Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Summary

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Abstract

Istnieje niewiele wysokoprzepustowych systemów in vitro, które ułatwiają rozwój wielogatunkowych biofilmów, które zawierają wiele gatunków powszechnie wykrywanych w biofilmach doustnych in vivo. Co więcej, system, który wykorzystuje naturalną ludzką ślinę jako źródło składników odżywczych, zamiast sztucznych pożywek, jest szczególnie pożądany w celu wspierania ekspresji właściwości specyficznych dla komórek i biofilmu, które naśladują społeczności in vivo. Opisano metodę wytwarzania wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej, które są porównywalne pod względem składu gatunkowego do naddziąsłowej płytki nazębnej, w warunkach zbliżonych do jamy ustnej człowieka. W szczególności w tym artykule dotyczącym metod opisano, w jaki sposób można dostosować dostępny na rynku system mikroprzepływowy, aby ułatwić rozwój wielogatunkowych biofilmów jamy ustnej pochodzących i hodowanych w ślinie. Ponadto przedstawiony zostanie opis tego, w jaki sposób system może być wykorzystywany w połączeniu z konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym do generowania rekonstrukcji 3D biofilmu do analiz architektonicznych i żywotności. Biorąc pod uwagę dużą różnorodność mikroorganizmów, które rozwijają się w biofilmach w układzie mikroprzepływowym (w tym Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella i Porphyromonas), przedstawiony zostanie również protokół opisujący, w jaki sposób zbierać komórki biofilmu w celu dalszej subkultury lub ekstrakcji i analizy DNA. Omówione zostaną ograniczenia zarówno systemu biofilmu mikroprzepływowego, jak i obecnych analiz danych zgodnie z aktualnym stanem wiedzy. Ostatecznie przewiduje się, że artykuł ten dostarczy podstawowej techniki, która usprawni badanie biofilmów w jamie ustnej i pomoże w opracowaniu dodatkowych technologii, które można zintegrować z platformą mikroprzepływową.

Introduction

Biofilmy to architektonicznie skomplikowane społeczności bakterii, które są agregowane na powierzchniach ¹. Zbiorowiska te zazwyczaj zawierają wiele gatunków, które oddziałują ze sobą w obrębie biofilmu ². Biofilmy jamy ustnej, z których najbardziej rzucająca się w oczy jest płytka nazębna, stanowią uporczywy problem u ludzi, a ich niekontrolowany rozwój prowadzi do powstawania zróżnicowanych taksonomicznie zbiorowisk wielogatunkowych ³. Bakterie składowe tych zróżnicowanych społeczności mogą być do 1000 razy bardziej odporne na środki przeciwdrobnoustrojowe niż ich swobodnie pływające (planktonowe) odpowiedniki ^4-6. Brak leczenia tych biofilmów jamy ustnej, które mogą powodować próchnicę i choroby przyzębia, spowodował znaczne obciążenie dla zdrowia publicznego: ponad 500 milionów wizyt w gabinecie dentystycznym rocznie w USA i około 108 miliardów dolarów na leczenie lub zapobieganie chorobom przyzębia i próchnicy ^{zębów 7}.

"Podczas gdy wielu mikrobiologów opowiada się za badaniem zachowania mikroorganizmów w warunkach naturalnych, niewielu z nich to robi. Dzieje się tak dlatego, że ich morale do pokonywania trudności jest stale osłabiane przez atrakcyjną łatwość pracy z kulturami laboratoryjnymi" (Smith, ⁸).

