Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Podsumowanie

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na⁺/H⁺ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Streszczenie

Zakwaszenie endosomalne jest kluczowe dla szerokiego zakresu procesów, takich jak recykling i degradacja białek, desensytyzacja receptorów i ładowanie neuroprzekaźników w pęcherzykach synaptycznych. Opisuje się, że w tym zakwaszeniu pośredniczą ATPazy protonowe, sprzężone z transporterami chlorków ClC. Wysoce konserwatywne transportery protonów elektroneutralnych, wymienniki Na⁺/H⁺ (NHE) 6, 7 i 9 są również wyrażane w tych przedziałach. Mutacje w ich genach zostały powiązane z ludzkimi chorobami poznawczymi i neurodegeneracyjnymi. Paradoksalnie, ich rola pozostaje nieuchwytna, ponieważ ich wewnątrzkomórkowa lokalizacja uniemożliwiła szczegółową charakterystykę funkcjonalną. Niniejszy manuskrypt przedstawia metodę rozwiązania tego problemu. Polega to na selekcji zmutowanych linii komórkowych, zdolnych do przetrwania ostrego zakwaszenia cytozolowego poprzez zatrzymanie wewnątrzkomórkowych NHE w błonie plazmatycznej. Następnie przedstawiono dwa uzupełniające się protokoły pomiaru selektywności jonowej i aktywności tych wymienników: (i) jeden oparty na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii wideo oraz (ii) jeden oparty na szybkiej kinetyce wychwytu litu. Takie protokoły można ekstrapolować w celu pomiaru innych transporterów nieelektrogenicznych. Co więcej, przedstawiona tutaj procedura selekcji generuje komórki z fenotypem z wadą retencji wewnątrzkomórkowej. Dlatego komórki te będą również wyrażać inne białka błony pęcherzykowej na błonie plazmatycznej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna może zatem stanowić potencjalnie potężne narzędzie do badania innych białek wewnątrzkomórkowych, które będą następnie ulegać ekspresji w błonie komórkowej wraz z pęcherzykowymi wymiennikami Na⁺/H⁺ użytymi do selekcji.

Wprowadzenie

Większość przedziałów wewnątrzkomórkowych ma kwaśne pH światła, które jest kluczowym parametrem dla dojrzewania, transportu, recyklingu białek lub hormonów i ładowania neuroprzekaźników. Wykazano, że gradient pH między cytozolem a zawartością pęcherzykową jest generowany przez wakuolarne ATPazy H^{+ 1}, sprzężone z pęcherzykowymi transporterami chlorku ClC². Zarówno u myszy z nokautem (KO), jak i u ludzi, znaczenie tych transporterów zostało podkreślone przez ciężkie fenotypy spowodowane mutacjami w ich genach^3-6.

Wykazano, że członkowie rodziny wymienników sodowo-wodorowych SLC9A, nazywanych również NHE dla wymienników Na⁺/H⁺, są kluczowymi efektorami w wewnątrzkomórkowej regulacji pH i objętości komórek, a także w wektorowym transporcie równoważników kwasowo-zasadowych przez nabłonek. Oprócz NHE błony komórkowej, trzy wysoce konserwatywne wymienniki Na⁺/H⁺, NHE 6, 7 i 9 ulegają ekspresji w sieci trans-Golgiego i we wczesnych endosomach⁷. Mutacje w ich genach zostały powiązane z zespołami Angelmana lub Christiansona^8-9, autyzmem rodzinnym¹⁰ i zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi^11-12. Wymienniki te były również zaangażowane w problemy neurodegeneracyjne, takie jak podatność na chorobę Alzheimera¹³ i zespoły sąsiadujących genów upośledzenia umysłowego sprzężonego z chromosomem X¹⁴. Podsumowując, badania te podkreślają znaczenie tych wewnątrzkomórkowych NHE w rozwoju i/lub funkcjonowaniu mózgu.

Wewnątrzkomórkowa lokalizacja tych wymienników uniemożliwia dokładne pomiary ich selektywności jonowej, kierunku transportu, parametrów kinetycznych i regulacji. Podobnie jak w przypadku wszystkich transporterów ulegających ekspresji w przedziałach wewnątrzkomórkowych, niezwykle trudno jest ocenić ich aktywność biochemiczną, a tym samym w pełni zrozumieć ich role fizjologiczne i mechanizmy leżące u podstaw ich patologicznych implikacji. Opierając się na wysokim stężeniu cytozolowego K⁺, najpowszechniej akceptowaną hipotezą było to, że działały one jako transportery wypływu protonów sprzężonych z K⁺. Wysunięto hipotezę o istnieniu takiego wycieku protonów, ponieważ może on równoważyć pompowanie protonów przez V-ATPazy w celu utrzymania pH pęcherzyków w stanie ustalonym. Celem tego artykułu wizualnego jest (i) zademonstrowanie metody pozwalającej na selekcję genetyczną linii komórkowych, które wyrażają takie transportery pęcherzykowe na ich błonie plazmatycznej, oraz (ii) pokazanie dwóch niezależnych podejść do pomiaru funkcji tych transporterów.

