Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Summary

Mechanizm leżący u podstaw terapeutycznych efektów operacji Głębokiej Stymulacji Mózgu (DBS) wymaga zbadania. Metody przedstawione w tym manuskrypcie opisują eksperymentalne podejście do badania zdarzeń komórkowych wywoływanych przez DBS poprzez analizę profilu ekspresji genów kandydujących, które mogą ułatwić neurogenezę po operacji DBS.

Abstract

Operacja głębokiej stymulacji mózgu (DBS), ukierunkowana na różne obszary mózgu, takie jak zwoje podstawy, wzgórze i obszary podwzgórzowe, jest skutecznym sposobem leczenia kilku zaburzeń ruchowych, które nie reagują na leki. Niedawny postęp w dziedzinie chirurgii DBS zaczął rozszerzać zastosowanie tej techniki chirurgicznej na inne stany tak różnorodne, jak chorobliwa otyłość, depresja i zaburzenia obsesyjno-kompulsywne. Pomimo tych rosnących wskazań, niewiele wiadomo na temat podstawowych mechanizmów fizjologicznych, które ułatwiają korzystne efekty operacji DBS. Jednym z podejść do tego pytania jest przeprowadzenie analizy ekspresji genów w neuronach, które otrzymują stymulację elektryczną. Wcześniejsze badania wykazały, że neurogeneza w zakręcie zębatym szczura jest wywoływana w DBS ukierunkowanym na przednie jądro wzgórza¹. Chirurgia DBS ukierunkowana na ATN jest szeroko stosowana w leczeniu padaczki opornej na leczenie. W związku z tym bardzo interesujące jest dla nas zbadanie zmian transkrypcyjnych wywołanych przez elektryczną stymulację ATN. W tym manuskrypcie opisujemy nasze metodologie stereotaktycznego zabiegu chirurgicznego DBS ukierunkowanego na ATN u dorosłych samców szczurów rasy Wistar. Omówiono również kolejne etapy preparacji tkanek, izolacji RNA, przygotowania cDNA oraz ilościowego RT-PCR do pomiaru zmian ekspresji genów. Metoda ta może być stosowana i modyfikowana do stymulacji zwojów podstawy mózgu i innych obszarów mózgu, które są powszechnie ukierunkowane klinicznie. Opisane tutaj badanie ekspresji genów zakłada podejście do genu docelowego w celu odkrycia molekularnych graczy, którzy mogą kierować mechanizmem DBS.

Introduction

Historia rozwoju Głębokiej Stymulacji Mózgu jako techniki neurochirurgicznej sięga lat siedemdziesiątych XIX wieku, kiedy to zbadano możliwość elektrycznej stymulacji obwodów mózgu². Stosowanie przewlekłej stymulacji o wysokiej częstotliwości w leczeniu zaburzeń neuronalnych rozpoczęło się w latach sześćdziesiątych XX wieku³. Później, w latach dziewięćdziesiątych, wraz z pojawieniem się przewlekłych elektrod DBS^4-6 implantacyjnych, liczba zaburzeń neuronalnych, które były leczone przez DBS, nadal rosła. Głęboka stymulacja mózgu została po raz pierwszy zastosowana w Stanach Zjednoczonych w leczeniu drżenia samoistnego⁶. Obecnie chirurgia jest szeroko stosowana w leczeniu zaburzeń neuronalnych, które są obecnie nieuleczalne za pomocą interwencji farmakologicznej. DBS jest obecnie stosowany w leczeniu zaburzeń ruchowych choroby Parkinsona i dystonii^7-9. Demencja typu Alzheimera, choroba Huntingtona, epilepsja, ból i choroby neuropsychiatryczne, takie jak depresja, OCD, zespół Tourette'a i uzależnienie to tylko niektóre ze schorzeń, które można leczyć za pomocą DBS^10-12. Podczas gdy chirurgia DBS jest zatwierdzona przez FDA do leczenia choroby Parkinsona, dystonii i drżenia samoistnego, stosowanie DBS w leczeniu innych wyżej wymienionych schorzeń znajduje się na różnych etapach badań laboratoryjnych i klinicznych, oferując pacjentom wiele nadziei^13,14.