Obecnie badania biofilmu jamy ustnej są prowadzone przy użyciu różnych podejść in vivo i in vitro, z których każde ma swoje zalety i wady ^9,10. Podejścia in vitro często wykorzystują modelowe systemy biofilmu, które są stosunkowo łatwe do skonfigurowania, ale mogą nie mieć zastosowania klinicznego/rzeczywistego ^10,11. Podejścia in vivo zazwyczaj opierają się na systemach modeli zwierzęcych, które mogą odtwarzać pewne aspekty środowiska jamy ustnej człowieka, ale ponownie cierpią z powodu ograniczeń wynikających z różnic w anatomii, fizjologii, mikrobiologii i immunologii między zwierzętami a ludźmi ^12,13. Należy zauważyć, że biofilmy w jamie ustnej mogą również powstawać na powierzchniach szkliwa utrzymywanych w stencie w ustach ochotników, ale takie podejście jest obecnie stosunkowo kosztowne i pracochłonne ^14,15. Ostatecznie nowatorskie środki lub technologie mające na celu poprawę higieny jamy ustnej są testowane na ludziach w kontrolowanych warunkach badań klinicznych ¹¹. Obecnie często stosowanym sposobem identyfikacji i oceny nowych środków do higieny jamy ustnej jest najpierw przeprowadzenie badań laboratoryjnych w celu rozpoznania potencjalnej skuteczności, a następnie przeprowadzenie badań na zwierzętach i "prób terenowych", które zatrudniają klinicystów w celu oceny sukcesu technologii ^9,16,17. Niestety, badania laboratoryjne zwykle opierają się na systemach modelowych, które zajmują dużą powierzchnię, są technologicznie trudne w użyciu i często zawierają uproszczone społeczności jednego lub co najwyżej kilku gatunków, aby uzyskać potencjalne znaczenie w świecie rzeczywistym ^10,18. Biorąc pod uwagę, że biofilmy płytki nazębnej zawierają wiele gatunków i tworzą się w złożonym, przepływającym środowisku ślinowym, jest mało prawdopodobne, aby tworzenie biofilmów zawierających jeden lub kilka gatunków w sztucznych pożywkach wygenerowało społeczności, które zachowują się w podobny sposób jak te w rzeczywistym scenariuszu ^10,19. Aby sprostać wymaganiom czasowym, kosztowym, szkoleniowym i słabo reprezentatywnemu charakterowi systemów biofilmu w modelu laboratoryjnym w porównaniu z rzeczywistym środowiskiem, opracowaliśmy niedawno wysokowydajny i przyjazny dla środowiska system biofilmu ²⁰ (Rysunek 1). System czerpie korzyści z zastosowania bezkomórkowej puli ludzkiej śliny (CFS) jako pożywki i niepoddanej działaniu substancji puli ludzkiej śliny bakteryjnej zawierającej komórki bakteryjne (CCS) jako inokulum. Wyjątkowość systemu polega na połączeniu technologii mikroprzepływowej, konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego oraz technologii analizy różnorodności bakterii niezależnej od hodowli. W związku z tym system modelowy jest przyjazny dla środowiska (wykorzystuje ślinę jako inokulum do wzrostu wielogatunkowych biofilmów w temperaturze 37 °C w wysterylizowanej przez filtr płynnej ślinie), a biofilmy jamy ustnej zawierają gatunki (w tym Streptococcus, Neisseria, Veillonella i Porphyromonas) w ilościach reprezentatywnych dla tych znalezionych we wczesnej blaszce naddziąsłowej ²⁰.

