Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Summary

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Abstract

Białka fluorescencyjne, barwniki fluorescencyjne i ogólnie fluorofory zrewolucjonizowały dziedzinę molekularnej biologii komórki. W szczególności odkrycie białek fluorescencyjnych i ich genów umożliwiło inżynierię fuzji białek w celu lokalizacji, analizę aktywacji transkrypcyjnej i translacji białek będących przedmiotem zainteresowania lub ogólne śledzenie pojedynczych komórek i populacji komórek. Zastosowanie fluorescencyjnych genów białkowych w połączeniu z technologią retrowirusową umożliwiło dalszą ekspresję tych białek w komórkach ssaków w stabilny i niezawodny sposób. Pokazano tutaj, w jaki sposób można wykorzystać te geny, aby nadać komórkom w populacji komórek ich własną biosygnaturę. Ponieważ biosygnatura jest uzyskiwana za pomocą technologii retrowirusowej, komórki są oznaczane kodami kreskowymi "na czas nieokreślony". W związku z tym mogą być indywidualnie śledzone w mieszaninie komórek z kodami kreskowymi i wykorzystywane w bardziej złożonych zastosowaniach biologicznych. Śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek jest idealne do zastosowań multipleksowych, takich jak odkrywanie leków przeciwko wielu celom lub profil aktywacji różnych promotorów. Protokół opisuje, jak elegancko rozwijać i amplifikować komórki ssaków z kodami kreskowymi z wyraźnymi genetycznymi markerami fluorescencyjnymi oraz jak używać kilku markerów jednocześnie lub jednego markera o różnej intensywności. Wreszcie, protokół opisuje, w jaki sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane w połączeniu z testami opartymi na komórkach w celu zwiększenia mocy analizy poprzez multipleksowanie.

Introduction

Technologie takie jak spektroskopia fluorescencyjna, mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa, opierają się na fluorescencji, właściwości szeroko wykorzystywanej w zastosowaniach biochemicznych, biomedycznych i chemicznych. Fluorescencja, zarówno wewnętrzna, jak i poprzez znakowanie, została wykorzystana do analizy wzorców i profili ekspresji białek, losu komórek, interakcji białek i funkcji biologicznych^1-9 oraz poprzez transfer energii fluorescencji/rezonansu Förstera do wykrywania interakcji biomolekuł i zmian konformacyjnych^10-13. Od czasu wyizolowania białka zielonej fluorescencji Aequorea victoria (GFP)¹⁴, od....

Protocol

1. Przygotowanie komórek ssaków, produkcja i transdukcja wirusa do genetycznego kodu kreskowego

1. Płytka 2,5 x 10⁶ przylegających komórek na 10-centymetrowej płytce (lub około 50-60% zbiegu) na dzień przed transfekcją w zmodyfikowanym podłożu orła Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS). Do produkcji retrowirusowej należy użyć opakowania z wybranej linii komórkowej, takiej jak Phoenix-GP (miły prezent od Gary'ego Nolana z Uniwersytetu Stanforda).
   UWAGA: Linia komórkowa opakowania stabilnie eksprymuje białka Gag i Pol do tworzenia cząstek retrowirusowych w trans. Upewnij się, że komórki są zdrowe i przylegają do płytki ....

Results

Multipleksowanie fluorescencyjnych komórek z kodami genetycznymi do celów biologicznych może być osiągnięte tylko po wygenerowaniu indywidualnych populacji klonów. Multipleksowanie jest najskuteczniejsze, gdy populacje z kodami kreskowymi mają wyraźne, wyraźne charakterystyki fluorescencyjne z minimalnym nakładaniem się widma. Przykład pokazany na rysunku 1 z klonalnymi populacjami komórek SupT1 ssaków ilustruje, że komórki z kodem kreskowym z mCherry i cyjanofluorescencyjnym białkiem (CFP) mogą być łatw.......

Discussion

W tym przypadku połączono dwie dobrze ugruntowane procedury; inżynieria genetyczna poprzez technologię retrowirusową i wykrywanie białek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej. Genetyczne kodowanie kreskowe oparte na białkach fluorescencyjnych do produkcji unikalnych linii komórkowych zapewnia solidny i prosty sposób na zastosowania multipleksowe. Generowanie genetycznie modyfikowanych komórek z kodami kreskowymi za pomocą technologii retrowirusowej jest początkowo długotrwałym procesem, ale pozwala uzyskać,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawki 10 ml	BD	309604	służy do filtrowania wirusa
0,45 &mikro; m ployfiltr tetrafluoroetylenowy	Pall Corporation	4219	używany do filtrowania wirusa
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	dla komórek HEK 293T
PEI (polietylenimin)	poly sciences	23966-2	Stężenie 2 mg / ml
używane Wirówka wisząca kubełkowa (chłodzona)	Eppendorf	5805 000.017	używana do zakażenie spinowe
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Corning	21-040-CV	stosowany do mycia komórek
Polybrene (bromek heksadimethreenu)	Sigma-Aldrich	107689	Stosowany w celu zwiększenia skuteczności infekcji wirusowych. Używany przy 5 &mikro; stężenie g/ml.
FACSAria	BD Instrument do nauk biologicznych		używany do sortowania populacji komórek
Przyrząd FACSCanto	BD Biosciences		używany do analizy komórek
Phoenix-GP	Prezent od Gary'ego Nolana		Linia komórkowa używana do produkcji cząstek retrowirusowych
Surowica cielęca płodu	Mediatech	MT35015CV	używana do wzrostu i sortowania
komórek SupT1	ATCC	CRL-1942	Ludzkie limfoblasty T
Komórki HEK 293T	ATCC	CRL-11268	Ludzkie embrionalne komórki nerkowe, które zawierają również duży antygen T SV40
RPMI 1640	Pożywka do wzrostu komórek Corning		10-040-CV