Klinicznie, operacja DBS jest wykonywana w dwóch etapach. Pierwszy etap polega na chirurgicznym ustawieniu elektrod DBS w docelowym miejscu anatomicznym przy użyciu kombinacji pozycjonowania radiologicznego, tomografii komputerowej, rezonansu magnetycznego oraz odczytów mikroelektrod w celu zwiększenia precyzji. Drugi etap polega na wszczepieniu generatora impulsów w górnej części klatki piersiowej pacjenta i zainstalowaniu przedłużaczy od skóry głowy do generatora impulsów. W oparciu o stan neurologiczny ustandaryzowano kilka schematów programowania generatora impulsów, które zostaną wykorzystane do dostarczenia żądanego napięcia. Napięcie końcowe jest osiągane w sposób stopniowy, aby uzyskać najlepszą odpowiedź kliniczną przy minimalnym napięciu¹⁵. Jednak w naszych badaniach, w przeciwieństwie do przewlekłych implantów DBS stosowanych klinicznie, dla uproszczenia uciekliśmy się do badania jednorazowej stymulacji o wysokiej częstotliwości (przez 1 godzinę) w naszych modelach zwierzęcych.

Część badań naszej grupy skupia się na badaniu zastosowania chirurgii DBS w leczeniu padaczki opornej na leczenie. Stereotaktyczne metody chirurgiczne wykorzystujące stymulację wysokiej częstotliwości były badane przez wielu innych jako skuteczna opcja leczenia padaczki opornej na leczenie, która stanowi około 30% wszystkich przypadków padaczki^10,16,17. Stymulacja móżdżku ukierunkowana na powierzchnię kory mózgowej, a także głębokie jądra móżdżku były w przeszłości stosowane jako cele w leczeniu padaczki^10,18,19. Ponadto próbowano również stymulacji hipokampa, ale z mieszanymi wynikami^20,21. Niektóre z innych badanych celów DBS w padaczce obejmują korę mózgową, wzgórze, jądro podwzgórzowe i nerw błędny⁸. Jednak zgodnie z wynikami kilku badań przeprowadzonych w ciągu ostatnich kilku lat, jądro przednie wzgórza (ATN) stało się najczęstszym celem DBS w leczeniu padaczki^10,22. Opierając się na wiedzy na temat obwodów neuroanatomicznych i wynikach z modeli zwierzęcych, kilka badań koncentrowało się na terapeutycznym wpływie głębokiej stymulacji mózgu ATN w leczeniu padaczki ^23-26. ATN jest częścią obwodu limbicznego i znajduje się w obszarze mózgu, który wpływa na częstotliwość napadów. W badaniach przeprowadzonych przez Hamani i wsp. przetestowano skuteczność ATN-DBS w modelu padaczki indukowanej pilokarpiną i stwierdzono, że obustronna stymulacja ATN wydłużała opóźnienia w przypadku napadów wywołanych pilokarpiną i stanu padaczkowego²⁴. Ponadto stwierdzono, że stymulacja ATN o wysokiej częstotliwości zmniejsza częstość napadów w modelu padaczki z pentylenotetrazolem (PTZ)^25,27-29. Lee i wsp. stwierdzili średnie zmniejszenie częstości napadów o około 75% po przewlekłej głębokiej stymulacji mózgu ATN w leczeniu opornej na leczenie padaczki częściowej³⁰.

