Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Summary

Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.

Abstract

Szybkie, fazowe uwalnianie dopaminy (DA) w mózgu ssaków odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu nagrody, uczeniu się przez wzmacnianie i kontroli motywacji. Woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania (FSCV) to technika elektrochemiczna o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej (subsekundowej), która została wykorzystana do zbadania fazowego uwalniania DA w kilku typach preparatów. Eksperymenty in vitro na pojedynczych komórkach i wycinkach mózgu oraz eksperymenty in vivo na znieczulonych gryzoniach wykorzystano do identyfikacji mechanizmów pośredniczących w uwalnianiu i wychwytywaniu dopaminy w normalnych warunkach i w modelach chorobowych. W ciągu ostatnich 20 lat eksperymenty in vivo FSCV na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach dostarczyły również informacji na temat mechanizmów dopaminergicznych w przetwarzaniu nagrody i uczeniu się nagrody. Jedną z głównych zalet przebudzonego, swobodnie poruszającego się preparatu jest możliwość zbadania gwałtownych fluktuacji DA, które są ograniczone czasowo do określonych zdarzeń behawioralnych lub prezentacji nagrody lub wskazówki. Jednak jednym z ograniczeń połączonych eksperymentów behawioralnych i woltamperometrycznych jest trudność w oddzieleniu efektów DA, które są specyficzne dla pierwotnych bodźców nagradzających lub awersyjnych, od współwystępujących fluktuacji DA, które pośredniczą w zachowaniu ukierunkowanym na nagrodę lub innych zachowaniach motorycznych. W tym miejscu opisujemy metodę łączoną wykorzystującą FSCV in vivo i infuzję dodoustną u przytomnego szczura w celu bezpośredniego zbadania odpowiedzi DA na degustacje doustne. W tych eksperymentach doustne degustatory są podawane bezpośrednio do podniebienia szczura – z pominięciem zachowań ukierunkowanych na nagrodę i dobrowolnych zachowań związanych z piciem – co pozwala na bezpośrednie badanie reakcji DA na bodźce degustacyjne.

Introduction

Fazowe uwalnianie DA odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w zachowaniu ukierunkowanym na nagrodę ^[1-3]. Jednak izolowanie i badanie, w jaki sposób nagroda pierwotna zmienia fazowe uwalnianie DA, jest często skomplikowane przez współwystępujące procesy behawioralne lub poznawcze, które są również zdolne do zmiany fazowego uwalniania DA - takie jak procesy podejmowania decyzji lub zachowania motoryczne ukierunkowane na nagrodę w celu uzyskania nagrody. W obecnej pracy izolujemy fazowe odpowiedzi DA na degustatory za pomocą szybkiej woltamperometrii cyklicznej in vivo (FSCV) w połączeniu z dawką degustacyjną przez kaniule wewnątrzustne. Ta technika omi....

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1) Przygotowania przedoperacyjne

1. Przygotowanie roztworu doustnego
   1. Stwórz roztwory 10% sacharozy i 0,005% L-mentolu w wodzie dejonizowanej (pH 7,4). Przechowuj te roztwory w zamkniętych pojemnikach, w temperaturze pokojowej i przerabiaj co 2 tygodnie, aby zapobiec degradacji.
2. Roztwory do kalibracji elektrod
   1. Przygotować bufor T....

Results

FSCV w połączeniu z implantacją cewnika wewnątrzustnego zostało użyte do zbadania, jak sacharoza, smacznik apetytywny, moduluje fazowe uwalnianie DA w rdzeniu NAc. Przed infuzją degustacyjną stymulacja elektryczna (150 μA, 60 Hz, 24 impulsy; oznaczona czerwonym paskiem) VTA powoduje znaczny wzrost fazowego uwalniania DA w NAc (ryc. 1). Rysunek 1 przedstawia kolorowy wykres z potencjałem na osi y, czasem na osi x i prądem (reprezentowanym jako fałszywy kolor) na osi z. Poniżej kolorowego .......

Discussion

Wewnątrzustne podawanie degustacji w połączeniu z FSCV pozwala na analizę reakcji DA "w czasie rzeczywistym" na doustne środki aromatyzujące. W protokole znajdują się trzy krytyczne kroki, które są wymagane do pomyślnych pomiarów DA. Po pierwsze, prawidłowa implantacja cewnika doustnego ma kluczowe znaczenie dla dostarczania środków aromatycznych. Upewnienie się, że cewnik jest wprowadzony za pierwszym zębem trzonowym i zaklinowany na miejscu, zapobiega utracie drożności cewnika i zapobiega przypadkowemu usunięciu przez .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elektroda stymulująca	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	przy zamówieniu poproś o 22 mm cięcie poniżej cokołu
Kaniula do elektrody	BioAnalytical Systems	MD-2251
Szklane systemy kapilarne	A-M	624503
włókno węglowe	Thornel	T650
Ściągacz elektrod	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus iizolator	Digitimer Ltd.	DS4
Termokurczliwy	3M	FP-301
Izolowane druty do elektrod	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois w Chicago, Engineering Machine Shop
Epoksyd	ITW Devcon	14250	"5 minut epoksyd"
Kopolimer kwasu perfluoro-3,6-dioksa-4-metylo-7oktenosulfonowego i tetrafluoroetylenu	Moc jonowa	LQ-1105	i.e. Farba Nafion
Silver	GC Electronics	22-023
Zasilacz	BK Precision	9110
Rurki do cewniki wewnątrzustne	Intramedic	427426	PE 100, ID = 0,86 mm; OD = 1,52 mm
Rurka do infuzji wewnątrzustnej	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Pompa strzykawkowa do komory przepływowej	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cement chirurgiczny	Dentsply Caulk	675571 i 675572
Siłownik pneumatyczny	VICI	A60	6-pozycyjny cyfrowy interfejs zaworu
Cyfrowy interfejs zaworu	VICI	DVI	230 VAC
Poczwórny stopień główny	Univ. of N. Carolina, Zakład
Zasilacz UEI	Univ. of N. Carolina, Elektronika Skrzynka
UEI	Univ. of N. Carolina, Zakład Elektroniki Zasilanie
do degustacyjnej pompy strzykawkowej	Med Associates	SG-504
Tastant pompa strzykawkowa	Med Associates	PHM-107
Mikroelektroda wolframowa	MicroProbes	WE30030.5A3
Srebrny przewód odniesienia z AgCl	InVivo Metryczne	E255A Sacharoza
	Sigma	80497
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
Chlroide sodu	Sigma	S7653
Kwas nadchlorowy	Sigma	244252
Kwas solny (4 M)	Sigma	54435
Wodorotlenek soidum	Sigma	306576
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009
Chlorowodorek dopaminy	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Musisz poprosić o oprogramowanie: kliknij tutaj, aby uzyskać link do strony z żądaniem oprogramowania