Precyzyjne pomiary izotopowe stosowane do narządów myszy

Podsumowanie

Prezentujemy technikę pomiaru z dużą precyzją proporcji izotopów w narządach myszy.

Streszczenie

Przedstawiamy procedurę do precyzyjnego pomiaru proporcji izotopów w narządach myszy. składa się z 5 stabilnych izotopów (⁶⁴Zn, ⁶⁶Zn, ⁶⁷Zn, ⁶⁸Zn i ⁷⁰Zn), które są naturalnie frakcjonowane między narządami myszy. Najpierw pokazujemy, jak rozpuścić różne narządy, aby uwolnić atomy Zn; ten etap jest realizowany przez mieszaninę HNO₃ i H₂O₂. Następnie oczyszczamy atomy ze wszystkich innych pierwiastków, w szczególności z zakłóceń izobarycznych (np. Ni), za pomocą chromatografii anionowymiennej w rozcieńczonym środowisku HBr/HNO₃. Te pierwsze dwa etapy są wykonywane w czystym laboratorium przy użyciu chemikaliów o wysokiej czystości. Na koniec, proporcje izotopów są mierzone za pomocą spektrometru mas z wieloma kolektorami sprzężonymi indukcyjnie plazmą, w niskiej rozdzielczości. Próbki są wstrzykiwane za pomocą komory rozpylania, a frakcjonowanie izotopowe indukowane przez spektrometr mas jest korygowane poprzez porównanie stosunku próbek do stosunku wzorca (standardowa technika braketingu). Ta pełna typowa procedura daje stosunek izotopów o odtwarzalności 50 ppm (2 s.d.).

Wprowadzenie

Pomiar składu stabilnego izotopu o wysokiej precyzji (lepiej niż 100 ppm/jednostkę masy atomowej) jest możliwy dopiero od około 15 lat dzięki rozwojowi spektrometrów masowych z wieloma kolektorami plazmy i od tego czasu jest głównie stosowany w naukach o Ziemi i planetach. Zastosowania w medycynie są nowatorskie i mają duży potencjał jako biomarkery chorób, które modyfikują metabolizm (np. choroba Alzheimera). W artykule przedstawiono metodę pomiaru z dużą precyzją naturalnych stabilnych proporcji izotopów w różnych narządach myszy. To samo miałoby zastosowanie do próbek pobranych przez ludzi. Metoda polega na rozpuszczeniu narządów, chemicznym oczyszczeniu z pozostałych atomów, a następnie analizie stosunku izotopów na spektrometrze masowym.

Jakość pomiarów izotopowych Zn zależy od jakości chemicznego oczyszczania (czystość Zn, niska ślepa próba w porównaniu do ilości Zn obecnej w próbce, wysoka wydajność chemiczna procedury) oraz od kontroli błędu instrumentalnego. Wysoka czystość końcowej frakcji Zn jest potrzebna do usunięcia zarówno zakłóceń izobarycznych, jak i nieizobarycznych, które tworzą efekt matrycy. Nuklidy izobaryczne wytwarzają bezpośrednie zakłócenia (np. ⁶⁴Ni). Interferencje nieizobaryczne generują tzw. efekt "matrycy" i zmieniają precyzję analityczną pomiarów poprzez zmianę warunków jonizacji w stosunku do wzorca czystego, do którego porównuje się próbki do¹. Niska ślepa próba (< 10 ng) wskazuje, że nie ma zanieczyszczenia próbek zewnętrznym Zn, który mógłby zniekształcić mierzony skład izotopowy. Ponieważ izotopy Zn mogą być frakcjonowane podczas chromatografii jonowymiennej², zebranie wszystkich atomów Zn zapewnia, że nie zachodzi frakcjonowanie izotopowe, co oznacza, że procedura chemiczna powinna mieć pełną wydajność. Wreszcie, korekta instrumentalnego frakcjonowania izotopowego podczas pomiaru spektrometrii mas odbywa się za pomocą metody "standardowego bracketingu".

Dlatego główne trudności w uzyskaniu precyzyjnych pomiarów to kontrolowanie zewnętrznego zanieczyszczenia (np. niska ślepa próba), wytwarzanie pełnego oczyszczania chemicznego, które jest czyste od jakichkolwiek innych atomów lub cząsteczek, oraz korygowanie instrumentalnego frakcjonowania izotopowego na spektrometrze masowym. W tym artykule opiszemy nasz protokół analityczny do oddzielenia Zn od narządów myszy, a także pomiary spektrometrii mas

.