Niedawne badanie kliniczne nad padaczką oporną na leczenie wykazało obiecujące wyniki po operacji DBS ukierunkowanej na jądro przednie wzgórza (ATN)²². Wieloośrodkowe randomizowane badanie kliniczne z udziałem 110 pacjentów poddawanych obustronnemu DBS ATN w leczeniu padaczki opornej na leczenie (badanie SANTE) wykazało spadek częstości napadów o około 40%³¹. Wyniki tego badania wskazują również na opóźniony optymalny efekt przeciwpadaczkowy obserwowany po 2-3 miesiącach od operacji. Dalsze badania przeprowadzone przez Toda i wsp., potwierdzone tymi odkryciami, wykazały neurogenezę zachodzącą w późniejszym czasie po DBS (dni 3-5) w modelach zwierzęcych¹. Ponadto Encinas i wsp. opisali neurogenezę hipokampa w zakręcie zębatym dorosłej myszy po stymulacji ATN³² o wysokiej częstotliwości. Poprzednie badania^33-35 wykazały spadek neurogenezy hipokampa w niektórych przypadkach padaczkowych, takich jak przewlekła padaczka skroniowa i związek z deficytami w uczeniu się, upośledzeniem pamięci i spontanicznymi nawracającymi napadami ruchowymi. Ponadto w przewlekle padaczkowym hipokampie w modelach zwierzęcych ^{zaobserwowano} zmniejszenie liczby czynników progenitorowych nerwowych komórek macierzystych, takich jak FGF2 i IGF-1. Biorąc to pod uwagę, strategie interwencyjne, takie jak DBS, które wykazują augmentację neurogenezy w zakręcie zębatym, są ekscytującymi ścieżkami badań. Odkrycia te zachęciły nas do dalszego zagłębiania się w mechanizm leżący u podstaw neurogenezy po leczeniu padaczki po DBS. Ukierunkowaliśmy ATN zarówno jednostronnie (dane nie zostały opublikowane), jak i dwustronnie (w reprezentatywnych wynikach) i zaobserwowaliśmy podwyższoną ekspresję neurotrofiny (BDNF) w zakręcie zębatym szczura. Nasza obecna hipoteza jest taka, że ekspresja BDNF inicjuje kaskadę ekspresji genów, która kończy się neurogenezą, która przekłada się na przeciwpadaczkowe działanie operacji DBS. W tym artykule przedstawiamy nasze metody chirurgii DBS ukierunkowane na ATN u szczurów, a następnie analizę ekspresji genów jako atrakcyjne podejście do badania mechanizmu leżącego u podstaw korzyści płynących z DBS.

Protocol

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury omówione w tym manuskrypcie są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi badań na zwierzętach (Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych) i są zatwierdzone przez Komitet IACUC Harvard Medical School.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie lub przez oczyszczanie roztworem antyseptycznym i/lub etanolem, jeśli to konieczne. Jeśli to możliwe, używaj sterylnego sprzętu jednorazowego użytku, takiego jak skalpele, igły i strzykawki.
2. Przykryj stół warsztatowy obłożeniami chirurgicznymi i upewnij się, że dostępna jest utylizacja odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.
3. Zważ szczura i oblicz dawkę znieczulenia. Użyj mieszanki ketaminy i ksylazyny (ketamina 75 mg/kg i ksylazyna 10 mg/kg) do znieczulenia szczurów.
   UWAGA: Pomiędzy 200-250 g to optymalna waga do prawidłowego zamocowania zwierzęcia w ramie stereotaktycznej, a także do dokładnego namierzenia ATN. Izofluran może być również stosowany jako środek znieczulający.
4. Zamontuj i zabezpiecz dwie sterylne elektrody (sterylizowane w autoklawie lub tlenkiem etylenu) na uchwycie elektrody (ryc. 2) stereotaktycznej ramy operacyjnej i za pomocą mikroskopu (powiększenie 10-40X) sprawdź końcówki elektrody pod kątem prawidłowego ustawienia. Zabezpiecz dwie elektrody w odległości 3.0 mm od siebie.
   UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić końcówki elektrody poprzez dotknięcie twardych powierzchni.

