Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Podsumowanie

Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.

Streszczenie

Szybkie, fazowe uwalnianie dopaminy (DA) w mózgu ssaków odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu nagrody, uczeniu się przez wzmacnianie i kontroli motywacji. Woltamperometria cykliczna szybkiego skanowania (FSCV) to technika elektrochemiczna o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej (subsekundowej), która została wykorzystana do zbadania fazowego uwalniania DA w kilku typach preparatów. Eksperymenty in vitro na pojedynczych komórkach i wycinkach mózgu oraz eksperymenty in vivo na znieczulonych gryzoniach wykorzystano do identyfikacji mechanizmów pośredniczących w uwalnianiu i wychwytywaniu dopaminy w normalnych warunkach i w modelach chorobowych. W ciągu ostatnich 20 lat eksperymenty in vivo FSCV na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach dostarczyły również informacji na temat mechanizmów dopaminergicznych w przetwarzaniu nagrody i uczeniu się nagrody. Jedną z głównych zalet przebudzonego, swobodnie poruszającego się preparatu jest możliwość zbadania gwałtownych fluktuacji DA, które są ograniczone czasowo do określonych zdarzeń behawioralnych lub prezentacji nagrody lub wskazówki. Jednak jednym z ograniczeń połączonych eksperymentów behawioralnych i woltamperometrycznych jest trudność w oddzieleniu efektów DA, które są specyficzne dla pierwotnych bodźców nagradzających lub awersyjnych, od współwystępujących fluktuacji DA, które pośredniczą w zachowaniu ukierunkowanym na nagrodę lub innych zachowaniach motorycznych. W tym miejscu opisujemy metodę łączoną wykorzystującą FSCV in vivo i infuzję dodoustną u przytomnego szczura w celu bezpośredniego zbadania odpowiedzi DA na degustacje doustne. W tych eksperymentach doustne degustatory są podawane bezpośrednio do podniebienia szczura – z pominięciem zachowań ukierunkowanych na nagrodę i dobrowolnych zachowań związanych z piciem – co pozwala na bezpośrednie badanie reakcji DA na bodźce degustacyjne.

Wprowadzenie

Fazowe uwalnianie DA odgrywa ważną rolę w pośredniczeniu w zachowaniu ukierunkowanym na nagrodę ^[1-3]. Jednak izolowanie i badanie, w jaki sposób nagroda pierwotna zmienia fazowe uwalnianie DA, jest często skomplikowane przez współwystępujące procesy behawioralne lub poznawcze, które są również zdolne do zmiany fazowego uwalniania DA - takie jak procesy podejmowania decyzji lub zachowania motoryczne ukierunkowane na nagrodę w celu uzyskania nagrody. W obecnej pracy izolujemy fazowe odpowiedzi DA na degustatory za pomocą szybkiej woltamperometrii cyklicznej in vivo (FSCV) w połączeniu z dawką degustacyjną przez kaniule wewnątrzustne. Ta technika omija wybór i działanie i pozwala nam zbadać zewnątrzkomórkowe uwalnianie DA podczas bezpośredniego naparu degustatora do podniebienia szczura.

FSCV to technika elektrochemiczna o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, pozwalająca na pomiary uwalniania DA w dyskretnym obszarze lokalnym (około 100 μm) w skali subsekundowej (rozdzielczość 10 Hz). Połączenie podawania wewnątrzustnego i FSCV ma tę zaletę, że pozwala na obserwowanie szybkich reakcji DA w czasie rzeczywistym na degustację, której nie można zbadać przy użyciu konwencjonalnych metod mikrodializy. Co więcej, fazowe uwalnianie DA w odpowiedzi na nagrody lub sygnały związane z nagrodą zachodzi w stężeniach między 20-100 nM, czyli powyżej progu wykrywania 10-20 nM dla FSCV ^[4]. Wysoka rozdzielczość przestrzenna FSCV pozwala również na zapis z podregionów małych obszarów mózgu, takich jak jądro półleżące jądro (NAc). Tak więc FSCV w połączeniu z wewnątrzustnymi wlewami degustantów jest idealnym modelem do badania, w jaki sposób degustatory lub inne bodźce zmieniają fazowe uwalnianie DA u obudzonych, zachowujących się zwierząt. Rzeczywiście, techniki te pozwoliły na eksperymenty badające, w jaki sposób nagradzające i awersyjne degustacje zmieniają zewnątrzkomórkowe uwalnianie DA ^[5].

W ciągu ostatniej dekady, analizy FSCV zostały z powodzeniem połączone z dożylnym podawaniem leków ^[6] i paradygmatami samodzielnego podawania u szczurów ^{[7, 8]} w celu zidentyfikowania roli fazowych mechanizmów DA w modelach uzależnienia od narkotyków. Ponadto, połączone dostarczanie wewnątrzustne z FSCV zostało wykorzystane do zbadania, w jaki sposób wskazówki degustacyjne w połączeniu z dostępnością kokainy modulują fazowe uwalnianie DA i reakcje behawioralne, które odzwierciedlają afekt emocjonalny ^[3]. Ta połączona metodologia wewnątrzustna i FSCV może być również z powodzeniem wykorzystana do badania fazowych odpowiedzi DA na substancje aromatyczne, takie jak mentol i doustne substancje słodzące, które są dodawane do papierosów i rozpuszczalnych wyrobów tytoniowych ^[9-11]. Chociaż wiele aromatów dodawanych do wyrobów tytoniowych ma charakter apetytywny ^[9-11], nie wiadomo, czy te aromaty zwiększają fazowe uwalnianie DA w sposób zgodny z nagradzającą wartościowością hedoniczną. Rzeczywiście, substancje aromatyczne dodawane do papierosów i rozpuszczalnych wyrobów tytoniowych mogą mieć bezpośredni wpływ na układ nagrody DA i mogą działać poprzez mechanizmy dopaminergiczne, wpływając na nagradzającą walencję papierosów i innych wyrobów tytoniowych. W związku z tym podawanie wewnątrzustne w połączeniu z FSCV może dostarczyć nowych informacji na temat tego, w jaki sposób aromaty modulują szybkie uwalnianie DA. Zastosowanie połączonej metodologii FSCV podawanej dodoustnie i in vivo oraz dane uzyskane z takich badań mogą również ułatwić przyszłe badania mające na celu określenie, w jaki sposób substancje aromatyczne i nikotyna oddziałują na siebie, zmieniając sygnalizację DA i potencjalnie modulując wzmocnienie nikotyny. Co więcej, dane uzyskane z takich badań mogą być wykorzystane do podejmowania decyzji regulacyjnych dotyczących środków aromatyzujących do wyrobów tytoniowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1) Przygotowania przedoperacyjne

1. Przygotowanie roztworu doustnego
   1. Stwórz roztwory 10% sacharozy i 0,005% L-mentolu w wodzie dejonizowanej (pH 7,4). Przechowuj te roztwory w zamkniętych pojemnikach, w temperaturze pokojowej i przerabiaj co 2 tygodnie, aby zapobiec degradacji.
2. Roztwory do kalibracji elektrod
   1. Przygotować bufor Tris (pH 7,4) w dowolnym momencie przed kalibracją. Rozwiązanie składa się z 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl₂ i 2,00 mM Na₂SO₄.
   2. Stworzyć roztwór podstawowy 10 mM dopaminy (DA; chlorowodorek dopaminy) w 0,1 M kwasie nadchlorowym. Kwas nadchlorowy pomaga zapobiegać utlenianiu dopaminy. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C i stosować przez okres do 6 miesięcy. Przygotować kilka porcji roztworu podstawowego DA do przechowywania, aby użyć każdej podwielokrotności tylko raz.
   3. Z 10 mM DA rozcieńczone roztwory w buforze Tris do stężeń 1 μM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM i 31,25 nM.
   4. Do kalibracji pH należy przygotować roztwory buforu Tris o pH 7,2, 7,3, 7,5 i 7,6. Zapewni to roztwory, które naśladują zmiany pH, które mogą wystąpić podczas eksperymentu in vivo.
3. Produkcja elektrod
   1. Poprzez odsysanie próżniowe zassać włókno węglowe T-650 (średnica 7 μm) do kapilary ze szkła borokrzemianowego (długość 10 mm, średnica zewnętrzna 0,6 mm, średnica wewnętrzna 0,4 mm).
   2. Umieść szklaną kapilarnę wypełnioną włóknem węglowym w pionowym ściągaczu elektrod. Dla początkowych parametrów ustaw grzałkę na 55.0 i wyłącz magnes. Jednak dalsza optymalizacja może być konieczna, ponieważ zarówno ustawienia grzałki, jak i magnetyczne różnią się w zależności od laboratorium.
      Uwaga: Elektroda powinna mieć co najmniej 5,5 cm długości (łącznie ze stożkiem), aby mogła łatwo zmieścić się w mikromanipulatorze i zostać wprowadzona co najmniej 6,9 mm poniżej opony twardej w mózgu szczura. Jeśli elektroda jest zbyt krótka, zapisy z brzusznej części jądra półleżącego nie będą możliwe. Z drugiej strony całkowita długość elektrody nie powinna przekraczać 6,5 cm, w przeciwnym razie będzie zbyt długa, aby zmieścić się w mikromanipulatorze.
   3. Za pomocą mikroskopu świetlnego przytnij odsłonięte włókno węglowe tak, aby wystawało 75-100 μm poza koniec szkła. Sprawdź, czy elektroda ma bardzo szczelne, ledwo dostrzegalne uszczelnienie między elektrodą szklaną a włóknem węglowym, które będzie wytwarzać minimalny szum podczas późniejszego nagrywania. Wyrzuć elektrodę, jeśli są zauważalne pęknięcia szkła lub jeśli uszczelka jest luźna, co wskazuje na słabe uszczelnienie. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje, patrz [12] i [13].
4. Montaż elektrody w mikromanipulatorze
   1. Zaopatrz się w drut o długości 3 cali i 30 G, który jest izolowany na połowie długości drutu i za pomocą małego pędzla nałóż cienką warstwę srebrnej farby bezpośrednio na drut. Natychmiast po nałożeniu srebrnej farby włóż drut do otworu w górnej części elektrody, aby zapewnić fizyczne i elektryczne połączenie z włóknem węglowym. Pod mikroskopem upewnij się, że srebrny drut styka się z włóknem węglowym.
   2. Przymocuj srebrny drut i elektrodę do mikromanipulatora za pomocą koszulki termokurczliwej.
   3. Umieść przygotowaną elektrodę z włókna węglowego w oczyszczonym alkoholu izopropylowym (IPA) na co najmniej 10 minut, aby oczyścić powierzchnię elektrody i zwiększyć późniejszą wrażliwość na dopaminę. Po namoczeniu w IPA spłucz włókno węglowe wodą z kranu, aby usunąć IPA.
5. Produkcja elektrod referencyjnych
   1. Weź srebrny drut o średnicy 13 mm zawierający siatkę Ag/Ag Cl o średnicy około 6 mm (sam srebrny drut o średnicy 7 mm, oczka 6 mm, średnica 0,4 mm), przytnij srebrną część do około połowy jej pierwotnej długości i srebrną część drutu do złotego kołka.
   2. Nałóż żywicę epoksydową na lut na kołku.
   3. Zanurz koniec siatki Ag/Ag Cl w kopolimerze 5% politetrafluroetylenu i kwasu perfluoro-3,6-dioksa-4-metylo-7oktenosulfonowego 5 razy, z 30-minutowymi okresami suszenia powietrza między każdym zanurzeniem.
   4. Pozostaw powlekaną siatkę Ag/Ag Cl do wyschnięcia na powietrzu O/N.
   5. Utwardzać w piecu w temperaturze 120 ºC przez 1 godzinę.

2) Połączona chirurgia wewnątrzustna i chirurgia kaniulacji wewnątrzczaszkowej (około 75 min)

1. Wytwarzanie cewnika doustnego
   1. Wykonaj cewnik doustny i wysterylizuj go tlenkiem etylenu co najmniej 10 dni przed zabiegiem.
   2. Pokrój rurkę PE 100 na segmenty o długości 6 cm.
   3. Za pomocą lutownicy stopij jeden koniec rurki PE i natychmiast dociśnij do twardej powierzchni, aby schłodzić rurkę PE. W rezultacie powinien powstać mały, płaski dysk na jednym końcu rurki PE i nie powinien być kołnierzowy. Użyj igły (18 G) lub szpilki, aby utworzyć otwór w środku tego dysku.
   4. Na drugim końcu rurki PE dokładnie włóż koniec igły 18 G do rurki.
   5. Za pomocą standardowego dziurkacza do papieru przebij kilka okrągłych kawałków arkusza politetrafluroetylenu (o grubości 3,18 mm, średnicy 6 mm), aby utworzyć podkładki z politetrafluroetylenu.
   6. Utwórz otwór w środku podkładki. Weź igłę przymocowaną do rurki PE i przepchnij ją całkowicie przez podkładkę. Po przebiciu igły wsuń podkładkę na spód rurki PE tak, aby przylegała do podkładki.
2. Chirurgia jamy ustnej
   1. Po wysterylizowaniu narzędzi chirurgicznych, kaniuli (przyciętej do 2,5 mm poniżej cokołu przed sterylizacją) i elektrody referencyjnej, znieczulij szczura dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg).
      1. Po 5 minutach zastosuj test na szkodliwy bodziec (szczypanie stopy lub ogona), aby ocenić poziom znieczulenia. Jeśli pacjent wykazuje jakąkolwiek fizyczną reakcję na test szkodliwego bodźca (reakcja drgań, wzrost częstości oddechów lub serca), podaj zastrzyk ketaminy o 10% do 15% pierwotnej dawki i powtórz powyższy protokół szkodliwego bodźca.
   2. Po tym, jak szczur jest w pełni znieczulony i nie wykazuje reakcji na test szkodliwego bodźca, użyj maszynki do strzyżenia włosów zwierzęcych, aby zgolić sierść szczura od oczu do około 2 mm za uszami. Następnie umieść szczura na cienkiej poduszce grzewczej z recyrkulacją wody, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji. Nałóż smar do oczu. Niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ), karprofen (5 mg/kg), należy podawać we wstrzyknięciu dootrzewnowym przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć i przed wprowadzeniem kaniul wewnątrzustnych. Przez cały czas należy stosować technikę aseptyczną.
   3. Zastosuj betadynę, a następnie 70% etanol, aby oczyścić skórę. Powtórz 3 razy.
   4. Połóż szczura na plecach i otwórz usta za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Znajdź pierwszy górny ząb trzonowy.
   5. Wbić igłę w tkankę między policzkiem a pierwszym górnym zębem trzonowym, aż igła wyjdzie tuż za uszami i przyśrodkowo do uszu.
   6. Przekłuć igłę przez skórę, aż rurka PE wyjdzie ze skóry i będzie dostępna.
   7. Pociągnij kaniulę do góry (chwytając za samą kaniulę, a nie za igłę) i zamocuj podkładkę z politetrafluroetylenu w zębach trzonowych, tak aby cewnik pozostał na swoim miejscu.