Ekstrakcja odbywa się przy użyciu małej ilości rozcieńczonych kwasów (pożywki HBr/HNO₃) na mikrokolumnach (0,5 μl i 0,1 μl) żywicy anionowymiennej. Charakteryzuje się pełną wydajnością, a pomiary mają odtwarzalność zewnętrzną lepszą niż 50 ppm przy stosunku ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn. Kolejną zaletą metody jest to, że jest bardzo szybka. Metoda jest więc bardzo dobrze przystosowana do nauk medycznych, w których trzeba analizować dużą liczbę próbek w porównaniu z naukami o Ziemi, gdzie te metody analityczne zostały opracowane.

Protokół

UWAGA: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) na Université Paris Diderot.

1. Przygotowanie materiałów

1. Przegotować 1 l kwasów (HNO₃, HBr) w celu oczyszczenia ich z zanieczyszczeń.
2. Zlewki i łącznik końcówki należy czyścić w gorącej (~ 100 °C) stężonej kąpieli kwasowej_HNO3 przez co najmniej dwa dni.
3. Myj końcówki pipet w zimnej kąpieli 3 N HNO₃ przez kilka dni i spłucz pojedynczo trzy razy wodą dejonizowaną.

2. Przygotowanie próbki

1. Znieczulij myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Oceń znieczulenie metodą szczypania palców u stóp.
2. Pobrać krew przez nakłucie serca w obecności heparyny w probówkach o pojemności 1,5 ml.
3. Oddzielić osocze od komórek krwi przez odwirowanie (10 min, 1 500 x g) i przenieść osocze do polipropylenowych fiolek kriogenicznych za pomocą polipropylenowych końcówek.
4. Usuń pozostałą krew z narządów, przecinając żyłę wątrobową i wstrzykując DPBS przez serce. Oceń śmierć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
5. Zbierz narządy za pomocą sterylnych narzędzi ze stali nierdzewnej, uwolnij je od otaczającego tłuszczu, jeśli taki istnieje, i zamroź je w polipropylenowych fiolkach kriogenicznych.

3. Oczyszczanie chemiczne

1. Najpierw rozpuścić próbki w mieszaninie ~ 1 ml stężonego (30%)_H2O2i ~ 1 ml stężonego (~ 15 M) HNO₃. Wykonaj wszystkie te czynności wewnątrz dygestorium.
   1. Umieść cały interesujący nas narząd w zlewce teflonowej o pojemności 15 ml. Następnie dodać_H2O2/HNO₃ do zlewki⁵. Pozostawić zlewkę otwartą przez kilka minut, aby uniknąć rozprysków spowodowanych reakcją utleniania materii organicznej i uwalniania CO₂ .
   2. Na koniec umieścić zlewkę na płycie grzewczej o temperaturze około 100 °C na kilka godzin lub do momentu, gdy roztwór będzie idealnie klarowny.
2. Otworzyć zlewkę i osuszyć roztwór na płycie grzejnej w temperaturze około 100 °C.
3. Gdy próbka wyschnie, dodać do próbek 1 ml 1,5 N HBr; zamknąć zlewkę i pozostawić ją do rozpuszczenia na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C przez kilka godzin.
4. W międzyczasie przygotuj kolumny o pojemności 500 μl.
   1. Dodaj 500 μl żywicy siatkowej AG1X8 200-400 do kolumny i umieść ją na stojaku kolumny, a pod nią znajduje się zlewka na śmieci. Żywicę przemyć na przemian: 5 ml wody o mocy 18,2 MΩ ⋅ cm, 5 ml 0,5 N HNO₃, 5 ml wody, 5 ml 0,5 N HNO₃, a następnie 5 ml wody. Kondycjonować żywicę w 5 ml 1,5 N HBr.
5. Wyjmij zlewki z płyty grzejnej i umieść je w kąpieli ultradźwiękowej na około 30 minut, a następnie pozwól zlewkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
6. Po schłodzeniu zlewki i umyciu żywicy otwórz zlewkę. Umieścić łącznik końcówki w strzykawce, dodać końcówkę do pipety; Odpipetować 1 ml próbki i naładować ją na żywicę (bardzo powoli, aby nie mieszać żywicy).
7. Gdy cała ciecz przejdzie przez kolumnę, dodać 5 ml 1,5 N HBr.
8. Po przepuszczeniu 5 ml 1,5 N HBr przez kolumnę, zastąpić zlewkę na śmieci czystą zlewką o pojemności 15 ml.
9. Dodawać jednorazowo 5 ml 0,5 N HNO₃ po 2,5 ml. Na tym etapie Zn jest eluowany z żywicy.
10. Gdy 5 ml HNO₃ przejdzie przez kolumnę, wyjąć zlewkę i umieścić ją na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C do wyschnięcia.
11. Wyjmij kolumnę z uchwytu kolumny; wyrzuć żywicę (użyj nowej żywicy do każdej próbki).
12. Po wyschnięciu próbki powtórzyć protokół z tą samą objętością kwasów w mniejszej kolumnie (100 μl), a następnie umieścić ją na gorącej płycie do momentu wysuszenia. Próbka jest teraz gotowa do spektrometrii mas.