Biorąc pod uwagę, że ta praca opisuje użycie nowo opracowanego systemu modelowego, należy zwrócić szczególną uwagę na połączenie mikrofluidyki konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) i technologii analizy różnorodności niezależnych od kultur. Połączenie tych technologii przez naszą grupę badawczą było zamierzone i nie tylko zwiększa przepustowość nowo opracowanego systemu modelowego, ale także pozwala na zadawanie pytań, które wcześniej nie były łatwe do rozwiązania za pomocą innych systemów. Po pierwsze, CLSM ma wyraźną przewagę nad tradycyjną mikroskopią, ponieważ pozwala na trójwymiarową analizę biofilmów. Często niedoceniane, jest to niezwykle ważne, ponieważ biofilmy są niejednorodne pod względem składu gatunkowego i pozycji przestrzennej, a także warunków fizjologicznych narzucanych w różnych miejscach przestrzennych w obrębie biofilmu ^6,21. W połączeniu z oprogramowaniem do renderowania trójwymiarowego i oprogramowaniem do analizy obrazu, architektura biofilmu, relacje przestrzenne między gatunkami składowymi oraz zakres zabijania przeciwdrobnoustrojowego mogą być analizowane ^22-24. Takie zdolności nie są możliwe przy użyciu standardowej mikroskopii światła przechodzącego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Mikrofluidyka zyskała szczególną uwagę w dziedzinie mikrobiologii, ponieważ umożliwia badanie biofilmów w ściśle kontrolowanych warunkach (przepływ, temperatura, pH itp.) i wymaga jedynie niewielkich objętości cieczy ^25-27. Dla porównania, wyhodowanie biofilmu jamy ustnej w ludzkiej ślinie w systemie modelu komórek przepływowych (systemie, który jest prawdopodobnie uważany za podstawowy model dla wielu badań nad biofilmem jamy ustnej) przez 20 godzin przy podobnym natężeniu przepływu i ścinaniu, jak w systemie mikroprzepływowym, wymaga co najmniej 200 ml, w przeciwieństwie do 800 μl w urządzeniu mikroprzepływowym ^28-31. W ten sposób system biofilmu w modelu mikroprzepływowym umożliwia badanie materiału o ograniczonej ilości w określonych warunkach. Wreszcie, technologia pirosekwencjonowania została zoptymalizowana w ciągu ostatniej dekady tak, aby wymagała jedynie niewielkich ilości materiału do przeprowadzenia analizy zbiorowiska i jest wystarczająco wszechstronna, aby kontrolować głębokość sekwencjonowania w celu uzyskania tożsamości nawet rzadkich gatunków biofilmu. Zastosowanie tej technologii, takiej jak kodowanie pirologiczne FLX z amplikonem bakteryjnym (bTEFAP), pozwoliło na znalezienie odpowiedzi na istotne pytania dotyczące ekologii biofilmów ^32,33. Takie pytania powodowały trudności w przeszłości, gdy pirosekwencjonowanie nie było dostępne ze względu na czas i koszty wymagane do stworzenia bibliotek plazmidowych oraz złożone kroki technologiczne i analityczne wymagane do uzyskania danych ^33,34. Oczywiście, wielką zaletą podejść niezależnych od hodowli, takich jak pirosekwencjonowanie, jest to, że gatunki bakterii, których nie można hodować oddzielnie w konwencjonalnych pożywkach laboratoryjnych (tj. gatunki żywotne, ale niehodowlane), mogą być hodowane i identyfikowane w systemie modelowym, a ich względna liczebność w społeczności może być określana ilościowo ^35,36 . Dla porównania, już w 1963 roku nieżyjący już Sigmund Socransky oszacował, że około 50% bakterii w materiale wyizolowanym ze szczeliny dziąsła w jamie ustnej człowieka nie może być hodowane w warunkach laboratoryjnych ³⁷.

Celem tego artykułu jest opisanie podejścia do tworzenia doustnych wielogatunkowych biofilmów w komercyjnie dostępnym systemie mikroprzepływowym (Bioflux) w: (i) warunkach reprezentatywnych dla ludzkiej jamy ustnej i (ii) o składzie gatunkowym i obfitości porównywalnej do blaszki naddziąsłowej. Ponadto, korzystając zarówno z oprogramowania freeware, jak i komercyjnego, podkreślamy, w jaki sposób podstawowe miary architektury biofilmu można uzyskać na podstawie danych CLSM, koncentrując się na podejściach do ilościowego określania biomasy, chropowatości i żywotności biofilmu (w oparciu o barwienie żywe/martwe). Na koniec opisano etapy wymagane do pobrania materiału biofilmu do analizy różnorodności za pomocą bTEFAP.