      Uwaga: Przycięcie podkładki na kształt trapezu i zabezpieczenie jej przy zębach trzonowych płaską stroną skierowaną w stronę policzka ułatwia ten krok.
   8. Weź kolejną podkładkę z politetrafluroetylenu i nasuń ją na odsłoniętą igłę, w dół plastikowej rurki i przyłóż do nacięcia.
   9. Aby zabezpieczyć podkładkę z politetrafluroetylenu, użyj wysterylizowanej taśmy, aby utworzyć trójkątną "flagę", aby podkładka nie wysuwała się do góry. Przymocuj pralkę do skóry szczura i wysterylizowanej taśmy.
   10. Przetnij odsłonięty cewnik, aby 2-4 cm rurki mogły być odsłonięte nad głową szczura.
   11. Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.10 dla drugiej strony jamy ustnej.
3. Chirurgia wewnątrzczaszkowa w woltamperometrii
   1. Umieść szczura w ramce stereotaktycznej i oczyść skórę głowy zwierzęcia za pomocą dwuetapowego peelingu (peeling betadynowy, a następnie peeling 70% etanolu, wykonuj z 3 cyklami).
   2. Użyj wysterylizowanej pęsety igłowej i nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć odcinek tkanki skóry głowy o wymiarach 15 x 15 mm.
   3. Delikatnie oczyść powierzchnię czaszki za pomocą wysterylizowanych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Następnie oczyść czaszkę, nakładając 2 do 3 kropli 3% nadtlenku wodoru.
   4. Za pomocą wiertła stereotaktycznego wykonaj 3 małe (o średnicy 1 mm) otwory w czaszce do późniejszego wkręcenia, 1 otwór na kaniulę prowadzącą, 1 otwór na elektrodę stymulującą i 1 otwór na elektrodę odniesienia.
   5. W przypadku nagrań w rdzeniu NAc należy umieścić kaniulę prowadzącą na 1,2 mm z przodu i 1,4 mm z boku w stosunku do Bregmy. Opuść aparat kaniuli, aż plastikowa podstawa zrówna się z czaszką.
   6. Umieść wysterylizowaną elektrodę referencyjną w półkuli przeciwlegle do kaniuli prowadzącej. Obniż odniesienie około 2 mm poniżej opony twardej.
   7. Umieść elektrodę stymulującą na 5,2 mm z tyłu i 1,0 mm z boku do Bregmy i obniż 8,0 mm poniżej opony twardej, aby celować w brzuszny obszar nakrywki (VTA).
   8. Użyj wysterylizowanego małego śrubokręta chirurgicznego, aby przymocować do czaszki. Następnie włóż elektrodę referencyjną, elektrodę stymulującą i kaniulę prowadzącą. Na koniec zabezpiecz wszystkie elementy za pomocą cementu kranioplastycznego.
   9. Przez pierwsze 48 godzin opieki pooperacyjnej należy podawać niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) karprofen we wstrzyknięciu podskórnym (5 mg/kg). Odczekaj co najmniej 1 tydzień na całkowite wyzdrowienie chirurgiczne przed wykonaniem zapisu woltamperometrycznego.
      1. Podczas opieki pooperacyjnej należy codziennie przepłukiwać cewniki doustne wodą. Podawaj pokarm nasycony wodą przez 2 dni, aby pomóc zwierzęciu w żuciu i jedzeniu. Zapewnij codzienne monitorowanie potencjalnych objawów stresu lub bólu (z powodu łagodnej infekcji lub odwodnienia) i w razie potrzeby zapewnij odpowiednie interwencje (w tym podawanie płynów, miejscowe podawanie środków antyseptycznych i/lub podawanie NLPZ karprofenu w dawce 5 mg/kg).