2. Chirurgia DBS

1. Wstrzyknąć zwierzęciu mieszaninę ketaminy i ksylazyny dootrzewnowo i upewnić się, że zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (sprawdzając odruch szczypania palca u nogi, częstość oddechów oraz głębokość i regularność oddechu). Usuń włosy z obszaru skóry głowy, który zostanie nacięty i zdezynfekuj skórę głowy za pomocą 3 naprzemiennych peelingów, z których każdy zawiera betadynę i alkohol lub sterylną sól fizjologiczną. Zabezpiecz i ustaw zwierzę na ramie stereotaktycznej.
2. Używaj cyrkulujących ciepłych podkładek wodnych, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na optymalnym poziomie. Nałóż lubrykant do oczu zwierzęcia, aby chronić je przed przesuszeniem.
3. Użyj następujących współrzędnych stereotaktycznych do celowania w ATN (jądro przednie wzgórza): przednio-tylne -1,6 mm, przyśrodkowo-boczne 1,5 mm i grzbietowo-brzuszne 5,2 mm¹,
   UWAGA: Współrzędne stereotaktyczne są oparte na atlasie³⁶ mózgu szczura Paxinos and Watson (6^th edition).
4. Wykonaj nacięcie w skórze głowy strzałkowo, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą pary retraktorów zabezpiecz naciętą skórę głowy, aby odsłonić czaszkę. Użyj sterylnej soli fizjologicznej, aby przepłukać nacięcie. Jeśli nacięcie jest zbyt mokre, użyj sterylnych wacików do wyschnięcia. Zlokalizuj bregmę i zaznacz czarnym markerem. Aby wskazać położenie otworów zadziorów, wykonaj dwa dodatkowe znaki w odległości około 1,5 mm przyśrodkowo po obu stronach od szwu strzałkowego i 1,6 mm za szwem koronalnym.
5. Użyj ręcznej wiertarki, aby wykonać otwory na zadziory. Upewnij się, że końcówka otworu na żarna jest sterylna, sterylizując ją etanolem. Podczas wiercenia trzymaj wiertło pod kątem około 45° do powierzchni czaszki. Często przełączaj się między dwoma otworami na zadziory, aby uniknąć nadmiernego ciepła w miejscu dowolnego otworu na zadziory.
6. Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Za pomocą igły z wygiętą końcówką przypominającą kształt litery "L" usuń wszelkie złamane kawałki kości, które utrudniałyby wprowadzenie elektrody. Należy uważać, aby nie uszkodzić opony twardej i/lub tkanki mózgowej podczas usuwania fragmentów kości za pomocą wygiętej igły.
   UWAGA: Użycie igły lub cienkich kleszczy jest również opcją.
7. Przymocuj zespół podwójnej elektrody do obrotowego uchwytu ramy stereotaktycznej i zamocuj uchwyt pod kątem 90°. Korzystając z regulacji w ramce stereotaktycznej, umieść lewą elektrodę dokładnie nad bregmą.
8. Korzystając z regulacji stereotaktycznych do pozycjonowania przyśrodkowo-bocznego, precyzyjnie przesuń lewą elektrodę o 1,5 mm na lewą stronę bregmy, tak aby teraz dwie elektrody były idealnie ustawione wzdłuż szwu koronalnego, ale oddalone od siebie o 1,5 mm przyśrodkowo bocznie od bregmy.
9. Korzystając z przednio-tylnej regulacji stereotaktycznej, przesuń elektrody o 1,6 mm do tyłu do szwu koronalnego.
10. Użyj regulacji grzbietowo-brzusznej, aby opuścić elektrody, aby najpierw sprawdzić, czy otwory na zadziory zostały wykonane we właściwym miejscu, tak aby elektrody można było łatwo włożyć, bez dotykania ostrych krawędzi otworów zadziorów. Jeśli tak, należy umieścić elektrody na głębokości 5,2 mm od powierzchni czaszki.
11. Podłączyć elektrody za pomocą przewodów do stymulatora ustawionego na 130 Hz, 2,5 V i szerokość impulsu 90 μs1.
12. Dostarczaj stymulację o wysokiej częstotliwości przez godzinę (lub przez żądany okres czasu, zgodnie z konfiguracją eksperymentalną). W trakcie stymulacji należy pamiętać o regularnym zapewnianiu odpowiedniej głębokości znieczulenia, sprawdzając, czy stopa nie wycofuje się w odpowiedzi na uszczypnięcie palca. Uzupełnić znieczulenie około połową dawki początkowej stosowanej do wywołania znieczulenia. Unikaj zanieczyszczenia sterylnych rękawic podczas sprawdzania głębokości znieczulenia i zmieniaj je w razie potrzeby. Wykonaj jednostronną lub obustronną stymulację w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Uwzględnij kontrole, takie jak stymulacja o niskiej częstotliwości (np. 10 Hz) i zwierzęta niestymulowane (wprowadzanie elektrod bez późniejszej stymulacji).
13. Po wykonaniu stymulacji należy ostrożnie usunąć elektrody i zszyć nacięcie szwami 3-0 lub sterylnymi zszywkami chirurgicznymi.
14. Buprenorfinę (0,05 mg/kg) podawać podskórnie w postaci środka przeciwbólowego. Monitoruj zwierzę, dopóki nie powróci do normalnej aktywności, a następnie zwróć je do pomieszczenia inwentarskiego.
15. Po upływie określonego czasu w oparciu o schemat eksperymentalny (np. 0, 3, 6 lub 12 godzin po operacji DBS) należy poddać zwierzę eutanazji z powodu przedawkowania znieczulenia. Po potwierdzeniu braku parametrów życiowych odetnij głowę zwierzęciu.
16. Wypreparuj mózg, najpierw usuwając skórę za pomocą nożyczek. Przeciąć kość wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek preparacyjnych. Wykonaj jeszcze dwa nacięcia (około cala każde) przez kość po obu bocznych stronach. Za pomocą kleszczy podnieś częściowo odcięty kawałek kości z górnej części czaszki, aby odsłonić mózg.
17. Za pomocą cienkich nożyczek lub kleszczy usuń mózg z czaszki i przenieś na szalkę Petriego z zimnym PBS na lodzie.
    UWAGA: Uważaj, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas wykonywania nacięć przez kość.