Trzy dekady temu, Pouysségur i Franchi zapoczątkowali podejście genetyczne, które umożliwiło klonowanie molekularne i charakterystykę członków rodziny NHE¹⁵. Opierało się to na toksyczności protonów wewnątrzkomórkowych jako metody przesiewowej. Pierwszym krokiem było uzyskanie linii komórkowych z niedoborem jakiejkolwiek wymiany Na⁺/H⁺ ulegającej ekspresji w błonie plazmatycznej, z wykorzystaniem odwracalności tego transportera. Fibroblasty (linia komórkowa CCL39) zostały wstępnie załadowane Na⁺ lub Li⁺, a następnie umieszczone w kwaśnym środowisku zewnątrzkomórkowym (pH 6,5) na 2 godziny. Doprowadziło to do śmierci komórek wykazujących ekspresję funkcjonalnej wymiany Na⁺/H⁺ oraz do selekcji komórek z niedoborem antyportera (linia komórkowa PS120)¹⁶. Hodowane w podłożu wolnym od wodorowęglanów komórki te są bardzo wrażliwe na ostre zakwaszenie wewnątrzkomórkowe. W związku z tym ekspresja jakiegokolwiek funkcjonalnego mechanizmu wypływu protonów na błonie plazmatycznej będzie pozytywnie wybrana (patrz¹⁷), jeśli takie komórki zostaną poddane ostremu zakwaszeniu wewnątrzkomórkowemu. Takie techniki zakwaszania mogą być stosowane do izolowania linii komórkowych z defektami transportu, umożliwiającymi wymuszoną ekspresję wewnątrzkomórkowych NHE WT w błonie komórkowej

.

Ponieważ eukariotyczne wymienniki Na⁺/H⁺ są elektroneutralne, nie można ich zmierzyć za pomocą metod elektrofizjologicznych, które były stosowane z dużym powodzeniem do pomiaru kanałów. W związku z tym w niniejszym manuskrypcie pokazano, w jaki sposób można zmierzyć aktywność tego wymiennika za pomocą wewnątrzkomórkowych pomiarów pH i szybkiej kinetyki wychwytu litu. Ponieważ podstawowe koncepcje są takie same, warto zauważyć, że wiele procesów opracowanych dla sekcji wyboru jest również wykorzystywanych bezpośrednio do pomiarów funkcjonalnych.

Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że defekt transportu obecny w liniach komórkowych wybranych za pomocą podejścia opisanego w tym manuskrypcie prowadzi do większej ekspresji innych białek pęcherzykowych na błonie plazmatycznej, takich jak pęcherzykowy kanał potasowy TWIK1¹⁸. Wskazuje to na wybór ogólnego mechanizmu defektu retencji dla pęcherzykowych białek transbłonowych. W związku z tym ta procedura selekcji i generowane przez nią komórki mogą stanowić obiecujące narzędzie dla społeczności naukowej zajmującej się białkami błonowymi przedziałów wewnątrzkomórkowych. Przedstawione tu techniki pomiarowe mogą mieć również zastosowanie do badania innych transporterów nieelektrogenicznych.