3) Zapisy woltamperometryczne w obudzonym, swobodnie poruszającym się szczurze

1. Obniżenie elektrody i nabycie zestawu treningowego DA.
   1. W dniu eksperymentu sprawdź drożność kaniuli ustnej, podając 200 μl wody i obserwując reakcje ustno-twarzowe (aby sprawdzić, czy szczur smakuje wodę).
   2. Przymocuj stopień głowy FSCV do szczura, wkładając elektrodę stymulującą (na scenie czołowej) do kaniuli bipolarnej elektrody stymulującej (na szczurze). W ten sposób stopień główny (zminiaturyzowany przetwornik prądu na napięcie) łączy się bezpośrednio z bipolarną elektrodą stymulującą.
   3. Wyjmij atrapę kaniuli z aparatu kaniulowego i nałóż dwie krople 50% roztworu heparyny do kaniuli. Następnie delikatnie włóż atrapę kaniuli (nieco dłuższą niż atrapa kaniuli, która została wcześniej usunięta), aby usunąć wszelkie skrzepy krwi lub blizny glejowe, które mogły wystąpić, co spowoduje pęknięcie elektrod z włókna węglowego, które zostaną następnie wprowadzone podczas eksperymentu. Wysuń kaniulę używaną do usuwania skrzepów 3-4 mm poniżej czaszki (co najmniej 2 mm powyżej miejsca nagrania).
   4. Włóż mikromanipulator z elektrodą do kaniuli prowadzącej i umieść pierścień omega w pozycji "zablokowanej".
   5. Podłącz przewód elektrody referencyjnej od stacji czołowej do odpowiedniego pinu. Następnie podłącz działający przewód elektrody z mikromanipulatora do odpowiedniego przewodu na scenie czołowej.
   6. Opuść elektrodę do około 4-4,5 mm poniżej czaszki.
   7. Użyj potencjostatu, aby zastosować trójkątny przebieg (400 V/s, -0,4 do +1,3 V). Przykładaj przebieg do elektrody przy 60 Hz przez co najmniej 10 minut, a następnie zmień częstotliwość aplikacji kształtu fali na 10 Hz dla kolejnych nagrań eksperymentalnych.
      Uwaga: Krok aplikacji fali 60 Hz zapewnia stabilną powierzchnię włókna węglowego i pomaga zapobiegać dryfowi elektrycznemu
   8. Zastosuj stymulację elektryczną do VTA za pomocą różnych częstotliwości (od 10 do 60 Hz), impulsów (od 10 do 30 impulsów) i prądów (od 50 do 150 μA), a wszystko to o szerokości impulsu 2 ms/fazę, aby wywołać różne stężenia uwalniania DA i zmiany pH. Uzyskaj co najmniej 5 różnych stężeń uwalniania DA i 5 różnych zmian pH. Odczekaj (minimum 2 - 3 minuty) między stymulacjami, aby umożliwić ponowne ładowanie pęcherzyków[14].
      Uwaga: Ważne jest, aby uzyskać stymulacje, które wytwarzają stężenia DA w całym zakresie, które zostaną zebrane podczas kolejnego eksperymentu, ponieważ zostaną one wykorzystane jako zestaw treningowy do analizy głównych składowych (patrz punkt 5.1).
   9. Opuść elektrodę do rdzenia NAc (6.3 mm brzusznie do opony twardej). Następnie obniż elektrodę w krokach co 100 μm w rdzeniu NAc, aż do zaobserwowania przejściowych zdarzeń uwalniania DA z częstotliwościami co najmniej 1 na minutę.
   10. Podłącz rurkę (średnica wewnętrzna 1/32", średnica zewnętrzna 3/32") do strzykawki o pojemności 20 ml, podłączonej do pompy strzykawkowej. Na drugim końcu rurki użyj skośnej igły 23 G, aby połączyć rurkę z kaniulą szczura. Upewnij się, że rurka jest całkowicie wypełniona żądanym smakiem i sprawdź, czy w wężyku nie ma pęcherzyków.
       Uwaga: Zazwyczaj należy podać niewielką ilość degustatu do pyska szczura przed zapisem, aby upewnić się, że pierwsza infuzja do nagrywania dostarczy pełną ilość naparu, a nie resztki wody lub powietrza w przewodach. Co więcej, pozwala to zwierzęciu mieć pewne wcześniejsze doświadczenia z degustacją, ponieważ nowe degustacje, nawet te apetytywne, mogą początkowo być awersyjne ze względu na swoją nowość.
   11. W celu zebrania danych należy zainparować 200 μl degustatora (6,5 sekundy za pomocą pompki i wcześniej opisanego drenu). Zaparzaj degustator co 1-3 minuty. Zaparz w sumie 25 razy na degustację. Każdy wlew dostarcza 200 μl roztworu.
   12. Jeśli w jednym eksperymencie podawanych jest wiele degustatorów, po zebraniu danych dla jednego degustatora przepłukać cewnik doustny wodą i odczekać co najmniej 20 minut przed zainfuzją nowego degustatora.
   13. Po sesji nagrania DA należy przygotować się do weryfikacji histologicznej, tworząc niewielką zmianę w miejscu zapisu. Aby zachować elektrodę z włókna węglowego do późniejszej kalibracji, najpierw wsuń elektrodę i wyjmij mikromanipulator. Następnie użyj nowego mikromanipulatora ze szklaną mikroelektrodą i drutem wolframowym (wystającym 100 μm poza szklaną końcówkę) na tę samą głębokość (poniżej opony twardej) co oryginalna mikroelektroda z włókna węglowego.
   14. W celu weryfikacji histologicznej należy utworzyć niewielką zmianę, przykładając 3 V do drutu wolframowego i zwiększając napięcie w krokach co 1 V, co 10 sekund, aż do osiągnięcia ustawienia 10 V.
   15. Jeżeli standardowa krzywa stężenia została już utworzona przy użyciu wielu elektrod z włókna węglowego, należy wykonać powyższy etap zmiany (3.1.14), przykładając potencjał bezpośrednio do elektrody z włókna węglowego.
       Uwaga: Ta metoda uszkodzenia uszkodzi włókno węglowe i uniemożliwi późniejszą kalibrację za pomocą tej konkretnej elektrody.
   16. Poddać zwierzę eutanazji za pomocą śmiertelnego zastrzyku pentobarbitalu (150 mg/kg, i.p.).
   17. Usuń nasadkę z kaniulami za pomocą szczypiec, pociągając bezpośrednio do góry na nasadce. Nie przekręcaj nasadki głowicy, ponieważ spowoduje to niepotrzebne uszkodzenie mózgu i utrudni określenie położenia elektrody podczas histologii.
       1. Usuń mózg i umieść w 4% formalinie na 3 dni, a następnie 30% sacharozy na 1 tydzień. Za pomocą kriostatu należy utworzyć plastry o grubości 30 μm, zamontować na szkiełkach nakrywkowych i zbadać je pod mikroskopem świetlnym, aby określić położenie uszkodzenia włókna węglowego lub wolframu.
          Uwaga: Perfuzja jest opcjonalna dla 3.1.17.