3. Izolacja hipokampa

UWAGA: Wykonaj wszystkie kolejne kroki w tej sekcji na lodzie.

1. Umieść mózg na wstępnie schłodzonej akrylowej matrycy mózgowej na lodzie. Za pomocą żyletki przeciąć mózg w kierunku koronalnym w odległości około 7-8 mm od najbardziej przedniej krawędzi mózgu. Wykonaj drugie cięcie w kierunku koronalnym i za pierwszym cięciem, tak aby można było usunąć plaster mózgu o grubości około 5 mm.
2. Przenieś plasterek mózgu na szalkę Petriego z lodowatym PBS. Za pomocą żyletki odetnij dwie półkuliste sekcje i zwróć uwagę, która półkula odpowiada odpowiednio lewej i prawej stronie. Jest to szczególnie ważne podczas wykonywania jednostronnych stymulacji.
3. Za pomocą drobnych kleszczy i nożyczek ostrożnie usuń hipokamp.
4. Błyskawiczne zamrożenie tkanki hipokampa na suchym lodzie i przechowywanie w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowe do kolejnych etapów ekstrakcji RNA.
   UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

4. Ekstrakcja RNA i ilościowy PCR

1. Upewnij się, że tkanka pozostaje zamrożona na suchym lodzie, aż będzie gotowa do homogenizacji.
2. UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie.
   1. Dodać 1 ml odczynnika Tri do tkanki hipokampa w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i homogenizować ją, najpierw pipetując wiele razy, aż tkanka zostanie rozbita na mniejsze kawałki. Dalej homogenizować tkankę, przechodząc przez strzykawkę z igłą 25 G, aż nie będzie widoczna żadna nieuszkodzona tkanka. Etapy homogenizacji należy wykonać na lodzie.
   2. Po homogenizacji tkanki pozostaw zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby umożliwić lizę komórek.
      UWAGA: Po tym czasie zawiesinę komórek można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej obróbki.
3. Dodać 0,2 ml chloroformu i mieszać przez wirowanie przez 20 sekund i pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej na 15 minut.
4. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówki, nie naruszając trzech oddzielnych warstw, które będą widoczne.
   UWAGA: Dolna (czerwona) faza zawiera białka, środkowa faza mętna zawiera DNA, a górna faza przezroczysta zawiera RNA.
5. Przenieść górną klarowną fazę (RNA) do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (zazwyczaj otrzymuje się 500 μl fazy zawierającej RNA). Do tego dodaj 0,5 ml izopropanolu i wymieszaj przez wirowanie. Do tego dodać 2-3 μl glikogenu (20 mg/ml) jako nośnik RNA. Pozostawić próbkę na stole w temperaturze pokojowej na 10 minut.
6. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że osad RNA jest widoczny na dnie probówki.
7. Wyrzucić supernatant i przemyć osad RNA, dodając 1 ml 75% etanolu (wytworzonego z wody wolnej od nukleaz). Odwrócić próbkę wiele razy, aż osad oderwie się od dna probówki i zacznie unosić się w roztworze. Odwirować roztwór o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Granulat w 75% etanolu można przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych kroków.
8. Pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu, pozostawiając otwarte probówki na 5 minut w temperaturze pokojowej. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia granulki, ponieważ może to wpłynąć na jej rozpuszczenie w wodzie w kolejnym etapie.