Protokół

1. Wybór zabijania H⁺

1. Linie komórkowe
   1. Stabilnie transfekowane komórki z niedoborem NHE (np. linia komórkowa¹⁶ PS120 pochodząca z CCL39) przy użyciu dowolnej kombinacji wektora ekspresji ssaków i metody transfekcji, która zapewni wydajną wydajność transfekcji i selekcję w linii komórkowej fibroblastów.
      UWAGA: Przez wiele lat stosowano wytrącanie fosforanu wapnia¹⁹ z dobrą wydajnością transfekcji. Został on ostatnio zastąpiony przez komercyjne odczynniki, takie jak Lipofectamine2000, przy czym transfekcje są wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Rozwiązania
   1. Przygotuj trzy sterylne roztwory opisane poniżej. Wysterylizuj te roztwory przez filtrację (0,22 μm).
      1. Przygotować roztwór nasycający NH₄⁺ (pH 7,4) składający się z 50 mM NH₄Cl, 70 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM MOPS o pH 7,4.
      2. Przygotować roztwór do płukania (pH 7,0) składający się ze 120 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES o pH 7,0.
      3. Przygotować roztwór odzysku (pH 7,4) składający się ze 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7.4.
3. Przed rozpoczęciem selekcji należy zaopatrzyć się w inkubator do hodowli komórkowych, który może być używany w temperaturze 37 °C bez dodatkowego CO₂ z zewnętrznego zbiornika (określany jako inkubator "wolny od_CO2"), ponieważ 5% CO₂ spowoduje buforowanie, które może pogorszyć zakwaszenie. Amplifikuj linię komórkową wyrażającą NHE zainteresowania do około 2 x 10⁸ komórek (zwykle około 20 zlewających się płytek o średnicy 100 mm).
4. Procedura uśmiercania H⁺:
   1. Inkubować komórki wykazujące ekspresję wewnątrzkomórkowego NHE będącego przedmiotem zainteresowania przez 1 godzinę w roztworze ładującym, w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO₂ .
   2. Zassać roztwór nasycający, a następnie przepłukać je dwukrotnie w opisanym powyżej roztworze do płukania. Wykonaj ten krok skutecznie, aby wyeliminować resztki zewnątrzkomórkowego NH₄Cl, które utrudniałyby tworzenie stromego gradientu NH₄ ⁺, który spowoduje zakwaszenie.
   3. Usunąć pożywkę płuczącą przez aspirację i inkubować komórki przez godzinę w roztworze regeneracyjnym w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO₂ .
   4. Zastąp pożywkę odzysku zwykłą pożywką hodowlaną (zwykle DMEM z 7,5% FCS) i hoduj komórki w standardowych warunkach hodowli (37 °C w wilgotnej atmosferze o zawartości 5% CO₂ i 95 % powietrza).
5. Powtarzaj ten cykl selekcji dwa razy w tygodniu, aż pojawią się stabilne klony.
   UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na hodowlę komórkową i warunki selekcji. Miesiące pracy mogą zostać zniweczone przez wszelkie zanieczyszczenia, które są bardziej podatne na wystąpienie po długim okresie hodowli i powtarzających się manipulacjach komórkami.
   1. W tym miejscu należy wybrać, czy chcesz amplifikować klony i charakteryzować je indywidualnie, jak opisano w sekcjach 2-3, czy też połączyć je razem, aby wygenerować populację komórkową przed charakteryzacją.
6. Stosuj okazjonalną selekcję (mniej więcej raz na dwa tygodnie), aby zachować komórki odporne na zakwaszenie, przeciwselekcjonując te, które mogły powrócić do rodzicielskiego fenotypu wrażliwego na kwas (Figura 1B).

2. Wewnątrzkomórkowe pomiary pH

2.1) Obrazowanie pH metodą fluorescencji

1. Należy użyć ratiometrycznego barwnika fluorescencyjnego BCECF / AM wrażliwego na pH, który jest wrażliwy na pH po wzbudzeniu przy 490 nm i ma punkt izobestowy 445 nm, zgodnie z protokołami producenta.
   1. Alternatywnie można użyć innych sond wrażliwych na pH, zgodnie z protokołami producenta.
2. Użyj zestawu do obrazowania składającego się z odwróconego mikroskopu sprzężonego z kamerą wideo o wysokiej czułości. Wyposaż ten zestaw w wąskopasmowe filtry interferencyjne 450 nm i 490 nm w połączeniu z odpowiednimi kwarcowymi filtrami o neutralnej gęstości do wzbudzenia.
   1. Jeśli to możliwe, należy użyć odpowiedniego zestawu filtrów i warunków oświetlenia, aby ustawić porównywalne wartości fluorescencji dla λ1 i λ2, tak aby stosunek zbliżył się do 1. Należy również unikać podstawowych wartości fluorescencji, które są albo nasycone, albo zbyt niskie, zarówno dla λ1, jak i λ2. Może to przynieść ważne artefakty, ponieważ wtedy stosunek może nie być wykrywalny, chociaż zmienia się pH wewnątrzkomórkowe.
      UWAGA: System ten musi umożliwiać szybką perfuzję, wzbudzenie poklatkowe na dwóch wyżej wymienionych długościach fal oraz akwizycję na odpowiedniej długości fali emisyjnej (535 nm dla BCECF). Wyposaż system w oprogramowanie umożliwiające automatyczną akwizycję i przechowywanie danych.