4. Pomiar spektrometrii mas

1. Analiza składu izotopowego Zn na spektrometrze mas z wieloma kolektorami sprzężonymi indukcyjnie (MC-ICP-MS).
   1. Należy użyć parametrów maszyny podsumowanych w tabeli 1.
2. Ustawić kubki Faradaya tak, aby zbierały o masie (m/z) ⁶²Ni, ⁶³Cu, ⁶⁴Zn, ⁶⁵Cu, ⁶⁶Zn, ⁶⁷Zn i ⁶⁸Zn.
3. Przygotować roztwór zawierający 500 ppb Zn w 0,1 M HNO₃ do analizy izotopowej.
4. Przeanalizować roztwór Zn o stężeniu 500 ppb, używając komory rozpylania połączonej z nebulizatorem teflonowym o stężeniu 100 μl/min. Dla każdej próbki należy zmierzyć 30 skanów (1 blok po 30 cykli), w których czas integracji każdego skanu wynosi 8,389 sek.
5. Skorygować tło, odejmując natężenia zera w szczycie od roztworu próby ślepej (0,1 M roztworu HNO₃ użytego do ponownego rozpuszczenia próbek).
6. Kontrolować i korygować możliwe zakłócenia izobaryczne ⁶⁴Ni poprzez pomiar intensywności piku ⁶²Ni. Załóżmy, że stosunek ⁶⁴Ni/⁶²Ni jest naturalny (0,2548), skoryguj tę wartość z instrumentalnego odchylenia masy, a następnie usuń ⁶⁴Ni z masy 64 jako:
   ^{Rozdział 64}Zn_real= ⁶⁴Zn_zmierzone - ⁶⁴Ni = ⁶⁴Zn_zmierzone - (⁶⁴Ni/⁶²Ni)_naturalne x ⁶²Ni_zmierzone.
7. Skorygować instrumentalne odchylenie masy, biorąc w nawias każdą z próbek roztworem wzorcowym 500 ppb standardu JMC Lyon Zn (lub innego dostępnego wzorca, takiego jak IRMM-3702). Przeprowadzić bracketing wzorcowy, dzieląc stosunek ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn próbki przez średnią stosunku ⁶⁶Zn/⁶⁴Zn dwóch wzorców zmierzonych przed i po próbce minus 1 i pomnożonych przez 1 000 (patrz równanie 1). Typowa precyzja zewnętrzna w standardzie JMC Lyon Zn wynosi 0,05 permil/amu (2 odchylenia standardowe, 2 s.d.).

Wyniki

W 1,5 N HBr główny gatunek cynku (ZnBr3-) tworzy bardzo silne kompleksy z żywicą anionowymienną, podczas gdy większość pozostałych pierwiastków nie oddziałuje z żywicą. Cynk jest następnie odzyskiwany poprzez zmianę medium na rozcieńczony HNO₃, co zmienia specjację Zn na Zn²⁺, który zostaje uwolniony z żywicy^6,7.

Stosunki izotopowe są zazwyczaj wyrażane jako odchylenia na 1 000 części względem standardu:

Dyskusja

Powtarzalność pomiarów jest oceniana poprzez powtórzone analizy tych samych próbek przeprowadzone podczas różnych sesji analitycznych. Na przykład⁶, odtworzyliśmy tę samą skałę ziemską 7 razy i uzyskaliśmy wyniki przedstawione w Tabeli 2.

Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z teorii frakcjonowania izotopowego¹⁰ i zmierzonymi w dowolnym materiale Układu Słonecznego (np. meteoryt^11-13, rośliny^3-5, osady głębinowe¹⁴...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wielokolekcyjny spektrometr mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie	Thermo-Fisher
Żywica anionowymienna AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Zlewki teflonowe	Savillex	200-015-12
Własne kolumny teflonowe z teflonu

termokurczliwego