5. Usuwanie DNA z preparatu RNA

1. Dodaj 9 μl wody wolnej od nukleaz do osadu RNA i upewnij się, że osad jest rozpuszczony przed kontynuowaniem, delikatnie wirując probówkę. Do tego dodać 1 μl 10x buforu Dnazy I i 1 μl rekombinowanej DNazy (z zestawu DNazy I), wymieszać, delikatnie przesuwając probówki, krótko obrócić probówki i inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.
2. Dodać 2 μl odczynnika do inaktywacji DNazy (z zestawu DNazy I) do próbki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty i często mieszać, delikatnie przesuwając probówkę. Odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut i przenieść około 10 μl klarownego supernatantu do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
3. Zmierz stężenie RNA za pomocą nanokropli lub spektrofotometru.

6. Tworzenie cDNA z RNA

1. Dodać wymaganą objętość, która zawiera 1 μg RNA i doprowadzić całkowitą objętość do 8 μl, dodając wodę wolną od nukleaz. Do tego dodaj 1 μl 10 mM mieszanki dNTP i 1 μl losowych heksamerów z zestawu do syntezy pierwszej nici w indeksie górnym. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w łaźni wodnej lub na zaprogramowanym termocyklerze.
2. Sporządzić premiks zawierający następujące odczynniki: 2 μl 10x buforu RT, 4 μl 25 M MgCl₂, 2 μl 0,1 M DTT i 1 μl RNAse OUT (40 U/μl).
   UWAGA: Podane objętości dotyczą reakcji, użytkownik musiałby skalować w górę zgodnie ze swoimi potrzebami eksperymentalnymi.
3. Po usunięciu próbki zawierającej RNA z temperatury 65 °C, należy ustawić probówkę w temperaturze pokojowej na minutę. Dodać 9 μl roztworu premiksu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptazy indeksu górnego II (50 j./μl), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
4. Próbki należy inkubować w temperaturze 42 °C przez 50 minut, aby nastąpiła odwrotna transkrypcja.
5. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu zakończenia reakcji.
6. Umieścić próbki na krótko na lodzie, dodać 1 μl RNAseH (2 U/μl) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
7. Krótko odwirować probówki o stężeniu 3 000 x g, aby odwirować płyn kondensatu.
   UWAGA: Jest to cDNA, które zostanie użyte do ilościowego PCR. cDNA można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu ustawienia PCR. cDNA można również rozcieńczyć wodą wolną od nukleaz przed przystąpieniem do PCR.

7. Ilościowy PCR

1. Sporządzić mieszankę wzorcową zawierającą następujące odczynniki (podane objętości dotyczą każdej reakcji): 6,3 μl 2x Sybr Green Mix, 0,6 μl Forward Primer (10 μM), 0,6 μl Reverse Primer (10 μM) i 0,5 μl wody wolnej od nukleaz.
   UWAGA: Projekt startera został wykonany przy użyciu opcji "Wybierz startery" na stronie sekwencji nukleotydów NCBI dla interesującego genu.
2. Dodaj 10 μl mastermixu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce PCR. Dodać 2,5 μl wytworzonego wcześniej cDNA do studzienki zawierającej mastermix. Upewnij się, że ustawiłeś potrójne reakcje PCR dla każdej próbki.
3. Po zakończeniu dodawania mastermixu i cDNA, przykryj płytkę PCR za pomocą optycznego arkusza kleju, aby uszczelnić studzienki. Obracać płytkę krótko przez 5 minut przy 500 x g w wirówce stołowej, aby cały płyn osiadł na dnie studzienki.
4. Załaduj płytkę PCR do wstępnie zaprogramowanej maszyny RT-PCR. Należy użyć parametrów PCR podanych w tabeli 1.
5. Analiza danych: Do dalszych obliczeń należy użyć wartości C_t z danych wyjściowych qPCR. Wraz z genem testowym ustaw reakcje PCR dla genów kontroli wewnętrznej, 18S rRNA (aby zapewnić równe wejście) i β-aktyny (kontrola ujemna). Obliczyć zmiany zagięcia w oparciu o metodę ΔΔCt ³⁷.

