Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakwaszenie endosomalne jest kluczowe dla szerokiego zakresu procesów, takich jak recykling i degradacja białek, desensytyzacja receptorów i ładowanie neuroprzekaźników w pęcherzykach synaptycznych. Opisuje się, że w tym zakwaszeniu pośredniczą ATPazy protonowe, sprzężone z transporterami chlorków ClC. Wysoce konserwatywne transportery protonów elektroneutralnych, wymienniki Na+/H+ (NHE) 6, 7 i 9 są również wyrażane w tych przedziałach. Mutacje w ich genach zostały powiązane z ludzkimi chorobami poznawczymi i neurodegeneracyjnymi. Paradoksalnie, ich rola pozostaje nieuchwytna, ponieważ ich wewnątrzkomórkowa lokalizacja uniemożliwiła szczegółową charakterystykę funkcjonalną. Niniejszy manuskrypt przedstawia metodę rozwiązania tego problemu. Polega to na selekcji zmutowanych linii komórkowych, zdolnych do przetrwania ostrego zakwaszenia cytozolowego poprzez zatrzymanie wewnątrzkomórkowych NHE w błonie plazmatycznej. Następnie przedstawiono dwa uzupełniające się protokoły pomiaru selektywności jonowej i aktywności tych wymienników: (i) jeden oparty na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii wideo oraz (ii) jeden oparty na szybkiej kinetyce wychwytu litu. Takie protokoły można ekstrapolować w celu pomiaru innych transporterów nieelektrogenicznych. Co więcej, przedstawiona tutaj procedura selekcji generuje komórki z fenotypem z wadą retencji wewnątrzkomórkowej. Dlatego komórki te będą również wyrażać inne białka błony pęcherzykowej na błonie plazmatycznej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna może zatem stanowić potencjalnie potężne narzędzie do badania innych białek wewnątrzkomórkowych, które będą następnie ulegać ekspresji w błonie komórkowej wraz z pęcherzykowymi wymiennikami Na+/H+ użytymi do selekcji.
Wprowadzenie
Większość przedziałów wewnątrzkomórkowych ma kwaśne pH światła, które jest kluczowym parametrem dla dojrzewania, transportu, recyklingu białek lub hormonów i ładowania neuroprzekaźników. Wykazano, że gradient pH między cytozolem a zawartością pęcherzykową jest generowany przez wakuolarne ATPazy H+ 1, sprzężone z pęcherzykowymi transporterami chlorku ClC2. Zarówno u myszy z nokautem (KO), jak i u ludzi, znaczenie tych transporterów zostało podkreślone przez ciężkie fenotypy spowodowane mutacjami w ich genach3-6.
Wykazano, że członkowie rodziny wymienników sodowo-wodorowych SLC9A, nazywanych również....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wybór zabijania H+
- Linie komórkowe
- Stabilnie transfekowane komórki z niedoborem NHE (np. linia komórkowa16 PS120 pochodząca z CCL39) przy użyciu dowolnej kombinacji wektora ekspresji ssaków i metody transfekcji, która zapewni wydajną wydajność transfekcji i selekcję w linii komórkowej fibroblastów.
UWAGA: Przez wiele lat stosowano wytrącanie fosforanu wapnia19 z dobrą wydajnością transfekcji. Został on ostatnio zastąpiony przez komercyjne odczynniki, takie jak Lipofectamine2000, przy czym transfekcje są wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta.
- Stabilnie transfekowane komórki z niedoborem NHE (np. linia komórkowa16 PS120 pochodząca z CCL39) przy użyciu dowolnej kombinacji wektora ekspresji ssaków i metody transfekcji, która zapewni wydajną wydajność transfekcji i selekcję w linii komórkowej fibroblastów.
- Rozwiązania
-
....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wybór:
Selekcja przez zabijanie H+ opiera się na dyfuzji słabej zasady amonowej, jak przedstawiono na Rysunku 1A. Wpływ dyfuzji słabych zasad i kwasów na pH wewnątrzkomórkowe został opisany pioniersko przez Waltera Borona i współpracowników22. Elegancka koncepcja wykorzystania tego zjawiska do wywołania letalnego zakwaszenia w celu pozytywnej selekcji genetycznej została następnie opracowana przez Jacquesa Pouysségura17. W ramach takiego protok.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje, w jaki sposób selekcjonować komórki wykazujące ekspresję wewnątrzkomórkowych wymienników Na+/H+ w błonie plazmatycznej bez zmiany ich pierwotnej sekwencji przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce. Wymienniki te można teraz scharakteryzować.
Metoda ta opiera się na toksyczności komórkowej wewnątrzkomórkowych protonów w celu wybrania linii komórkowych, które będą eksprymować pęcherzykowe wymienniki Na+/H+ w błonie plazmatycznej. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy są głęboko wdzięczni wszystkim członkom społeczności naukowej pracującej nad pH i transportem jonów, którzy zapoczątkowali i udoskonalili opisane tutaj pomiary. Szczególne podziękowania należą się dr Jacques'owi Pouysségurowi, który zapoczątkował zastosowaną tu technikę selekcji zabijającej H+. Wyrażają wdzięczność za wsparcie Uniwersytetowi Nicei-Sophia Antipolis, CNRS, ANR (JCJC SVSE1 NHEint) oraz ICST Labex.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Standardowe wyposażenie | Służy do selekcji zabijania H+ składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych | ||
| Inkubator z CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Inkubator bez CO2 | Heraeus | instrument BB6220 | |
| Okap z przepływem laminarnym PSM1200NF | Fisher | ||
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicyna/streptomycyna | PAA | P11-010 | |
| Trypsyna 10x | PAA | L11-003 | |
| Spektrometr absorpcji atomowej z systemem pieca Zeeman | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Kwas azotowy | sigma | 438073 | |
| Zestaw do wideomikroskopii fluorescencyjnej | Leica | Składa się z wielu urządzeń o różnych numerach katalogowych | |
| Odwrócony mikroskop automatyczny | Statyw do mikroskopu Leica | DMI6000B | |
| 11888906 | |||
| 11888911 | |||
| 11888377 | |||
| incydent fluorescencji | Leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| Wspornik silnika | Leica | 11888379 | |
| 11505234 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| Światło transmisyjne LED | Leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| zmotoryzowaną płytą | Leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| Wyjście kamery | Leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| oprogramowanie do akwizycji/analizy obrazów | Leica | 11888375 | |
| optyka | Leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescencyjna lampa ksenonowa | Aparat Leica | DMI6000 | |
| hamamatsu | 8100601 | ||
| oprogramowanie | 11640905 | ||
| sonda czuła pH, BCECF-AM | technologie życiowe | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
Bibliografia
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CL....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