Protocol

Opisany tutaj protokół pobierania śliny został sprawdzony przez University of Michigan Institutional Review Board for Human Subject Research.
UWAGA: W odniesieniu do instytucjonalnych recenzji tego typu prac z udziałem ludzi, należy uzyskać uprzednie uzgodnienia i pozwolenia od instytucji przyjmującej. W szczególności, w zależności od instytucji, przed przystąpieniem do pobierania śliny od ochotników może być konieczne uzyskanie i zatwierdzenie przez IRB lub zasady etyki. Jako pomoc w przygotowaniu aplikacji, przydatny algorytm/wykres NIH można znaleźć tutaj: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Przygotowanie śliny do użycia jako pożywka dla środowiska

1. Zwerbuj >5 osób do oddania śliny. Nie pobieraj żadnych informacji identyfikacyjnych, upewnij się, że żadna osoba nie odda śliny, jeśli jest chora lub przyjmowała doustne antybiotyki w ciągu ostatnich 3 miesięcy lub spożywała żywność lub płyny, z wyjątkiem wody, w ciągu ostatnich 2 godzin przed oddaniem śliny.
2. Zbierz ślinę do plastikowych tubek o pojemności 50 ml. Zebraną ślinę należy zebrać w plastikowej zlewce, trzymając ją na lodzie. Nie używaj szkła, ponieważ polimery w ślinie będą przylegać do wewnętrznych powierzchni szkła.
3. Dodaj ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 2,5 mM ze 100-krotnego wyrostu. (Stado zamraża się w podwielokrotnościach jednorazowego użytku w temperaturze –20 °C). Mieszaj przez 10 minut w plastikowej zlewce na lodzie.
4. W celu usunięcia cząstek stałych należy odwirować zebraną ślinę przez 30 minut przy 17 500 x g.
5. Rozcieńczyć ślinę 3 objętościami dH₂O, aby uzyskać jedną czwartą stężonej śliny.
6. Filtruj i sterylizuj ślinę za pomocą 0,22 μm polieterosulfonu (PES), filtra o niskiej zawartości białka. Użyj filtra o dużej powierzchni lub użyj kilku filtrów o małym obszarze. Trzymaj ślinę w plastikowym pojemniku na lodzie podczas filtrowania.
7. Zamrozić zebraną ślinę w temperaturze –80 °C w plastikowych probówkach o pojemności 50 ml, aż będzie potrzebna do rozwoju bakterii. Każda plastikowa probówka jest przeznaczona tylko do jednorazowego użytku i nie powinna zawierać więcej niż 35 ml, ponieważ każda studzienka mikroprzepływowa mieści maksymalnie 1,2 ml (1,2 ml x 24 studzienki = 28,8 ml), a w każdej probówce potrzebna jest przestrzeń, ponieważ ślina rozszerza się podczas zamrażania.
8. Przed użyciem rozmrozić zebraną ślinę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu ponownie wysterylizować filtr (0,22 μm polieterosulfonu, filtr o niskiej zawartości białka w celu usunięcia wszelkich osadów).

2. Przygotowanie zebranej śliny do użycia jako inokulum

1. Zwerbuj >5 osób do oddania śliny. Nie pobieraj żadnych informacji identyfikujących, upewnij się, że żadna osoba nie odda śliny, jeśli jest chora, przyjmowała doustne antybiotyki w ciągu ostatnich 3 miesięcy lub spożywała żywność lub płyny, z wyjątkiem wody, w ciągu ostatnich 2 godzin przed oddaniem śliny. Próbki należy pobierać w ciągu 30 minut.
2. Zebrać ślinę do plastikowych probówek o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej i zebrać zebraną ślinę w plastikowej zlewce o temperaturze pokojowej.
3. Rozcieńczyć zebraną ślinę autoklawowanym odczynnikiem ogólnym glicerolem, aby uzyskać zapas o końcowym stosunku 25% glicerolu, 75% śliny zawierającej komórki [CCS].
4. Zamrozić ślinę w temperaturze –80 °C w 3 ml jednorazowych porcji do czasu, aż będzie potrzebna.
5. Gdy jest to wymagane do zaszczepienia układu mikroprzepływowego, podwielokrotności są rozmrażane w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszane w wirówce przez 5 sekund, zanim zostaną odpipetowane do układu mikroprzepływowego, jak opisano w kroku 3 poniższego protokołu.