Results

Rysunki 1A i 1B pokazują względną ekspresję BDNF i GABRD w stosunku do genu kontrolnego β-aktyny. BDNF, neurotrofina, jest często związana z działaniem neuroprotrotacyjnym w wielu chorobach neuronalnych^38-41. Dlatego interesująca jest analiza profilu ekspresji BDNF w odpowiedzi na stymulację ATN, która przynosi korzyści terapeutyczne pacjentom z padaczką. Na rycinie 1A, która pokazuje profil ekspresji genów BDNF we wskazanych punktach czasowych po stymulacji D...

Discussion

Po przełomowej pracy Benabida i in. w stosowaniu głębokiej stymulacji mózgu w leczeniu choroby Parkinsona i drżenia samoistnego, technika chirurgiczna DBS była badana z dużym zainteresowaniem w ciągu ostatniej dekady w leczeniu wielu zaburzeń neurologicznych^6,10,43. Badania DBS ukierunkowane na różne neuroanatomiczne regiony obwodów mózgowych są obecnie prowadzone przez wiele grup w celu leczenia głównych chorób neuronalnych i są na różnych etapach badań klinicznych. Stymulacja jądra podwzgórzowego (S...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			głębokiej stymulacji mózgu
Rama stereotaktyczna	Kopf Instruments	Model 900
Wiertło	Dremmel	7700, skalpel 7,2 V
	BD	372610
Ketamina	Patterson Veterinary	07-803-6637	Harmonogram III Substancja kontrolowana, pozyskiwanie, stosowanie i przechowywanie zgodnie z przepisami instytucjonalnymi
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Harmonogram III Substancja kontrolowana, pozyskiwanie, stosowanie i przechowywanie zgodnie z zasadami instytucjonalnymi
Zszywki chirurgiczne	ConMed Corporation	8035
Szwy (3-0)	Aparat Harvarda	72-3333
Strzykawka (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterylna, służy do podawania znieczulenia dootrzewnowo
Strzykawka (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterylna, służy do podawania znieczulenia podskórnie
Igły	BD	305761	Sterylne, służy do usuwania złamanych kawałków kości z otworów w zadziorach
Alkohol	Fisher Naukowe		zastosowanie S25309B do ogólnej sterylizacji
Smar do oczu	Fisher Scientific	19-898-350
Stymulator	Medtronic	Model 3628
Elektrody DBS	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100 mm	Elektrody to platynowa, koncentryczna i bipolarna
Betadina (powidon-jod)	PDI	S23125	Waciki jednorazowego użytku, służą do sterylizacji skóry głowy przed wykonaniem nacięcia
Rozwarstwienie mózgu i izolacja
Akrylowa matryca mózgu gryzoni	Mikroskopia elektronowa Nauki	175-300	www.emsdiasum.com
Żyletka	V W R	55411-050
Nożyczki gilotynowe	Clauss	18039	W celu dekapitacji upewnij się, że te nożyczki są utrzymywane w czystości i sprawnym stanie
Nożyczki	Codman Klasyczny	34-4098	Służy do usuwania mózgu z czaszki
Kleszcze	Mikroskopia elektronowa Nauki	72957-06	Służy do usuwania mózgu z czaszki i do przenoszenia podczas sekcji
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Boston Bioproducts	BM-220
Ekstrakcja RNA i przygotowanie cDNA Tri
Reagent	Sigma	T9424	Zawsze używaj w dygestoria i noś okulary ochronne podczas obsługi; unikać kontaktu ze skórą
Strzykawka (3 ml, 25 G)	BD	309570	Służy do homogenizacji tkanek
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Zawsze używaj w dygestorium i noś okulary ochronne podczas obsługi; unikaj kontaktu z skóra
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glikogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Indeks górny Zestaw do syntezy pierwszej nici	Invitrogen	11904-018
Mikrowirówka stołowa	Eppendorf	5415D
Ilościowy PCR
Zielony zestaw do PCR SYBR	Qiagen	204143
Oligos	Invitrogen	10668051
(96 dołków)	Denville Scientific	C18080-10
Optyczne arkusze samoprzylepne	Thermo Scientific	AB1170
Woda wolna od nukleaz	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Maszyna do PCR	Time PCR Applied Biosystems	7500