4) Kalibracja elektrody

1. Wykorzystanie komory przepływowej do utworzenia współczynnika konwersji prąd-stężenie.
   1. Aby określić czułość elektrody, należy skalibrować elektrody po każdym eksperymencie za pomocą przepływowego aparatu "t-cell". Zanurz elektrodę do "ogniwa t", podczas gdy bufor Tris, roztwory pH lub roztwory DA są przemywane po powierzchni elektrody (z szybkością 2 ml/min). Użyj sześciopozycyjnego siłownika elektromagnetycznego powietrza, aby przełączać się między buforem a roztworem pH lub DA.
   2. Dla każdej kalibracji należy zebrać dane woltamperometryczne podczas 5-sekundowego nakładania buforu Tris (linia podstawowa), a następnie 5-sekundowego nakładania roztworu pH lub DA, a następnie 20-sekundowego nakładania buforu Tris (łącznie 30-sekundowy plik). Powtórz każdy przebieg 3 razy dla każdego stężenia wzorca kalibracyjnego, równoważąc różne stężenia każdego wzorca.
   3. Dla każdego pobrania próbki należy zmierzyć szczytowe DA lub prąd wywołany pH. Uśrednij prąd szczytowy w każdej próbie, aby uzyskać zależność stężenia od prądu szczytowego. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje, patrz [12] i [13].

5) Analiza danych

1. Korzystanie ze zbioru treningowego w analizie głównych składowych (PCA)
   Uwaga: Podczas eksperymentu woltamperometrycznego moc wyjściowa jest wytwarzana jako prąd, który jest wynikiem utleniania i redukcji dopaminy, zmian pH i szumu elektrochemicznego. PCA umożliwia rozdzielenie tych czynników, dzięki czemu można wyizolować pożądane składniki (DA i pH) i usunąć dodatkowe składniki, które mogą zniekształcić pożądane sygnały (bardziej szczegółowy opis znajduje się w ^{15, 16}).
   1. Przypisać współczynnik kalibracyjny do prądu wyjściowego (około 5-10 nA/μM) po PCA, aby umożliwić określenie wartości stężenia analitów.
   2. Użyj zestawu treningowego uzyskanego podczas eksperymentu, aby "wytrenować" model PCA w celu oddzielenia DA, pH i innych czynników. PCA wykorzystuje zestaw treningowy cyklicznych woltamnogram (zebranych w sekcji 3.1.8) i określa, które zasadnicze cechy woltammogramy można wykorzystać do identyfikacji każdego analitu pobranego podczas zapisów woltamperometrii in vivo.
   3. Aby określić liczbę głównych składników, które należy zachować, użyj testu F Malinowskiego. Zazwyczaj należy zachować tylko 2 lub 3 główne składniki, które zwykle wyjaśniają około 95-99% wariancji w danych. Więcej informacji na temat implementacji testu F Malinowskiego można znaleźć w¹⁷.
      Uwaga: Po określeniu liczby składników, analiza PCA skutecznie rzutuje zmierzone woltammogramy z zestawów treningowych DA i pH na główne składniki, które zostały zachowane. Wynikiem jest zestaw danych, który został przefiltrowany w taki sposób, że pozostały tylko dane DA (lub pH), a dane resztkowe, które nie przypominają DA lub pH, są usuwane (patrz Reprezentatywne wyniki, aby uzyskać oczekiwane wyniki). Aby uzyskać bardziej szczegółowe wyjaśnienie i instrukcję krok po kroku dotyczącą korzystania z PCA do analizy woltamperometrycznej, patrz Karta materiałów i^{16, 17}.