2.2) Pomiar aktywności NHE do przodu (wytłaczanie protonów z cytozolu)

1. Zakwasić komórki przez 1-godzinną inkubację w roztworze ładującym NH₄⁺ (patrz krok 1.4) pod nieobecność CO₂ .
2. Dodaj BCECF-AM (stężenie końcowe 5 μM) do roztworu przez ostatnie pięć minut, a następnie przepłucz go roztworem ładującym NH₄⁺, aby wyeliminować sondę zewnątrzkomórkową.
3. Zamontuj komórki na mikroskopie i zrób kilka zdjęć, aby zarejestrować stabilną linię bazową. Ukrwić roztwór do płukania (patrz wyżej). Powoduje to spadek fluorescencji odpowiadający zakwaszeniu.
4. Po ustabilizowaniu pH należy przeprowadzić perfuzję dowolnego z poniższych roztworów, aby zmierzyć wskaźniki odzyskiwania pH, w których pośredniczy wymiana Li⁺/H⁺, Na⁺/H⁺ lub K⁺/H⁺. Każde rozwiązanie zawiera kation sprzęgający potencjał, który ma być testowany pod kątem wymiany H⁺. Jeśli jeden z nich zostanie przetransportowany, spowoduje to wzrost fluorescencji przy 495 nm, co będzie odpowiadało wzrostowi wewnątrzkomórkowego pH:
   120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4
   120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4
   125 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4

2.3) Pomiar odwróconej aktywności NHE

UWAGA: Zasada polega na odwróceniu transbłonowych gradientów jonowych.

1. Przed pomiarem załaduj komórki interesującym je kationem wewnątrzkomórkowym (patrz poniżej).
2. Inkubować je przez 5 minut za pomocą BCECF/AM (patrz krok 2.2.2); opłukać je i zamontować na mikroskopie wideo.
3. Wykonaj fuzję roztworu ładującego i zrób kilka zdjęć, aby zarejestrować stabilną linię bazową.
4. Po ustabilizowaniu linii podstawowej zobrazuj zmiany pH, gdy komórki są perfundowane zewnątrzkomórkowym środowiskiem kwaśnym zawierającym 120 mM chlorku choliny, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM MES przy pH 6,5.
5. W celu obciążenia LiCl inkubuj komórki przez 2 godziny w roztworze złożonym ze 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4. Wewnątrzkomórkowy lit mierzony za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej daje wartość około 60 mM.
6. W przypadku obciążenia Na⁺ inkubować komórki przez dwie godziny w roztworze złożonym ze 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 15 mM HEPES przy pH 7,4 w obecności 1 mM ouabainy w celu zablokowania ATPazy Na/K. W tych warunkach wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺ mieści się w zakresie 40 mM.
   UWAGA: Obciążenie K⁺ nie jest konieczne, ponieważ stężenie cytozolowego K⁺ mieści się w zakresie 140 mM, a zatem gradient K+ skierowany na zewnątrz jest łatwy do osiągnięcia.

2.4) Przetwarzanie i kalibracja danych:

UWAGA: Ten krok dotyczy zarówno pomiarów do przodu, jak i do tyłu.

1. Pod koniec każdego eksperymentu perfekcja komórek roztworem 140 mM KCl, 20 mM HEPES i 5 μM nigerycyny dostosowana do wartości pH między 6,5 a 7,4.
2. Zbierz dane jako pomiary fluorescencji z obrazów (poziomy szarości reprezentują poziomy intensywności) i wyeksportuj w formacie tekstowym i potraktuj jak wyjaśniono poniżej za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego.
3. Oblicz wewnątrzkomórkowe wartości pH dla każdej pojedynczej komórki lub obszaru zainteresowania, korzystając z następującego równania:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin)/(R_max-R))x F_min(λ2)/F_max(λ2)
4. Użyj stosunku F_min(λ2)/F_max(λ2), jeśli występuje bielenie lub wyciek sondy, co powoduje spadek fluorescencji 450 nm podczas eksperymentów. Jest to jednak bardzo rzadko obserwowane w warunkach stosowanych w opisywanych eksperymentach.
5. Ponieważ dane kalibracyjne znajdują się na końcu każdego pomiaru pH, należy sprawdzić, czy odpowiednie obliczone wartości różnią się od wartości pH użytych do kalibracji. W takim przypadku należy dostosować wszystkie wyznaczone doświadczalnie wartości pH do kalibracji, stosując następującą procedurę:
   1. Oblicz następujący iloraz (Q, różnica między zmierzonymi wartościami/różnica między wartościami kalibracyjnymi). Pomnóż cały zestaw danych przez Q. Dokonaj ostatecznej korekty przez dodawanie lub odejmowanie, tak aby obliczone wartości były równe odpowiednim wartościom kalibracji.