3. Wzrost biofilmów wielogatunkowych w jamie ustnej

1. Obróbka wstępna CFS
   1. Najpierw pokryj kanały mikroprzepływowe Bioflux CFS. Dodaj 100 μl CFS do każdego dołka wylotowego. Za pomocą oprogramowania sterującego Bioflux wybrać "ręczny" i ustawić przepływ z kanałów "B1-B24", które mają być używane.
   2. Następnie ustaw ścinanie na 1,0 dyn/cm² i rozpocznij przepływ przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zapewnić jednorodny rozkład CFS w całym kanale. Upewnij się, że w każdym kanale wlotowym znajduje się płyn, aby sprawdzić, czy CFS przepływał przez wszystkie kanały równomiernie.
   3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   4. Usuń roztwór CFS/obróbki wstępnej, który pozostał w studzienkach wylotowych i przenieś do studzienek wlotowych. Ta całkowita objętość 100 μl posłuży do zrównoważenia ciśnienia wywieranego na inokulum ze studni wylotowej.
2. szczepienie
   1. Do każdej studzienki wylotowej dodać 100 μl inokulum CCS. Umieść płytkę mikroprzepływową na płycie grzewczej (temperatura ustawiona na 37 °C), wybierz instrukcję w oprogramowaniu sterującym i ustaw przepływ ze studzienek wylotowych do studzienek wlotowych (tj. odwrotnie) na 1,0 dyn/cm² dokładnie na 6 sekund.
   2. Inkubować płytkę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C przez 40 minut, aby umożliwić początkowe przyleganie i wzrost bakterii w inokulum.
3. Wzrost z dnia na dzień
   1. W przypadku zaszczepionych kanałów, które są używane, należy odessać inokulum odpadowe z każdej ze studzienek wylotowych. Dodać do 1 ml całkowitej objętości CFS do każdej ze studzienek wlotowych (można to zrobić na istniejącym CFS).
   2. Inkubować płytkę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C, wybrać tryb ręczny i ustawić program tak, aby działał przy 0,2 dyn/cm² przez 20 godzin.
4. Pranie wstępne bejcy
   1. Odessać cały płyn ze studzienek wlotowych i wylotowych i dodać 100 μl PBS (pH 7,4) do każdej ze studzienek wlotowych. Przepływ przez 20 minut przy 0,2 dyn/cm².
5. Dodawanie mieszanki bejc
   1. W celu barwienia żywotności komórek należy przygotować 100 μl mieszaniny barwiącej na każdy kanał, który ma być barwiony. W szczególności dodaj 3 μl SYTO 9 i 3 μl jodku propidyny na ml PBS za pomocą komercyjnego zestawu do barwienia żywotności komórek, takiego jak LIVE/DEAD. W ten sposób powstaje mieszanina barwiąca zawierająca 10 μM SYTO 9 i 60 μM jodku propidyny.
   2. Odessać pozostały PBS ze studzienek wlotowych, a następnie dodać 100 μl mieszaniny barwienia żywotności komórek do każdej studzienki wlotowej. Ustaw przepływ na poziomie 0,2 dyn/^cm2 i uruchom roztwór od wlotu do wylotu przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
6. Mycie po barwieniu
   1. Odessać pozostałą plamę w każdej ze studzienek wlotowych i dodać 100 μl PBS do każdej studzienki wlotowej. Ustaw przepływ na poziomie 0,2 dyn/cm² i uruchom roztwór PBS od wlotu do wylotu na 20 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar plam
   .