Wyniki

FSCV w połączeniu z implantacją cewnika wewnątrzustnego zostało użyte do zbadania, jak sacharoza, smacznik apetytywny, moduluje fazowe uwalnianie DA w rdzeniu NAc. Przed infuzją degustacyjną stymulacja elektryczna (150 μA, 60 Hz, 24 impulsy; oznaczona czerwonym paskiem) VTA powoduje znaczny wzrost fazowego uwalniania DA w NAc (ryc. 1). Rysunek 1 przedstawia kolorowy wykres z potencjałem na osi y, czasem na osi x i prądem (reprezentowanym jako fałszywy kolor) na osi z. Poniżej kolorowego ...

Dyskusja

Wewnątrzustne podawanie degustacji w połączeniu z FSCV pozwala na analizę reakcji DA "w czasie rzeczywistym" na doustne środki aromatyzujące. W protokole znajdują się trzy krytyczne kroki, które są wymagane do pomyślnych pomiarów DA. Po pierwsze, prawidłowa implantacja cewnika doustnego ma kluczowe znaczenie dla dostarczania środków aromatycznych. Upewnienie się, że cewnik jest wprowadzony za pierwszym zębem trzonowym i zaklinowany na miejscu, zapobiega utracie drożności cewnika i zapobiega przypadkowemu usunięciu przez ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elektroda stymulująca	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	przy zamówieniu poproś o 22 mm cięcie poniżej cokołu
Kaniula do elektrody	BioAnalytical Systems	MD-2251
Szklane systemy kapilarne	A-M	624503
włókno węglowe	Thornel	T650
Ściągacz elektrod	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus iizolator	Digitimer Ltd.	DS4
Termokurczliwy	3M	FP-301
Izolowane druty do elektrod	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois w Chicago, Engineering Machine Shop
Epoksyd	ITW Devcon	14250	"5 minut epoksyd"
Kopolimer kwasu perfluoro-3,6-dioksa-4-metylo-7oktenosulfonowego i tetrafluoroetylenu	Moc jonowa	LQ-1105	i.e. Farba Nafion
Silver	GC Electronics	22-023
Zasilacz	BK Precision	9110
Rurki do cewniki wewnątrzustne	Intramedic	427426	PE 100, ID = 0,86 mm; OD = 1,52 mm
Rurka do infuzji wewnątrzustnej	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Pompa strzykawkowa do komory przepływowej	Pump Systems Inc.	NE 1000
Cement chirurgiczny	Dentsply Caulk	675571 i 675572
Siłownik pneumatyczny	VICI	A60	6-pozycyjny cyfrowy interfejs zaworu
Cyfrowy interfejs zaworu	VICI	DVI	230 VAC
Poczwórny stopień główny	Univ. of N. Carolina, Zakład
Zasilacz UEI	Univ. of N. Carolina, Elektronika Skrzynka
UEI	Univ. of N. Carolina, Zakład Elektroniki Zasilanie
do degustacyjnej pompy strzykawkowej	Med Associates	SG-504
Tastant pompa strzykawkowa	Med Associates	PHM-107
Mikroelektroda wolframowa	MicroProbes	WE30030.5A3
Srebrny przewód odniesienia z AgCl	InVivo Metryczne	E255A Sacharoza
	Sigma	80497
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
Chlroide sodu	Sigma	S7653
Kwas nadchlorowy	Sigma	244252
Kwas solny (4 M)	Sigma	54435
Wodorotlenek soidum	Sigma	306576
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009
Chlorowodorek dopaminy	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Musisz poprosić o oprogramowanie: kliknij tutaj, aby uzyskać link do strony z żądaniem oprogramowania