3. Pomiary początkowych wskaźników NHE7 przez szybki wychwyt Li⁺

1. Komórki nasienne na płytkach wielodołkowych (od 6 do 24 dołków) i zakwaszać je przy użyciu techniki ładowania NH₄ ⁺ opisanej powyżej lub alternatywnie zakwaszenia nigerycyną / albuminą surowicy bydlęcej (BSA) opisanego w²⁰.
2. Przepłukać płytki dwa razy szybko, używając wyżej opisanego roztworu do płukania, a następnie inkubować komórki w roztworach wychwytowych zawierających 1-10 mM litu (nieco poniżej wartości Km) i pożądane stężenia kationów i/lub inhibitorów będących przedmiotem zainteresowania przez żądany okres czasu.
3. Utrzymuj krótkie i stałe czasy absorpcji (zwykle jedną minutę lub mniej), aby zapewnić funkcjonowanie transportu w warunkach początkowych stawek. Upewnij się również, że wszystkie roztwory używane do wychwytu są izotoniczne.
4. Pod koniec czasu wchłaniania ostrożnie wyeliminuj pożywkę wychwytową i czterokrotnie przemyj komórki lodowato zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wykonuj te mycia tak szybko, jak to możliwe (mniej niż 10 sekund dla czterech z nich jest idealne), aby zapobiec wyciekowi litu.
5. Lizuj komórki w 25% kwasie azotowym. Nałożyć 250 μl na studzienkę 25% kwasu azotowego i pozostawić na co najmniej 1 godzinę, a następnie zeskrobać każdą studzienkę końcem końcówki pipety i przenieść całą zawiesinę studzienki do nowej probówki do mikrowirówki.
6. Przenieś lizat do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, odwiruj je przez 5 minut w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa), aby usunąć resztki komórkowe.
7. Zmierzyć zawartość litu w supernatantach za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej²¹.
   UWAGA: Różne firmy dostarczają spektrometry absorpcji atomowej, które muszą być wyposażone w litową lampę z pustą katodą. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, ponieważ te maszyny są bardzo precyzyjne, ale też dość delikatne.

Wyniki

Wybór:

Wybór zabijania H⁺ opiera się na dyfuzji słabej zasady amonowej, jak pokazano na rysunku 1A. Wpływ dyfuzji słabych zasad i kwasów na pH wewnątrzkomórkowe został zapoczątkowany przez Waltera Borona i współpracowników²². Elegancki pomysł, aby wykorzystać to zjawisko do wytworzenia śmiertelnego zakwaszenia dla pozytywnej selekcji genetycznej, został następnie opracowany przez Jacques'a Pouysségura17. Przy takim protokole wewnątrzkomórkowe p...

Dyskusja

Protokół ten opisuje, w jaki sposób selekcjonować komórki wykazujące ekspresję wewnątrzkomórkowych wymienników Na⁺/H⁺ w błonie plazmatycznej bez zmiany ich pierwotnej sekwencji przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Wymienniki te można teraz scharakteryzować.

Metoda ta opiera się na toksyczności komórkowej wewnątrzkomórkowych protonów w celu wybrania linii komórkowych, które będą eksprymować pęcherzykowe wymienniki Na⁺/H⁺ w błonie plazmatycznej. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Standardowe wyposażenie			Służy do selekcji zabijania H+ składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych
Inkubator z CO2	Sanyo	MCO15A
Inkubator bez CO2	Heraeus	instrument BB6220
Okap z przepływem laminarnym PSM1200NF	Fisher
DMEM medium	sigma	D5796
FBS gold	GE Healthcare	A15-151
Penicyna/streptomycyna	PAA	P11-010
Trypsyna 10x	PAA	L11-003
Spektrometr absorpcji atomowej z systemem pieca Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Kwas azotowy	sigma	438073
Zestaw do wideomikroskopii fluorescencyjnej	Leica		Składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych
Odwrócony mikroskop automatyczny	Statyw do mikroskopu Leica	DMI6000B
		11888906
		11888911
		11888377
incydent fluorescencji	Leica	11888901
		11504166
Wspornik silnika	Leica	11888379
		11505234 11521505
		11522106
Światło transmisyjne LED	Leica	8097321
		8102034
		11521580
zmotoryzowaną płytą	Leica	11522068
		11531172
		11521734
		11521719
		11888423
Wyjście kamery	Leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
oprogramowanie do akwizycji/analizy obrazów	Leica	11888375
optyka	Leica	11506507
		11506243
		11506203
fluorescencyjna lampa ksenonowa	Aparat Leica	DMI6000
	hamamatsu	8100601
oprogramowanie		11640905
sonda czuła pH, BCECF-AM	technologie życiowe	B1170
Nigericin	Sigma	N7143