4. Gromadzenie obrazów, renderowanie 3D i analiza obrazów

1. Użyj odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), aby zebrać dane obrazu biofilmu z systemu mikroprzepływowego. Upewnij się, że CLSM jest w stanie wytrzymać ciężar płytki Bioflux, która może osiągnąć 150 g.
   UWAGA: Biorąc pod uwagę wymiary kanałów mikroprzepływowych, potrzebę czułości w celu rozpoznania struktury biofilmu oraz wymagania dotyczące wykrywania sygnału fluorescencji o różnym natężeniu, dopasuj CLSM do soczewki obiektywowej 40X 1,25 NA lub o podobnej jakości optycznej, powiększeniu i aperturze numerycznej.
2. Standaryzacja bramek wychwytywania emisji z pomiarami wzmocnienia i przesunięcia przy zachowaniu stałego poziomu. Upewnij się, że moc lasera nie przekracza 25%, ponieważ może to spowodować fotowybielanie.
3. Konwertuj pliki CLSM z typu LIF (L eica Image File type) na typ pliku OME (Open Microscopy Environment). Pozwala to na łatwiejszy dostęp i kompatybilność między programami. Użyj dostępnego na rynku oprogramowania, takiego jak IMARIS, aby przekonwertować pliki do tego typu.

Renderowanie 3D obrazów/figur

4. Po przekonwertowaniu do formatu OME użyj dostępnego na rynku oprogramowania, takiego jak IMARIS, aby renderować obrazy w 3D. Wykonaj to za pomocą kombinacji opcji "Easy3D" i "Surpass".
   UWAGA: Należy zwrócić uwagę na sygnał tła i progowanie. Funkcja histogramu w IMARIS może być wykorzystana do uzyskania zakresu kolekcji i powinien być utrzymywany na stałym poziomie między analizowanymi obrazami.
5. Zapisz obrazy za pomocą funkcji "migawki" i dokładnie rozważ rozdzielczość obrazu przed zapisaniem typów plików.
6. Składaj obrazy w figury za pomocą oprogramowania do edycji obrazów, takiego jak CorelDraw lub Adobe Illustrator.

Analiza obrazów 3D dla wykresów i tabel

7. Do analizy obrazu można korzystać z ogólnodostępnych programów IMAGEJ ²³ i COMSTAT/COMSTAT2 ³⁸. Pobierz pakiety odpowiednio z http://rsb.info.nih.gov/ij/ i http://comstat.dk/. Na komputerze jest zainstalowana najnowsza aktualizacja oprogramowania Java.
   UWAGA: Przed użyciem oprogramowania do analizy obrazu należy zainstalować platformę programową JAVA.
   1. Użyj oprogramowania IMAGEJ z wtyczką COMSTAT2, aby zaimportować pliki OME dla każdego obrazu biofilmu w trybie "hyperstack" i view z "podzielonymi kanałami".
   2. Indywidualnie przeanalizuj dwa kanały (czerwony/jodek propidy/martwy to kanał 0, zielony/SYTO-9/LIVE to kanał 1) za pomocą funkcji "histogramu" IMAGEJ. Ta funkcja wyświetla łączną liczbę pikseli 8-bitowych plików OME (wyświetlanych jako "liczba") przy każdej intensywności kolorów od 0 do 255 (wyświetlanych jako "wartość"), gdzie 0 to piksele bez sygnału (tło), a 255 to piksele z pełnym nasyceniem sygnału.
   3. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i ustandaryzuj wszystkie wartości sygnału, ważąc każdy piksel odpowiednią intensywnością sygnału. Odbywa się to poprzez pomnożenie całkowitej liczby przy danym natężeniu sygnału przez liczbową 8-bitową wartość (0-255) tego natężenia sygnału.
   4. Zsumuj wszystkie wartości ważone (od 0 do 255) dla obu kanałów dla każdego zarejestrowanego obrazu biofilmu. Weź sumę wartości ważonych dla obu kanałów, aby określić procentowy całkowity sygnał z każdego kanału. Zrób to, aby określić względny stosunek lub procent czerwonego i procentowego zielonego sygnału (tj. procent "MARTWY" i procent "ŻYWY" dla każdego zabiegu).
   5. Wykonuj analizy statystyczne, na przykład przy użyciu dwustronnego testu Studenta T-shirt zmodyfikowanego pod kątem nierównej wariancji. Wartości p <0,05 są uważane za istotne, a wartości p <0,01 są uważane za wysoce istotne.

5. Pobieranie komórek biofilmu do analizy niezależnej od kultury

1. Usuń całą zużytą i niewykorzystaną ślinę ze studzienek wlotowych i wylotowych. Umyj studzienki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej.
2. Dodać 100 μl sterylnej wody destylowanej do studzienek wlotowych i za pomocą interfejsu sterowania oprogramowania przepuścić sterylną wodę destylowaną do przodu przez kanały z prędkością >8,0 dyn/^cm2 (natężenie przepływu >745 μl/h, ścinanie 800 ^sek-1) przez co najmniej 5 minut. Powtórz w odwrotnym kierunku przez co najmniej 5 minut, a następnie powtórz proces mycia do przodu i do tyłu.
3. Sprawdź za pomocą światła lub mikroskopii epifluorescencyjnej (jeśli komórki były barwione/znakowane) w celu dokładnego usunięcia biofilmu (ryc. 2). Zebrać 100 μl zawiesiny komórek i przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy niezależnej od hodowli. Opłacalną analizę składu zbiorowiska można przeprowadzić za pomocą kodowania pirosekwencjonu FLX z kodowaniem znaczników bakteryjnych (bTEFAP) przy użyciu podejścia opisanego w Nance i wsp. ²⁰

Results

Renderowanie 3D biofilmów

Reprezentatywne wyniki są pokazane na rysunku 3. Przydatnym narzędziem w oprogramowaniu IMARIS jest możliwość zbadania każdego wycinka pobranego stosu biofilmu i połączenia ich w celu stworzenia trójwymiarowych rekonstrukcji. Ponadto można dodać sztuczne efekty cieniowania, aby pomóc w wizualnej interpretacji trójwymiarowych struktur. Wyrenderowane biofilmy można orientować w dowolnym kierunku z różnymi powiększeniami, aby zb...

Discussion

W tym artykule przedstawiono podstawowe kroki wymagane do skonfigurowania i uruchomienia systemu mikroprzepływowego w sposób umożliwiający rozwój doustnych wielogatunkowych biofilmów pochodzących z zebranej ludzkiej śliny i hodowanych w sterylizowanej filtrem 25% puli ludzkiej śliny. Podano podejścia do charakterystyki biofilmu, ale należy pamiętać, że opisane podejścia są modyfikowalne i można wprowadzić dodatkowe technologie, takie jak np. plamy czy etykiety. Na przykład można sobie wyobrazić użycie znakowanych przeciw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe	Fisher Scientific	14-959-49D
Ditiotriitol (białe kryształy lub proszek/elektroforeza), Fisher BioReagents	Ultrawirówka Fisher Scientific	BP172-5
Sorval  (Kompatybilny z SS-34)	Thermoscientific	Zależny
wirnik Thermo Scientific SS-34	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Typ 1 Odczynnik do wody dejonizowanej	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Filtry o szybkim przepływie i filtry butelkowe, membrana PES, sterylne.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
System mikroprzepływowy BioFlux	System Fluxion Bioflux 200
Płyta 24-kanałowa Bioflux	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
Barwnik ŻYWY/MARTWY (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Lecia	SPE lub system
Mikroskop epifluorescencyjny	Wiele wyborów	Wiele wyborów
pirosekwencjonowania	Wiele wyborów	Wiele wyborów
Decon SaniHol 70 Roztwór etanolu	Fisher Scientific	04-355-122
Zamrażarka ultra niskotemperaturowa -80  ° C	Wielokrotny	wybór Wielokrotny wybór
Wskazówki (20, 200 i 1,000  μ l)	Wiele wyborów	Jednokanałowe
pipety o zmiennej objętości (20, 200, 1,000 i #956; l)	Wiele wyborów	Wiele wyborów
Software
Bioflux dedykowane oprogramowanie	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Darmowe oprogramowanie (http://www.comstat.dk/)