrowirusową i wykrywanie białek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej. Genetyczne kodowanie kreskowe oparte na białkach fluorescencyjnych do produkcji unikalnych linii komórkowych zapewnia solidny i prosty sposób na zastosowania multipleksowe. Generowanie genetycznie modyfikowanych komórek z kodami kreskowymi za pomocą technologii retrowirusowej jest początkowo długotrwałym procesem, ale pozwala uzyskać,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować dr Garry'emu Nolanowi z Uniwersytetu Stanforda za dostarczenie linii komórkowej do pakowania Phoenix GP do produkcji cząsteczek retrowirusowych. Dziękujemy dr Rogerowi Tsienowi z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego za dostarczenie td Tomato. Chcielibyśmy również podziękować San Diego State University Flow Cytometry Core Facility za ich służbę i pomoc.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawki 10 mlBD309604służy do filtrowania wirusa
0,45 &mikro; m ployfiltr tetrafluoroetylenowyPall Corporation4219używany do filtrowania wirusa
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304dla komórek HEK 293T
PEI (polietylenimin)poly sciences23966-2Stężenie 2 mg / ml
używane Wirówka wisząca kubełkowa (chłodzona)Eppendorf5805 000.017używana do zakażenie spinowe
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning21-040-CVstosowany do mycia komórek
Polybrene (bromek heksadimethreenu)Sigma-Aldrich107689Stosowany w celu zwiększenia skuteczności infekcji wirusowych. Używany przy 5 &mikro; stężenie g/ml.
FACSAriaBD Instrument do nauk biologicznychużywany do sortowania populacji komórek
Przyrząd FACSCantoBD Biosciencesużywany do analizy komórek
Phoenix-GPPrezent od Gary'ego NolanaLinia komórkowa używana do produkcji cząstek retrowirusowych
Surowica cielęca płoduMediatechMT35015CVużywana do wzrostu i sortowania
komórek SupT1ATCCCRL-1942Ludzkie limfoblasty T
Komórki HEK 293TATCCCRL-11268Ludzkie embrionalne komórki nerkowe, które zawierają również duży antygen T SV40
RPMI 1640Pożywka do wzrostu komórek Corning10-040-CV
Pożywka do wzrostu komórek dla komórek SupT1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015(2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940(2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835(2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles